大理牛街熱泉來(lái)源嗜熱纖維素酶基因的克隆、異源表達(dá)及其酶學(xué)性質(zhì)研究

饒孟迪， 李文孟， 李 蕾， 普孝英， 阿周存， 尹以瑞

（大理大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南 大理 671003）

纖維素酶是一類糖苷水解酶， 用于降解纖維素生成單糖或低聚糖，在生物乙醇、造紙、紡織、動(dòng)物飼料、制藥、服裝等行業(yè)（鄧立康等，2022；陳燕勤等，2004）利用纖維素酶分解植物纖維素（陳偉釗，2018），是一種儲(chǔ)量較大的綠色可再生資源。在自然界中，許多生物都能產(chǎn)生纖維素酶，其中微生物來(lái)源的纖維素酶運(yùn)用最為廣泛 （何芳芳等，2020）。 在實(shí)際生產(chǎn)中，纖維素的降解大多在高溫環(huán)境下進(jìn)行， 因此對(duì)纖維素酶的熱穩(wěn)定性要求較高。因此，挖掘新的嗜熱纖維素酶成為纖維素開發(fā)利用的研究熱點(diǎn)。 胡惠仁等（2020）以真菌里氏木霉來(lái)源的纖維素酶做發(fā)酵所用的酶， 以紙漿為發(fā)酵碳源，通過(guò)深層液體發(fā)酵的方式，來(lái)降低打漿能耗，在造紙行業(yè)起到了促進(jìn)作用。

然而，由于真菌來(lái)源的酶熱穩(wěn)定性較差，溫度超過(guò)55 ℃時(shí)迅速失活，限制了其應(yīng)用范圍（Tenkanen 等，1992）。 嗜熱纖維素酶因能在高溫下長(zhǎng)時(shí)間保持較高活性而備受關(guān)注， 如Aspergillus sp.DLCS-F18 所產(chǎn)纖維素酶最適溫度為65 ℃，在70 ℃半衰期為80 min， 這預(yù)示著該酶可能在木質(zhì)纖維素水解和動(dòng)物飼料生產(chǎn)中發(fā)揮潛在利用價(jià)值（尹以瑞等，2021）， 熱泉和地?zé)岘h(huán)境作為典型的高溫環(huán)境，則是許多嗜熱酶的重要來(lái)源。

本研究以云南大理牛街溫泉底泥為材料，進(jìn)行宏基因組測(cè)序后，獲得一個(gè)新的纖維素酶基因，命名為njcel6 ，對(duì)其進(jìn)行克隆、異源表達(dá)和酶學(xué)性質(zhì)研究，為其在食品、飼料和纖維素乙醇發(fā)酵等方面的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 熱泉底泥樣品采自云南省大理白族自治州洱源縣牛街溫泉（99°2'57"E，26°3'36"N）。熱泉水表面溫度為52 ℃左右，pH 為7.4，樣品被快速冷凍于液氮罐，用于實(shí)驗(yàn)室宏基因組DNA 提取。表達(dá)載體使用pET-28a （+），E.coli DH5α 和E.coli BL21 分別用于功能基因的克隆和表達(dá)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總DNA 提取和宏基因組測(cè)序 通過(guò)power soil Kit （MOBIO DNeasy PowerSoil Kit，USA）提取熱泉樣品總DNA， 送至杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司， 采用HiSeq 2500 高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行宏基因組測(cè)序，基于功能預(yù)測(cè)，從宏基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中分離出纖維素酶基因序列njcel6。 將該纖維素酶基因核苷酸序列提交到GenBank， 登錄號(hào)為OP880883。

1.2.2 序列分析 使用BLASTx 和BLASTp（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi） 分別對(duì)njcel6 的DNA 和氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)， 并通過(guò)SignalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/） 預(yù)測(cè)信號(hào)肽，利用EXPASY 工具（http：//web.expasy.org/protparam/）推導(dǎo)和分析氨基酸序列的一級(jí)結(jié)構(gòu)，通過(guò)Clustal X（Thompson 等，1997）與密切相關(guān)的蛋白序列進(jìn)行多次比對(duì)（從NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索）。 使用MEGA 7 軟件包（Kumar 等，2016），采用最大似然（ML）方法和泊松校正模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 纖維素酶基因的克隆和異源表達(dá) 對(duì)njcel6 基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化后，再進(jìn)行基因合成，并克隆到pET28a（+）載體上，將驗(yàn)證成功的重組載體pET28a-njcel6 導(dǎo)入E.coli BL21（DE3）中進(jìn)行纖維素酶（njcel6）的異源表達(dá)。 然后，將該菌株接種于含有50 μg/mL 卡那霉素的新鮮LB 液體培養(yǎng)基（pH 7.0）中，37 ℃、220 r/min 搖床中過(guò)夜培養(yǎng)，作為種子液。 以1%接種量，將種子液接種于含50 μg/mL 卡那霉素的200 mL LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)2 ～3 h 至OD600≈0.7，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度為0.1 mmol，再轉(zhuǎn)入30 ℃、180 r/min 培養(yǎng)過(guò)夜。

1.2.4 粗酶液的提取及酶活測(cè)定 在4 ℃下8000×g 離心10 min，收獲菌體，將菌體重懸于含有50 mL PBS 緩沖液（pH 7.4）中，進(jìn)行超聲破碎（150 W；20 min） 后， 再次4 ℃下10000×g 離心20 min，取上清作為粗酶液用于酶學(xué)性質(zhì)研究。取20 μL 粗酶液加入到80 μL 含有1%羧甲基纖維素鈉（CMC）的緩沖液中，在最適條件下反應(yīng)30 min，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)3，5-二硝基水楊酸（DNS）法確定還原糖的量（Miller，1959）。最后，取150 μL樣品置于96 孔板中， 使用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)540 nm處進(jìn)行吸光值的測(cè)定， 所有酶學(xué)測(cè)定均設(shè)3 個(gè)試驗(yàn)組，1 個(gè)對(duì)照組。

1.2.5 不同溫度和pH 對(duì)纖維素酶活性的影響在不同溫度下（25、30、35、40、45、50、55、60、65、70 ℃）將50 μL 粗酶液與250 μL CMC（pH 7）進(jìn)行30 min 孵育，加入450 μL（DNS）終止反應(yīng)，沸水浴10 min 冷卻后，使用酶標(biāo)儀在540 nm 檢測(cè)酶活（Miller，1959）。在最適反應(yīng)溫度下使用pH 3 ～10 的緩沖液（pH 3 ～8 為磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，8 ～10 為甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液） 檢測(cè)不同pH 對(duì)粗酶液中纖維素酶活性的影響。

1.2.6 不同pH 和溫度對(duì)粗酶穩(wěn)定性的影響 將100 μL 粗酶液加入200 μL 緩沖液（pH 3、4、5、6、7、8、9 和10）中，于4 ℃下分別孵育12 h 和24 h后，在標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定其殘留活性。以相同體積蒸餾水稀釋的粗酶液為陽(yáng)性對(duì)照（100%），在3 個(gè)溫度（45、50、55 ℃）下培養(yǎng)不同的時(shí)間（0、30、60、90、120 min）后，測(cè)其殘余活性，以未處理（0 min）粗酶液為陽(yáng)性對(duì)照（100%）。

1.2.7 不同金屬離子和抑制劑對(duì)纖維素酶活力的影響為測(cè)定金屬離子和抑制劑對(duì)纖維素酶的影響，在標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)體系中分別加入11 種不同的金屬離子（K+、Mg2+、Fe3+、Ca2+、Ni2+、Co2+、Ba2+、Mn2+、Pb2+、Zn2+和Al3+）至終濃度為1 mmol 和10 mmol。不同抑制劑EDTA、SDS、PMSF 和DTT 至終濃度為0.1%和1%。 使用標(biāo)準(zhǔn)條件下，無(wú)添加劑的反應(yīng)混合物作為陽(yáng)性對(duì)照（100%）。

2 結(jié)果

2.1 序列分析 本研究從云南大理牛街溫泉底泥宏基因組數(shù)據(jù)中，預(yù)測(cè)到一個(gè)GH5 家族的纖維素酶基因（GenBanK 登錄號(hào)：OP880883），大小為1701 bp，命名為njcel6?；诎被嵝蛄性贜CBI Blastx 比對(duì)結(jié)果，njcel6 分別與Bryobacteraceae 菌株來(lái)源內(nèi)切纖維素酶GIU77643.1 和GIU75612.1表現(xiàn)出95.20% 和72.88%的相似性。如圖1 所示，利用NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中收集與njcel6 相似性較高的同源性序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，njcel6 與Bryobacterales 來(lái)源纖維素酶聚在一支， 因此，牛街熱泉宏基因組來(lái)源的njcel6 屬于Bryobacterales來(lái)源纖維素酶。

圖1 基于njcel6 氨基酸序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.2 SDS-PAGE 電泳分析 經(jīng)SDS-PAGE 電泳分析可得， 誘導(dǎo)后重組子E.coli BL21 （DE3）-pET28a-njcel6 在61 kDa 處有較為明顯的差異條帶，結(jié)果如圖2 所示，與理論預(yù)測(cè)的蛋白分子量基本一致，說(shuō)明其為重組的目的蛋白條帶。

圖2 SDS-PAGE 膠圖分析重組njcel6 纖維素酶

2.3 纖維素酶njcel6 的最適反應(yīng)溫度和pH 纖維素酶njcel6 粗酶液最適反應(yīng)溫度為50 ℃（圖3A），最適pH 為5.0（圖3B）。 纖維素酶njcel6 在溫度50 ～65 ℃表現(xiàn)出95%以上的相對(duì)活性，在pH 5.5 ～6.0 表現(xiàn)出超過(guò)80%的相對(duì)活性， 表明該纖維素酶njcel6 系嗜熱、耐酸纖維素酶。

圖3 溫度（A）和pH（B）對(duì)纖維素酶njcel6 活性的影響

2.4 纖維素酶njcel6 的穩(wěn)定性 如圖4A 所示，纖維素酶njcel6 粗酶液在45、50 ℃和55 ℃下進(jìn)行孵育2 h，整體相對(duì)酶活保持在80%以上。在45 ℃下孵育2 h，其活性被激活，具有120%左右的相對(duì)活性；在最適溫度50 ℃下孵育2 h，保持100%的相對(duì)活性；在55 ℃下孵育2 h，仍保持80%的相對(duì)活性。這說(shuō)明該酶具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性。此外，在最適反應(yīng)溫度下， 纖維素酶在pH 3 ～10 分別反應(yīng)12 h 和24 h， 整體相對(duì)酶活保持在75%以上，24 h 處理后仍有80%以上的活性， 表明該纖維素酶具有較強(qiáng)的耐酸堿能力（圖4B）。

圖4 溫度（A）和pH（B）對(duì)纖維素酶njcel6 穩(wěn)定性的影響

2.5 不同抑制劑和金屬離子對(duì)纖維素酶活力的影響 如圖5 所示， 纖維素酶njcel6 粗酶液在4種抑制劑EDTA、SDS、PSMF 和DTT 濃度分別為0.1%（圖5A）和1%（圖5B）濃度的表現(xiàn)，其中DTT和PSMF 在0.1%、1%兩種濃度下仍保留90%以上相對(duì)酶活；EDTA 保留了80%以上的相對(duì)酶活，而SDS 在兩種濃度下只保留20%左右的相對(duì)酶活，對(duì)酶活力的抑制作用最為明顯。 這說(shuō)明EDTA、PSMF、DTT 抑制劑對(duì)酶的抑制作用不大，但在使用njcel6 過(guò)程中要避免SDS 的存在。

圖5 不同抑制劑對(duì)纖維素酶活性影響

金屬離子濃度為1 mmol（圖6A）和10 mmol（圖6B） 時(shí)，K+、Mg2+、Fe3+、Ni2+和Co2+等11 種測(cè)試金屬離子對(duì)酶活力均無(wú)明顯的抑制作用。 在離子濃度為1 mmol 時(shí)，Co2+、Mn2+和Al3+對(duì)酶活起促進(jìn)作用， 相對(duì)活性在110%以上； 在離子濃度為10 mmol 時(shí)，Mg2+、Ca2+對(duì)酶活起到較為明顯的促進(jìn)作用，相對(duì)活性保持在140%以上。

圖6 不同金屬離子對(duì)纖維素酶活性影響

3 討論

纖維素是地球上存在較為廣泛的可再生資源，有效的利用纖維素資源，不僅可以減緩化石燃料造成的環(huán)境污染，還能緩解能源危機(jī)（馮雁等，2011）。目前通過(guò)微生物發(fā)酵可將各種生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為生物乙醇， 其可以單獨(dú)或與汽油混配制成乙醇汽油作為汽車燃料， 該工藝生產(chǎn)技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟，但生產(chǎn)成本較高，發(fā)展受到制約。 因?yàn)樵谏镆掖及l(fā)酵生產(chǎn)中起關(guān)鍵作用的是酶制劑價(jià)格，所以通過(guò)在高溫下增加酶的活性，減少酶的劑量，從而減少酶的成本已被認(rèn)為是一種可行的方法。 耐熱酶具有更高的穩(wěn)定性， 能減少水解所需酶的數(shù)量， 減少反應(yīng)時(shí)間（Karnaouri 等，2019；Yang 等，2018）。 與來(lái)自中溫菌的酶相比，耐熱酶可以提高反應(yīng)速率（Ajeje 等，2021），故可有效降低成本。

本研究中纖維素酶其反應(yīng)的最適溫度和最適pH 分別為50 ℃和5.0， 且在pH 4.5 ～7 有超出90%的相對(duì)活性，50 ℃孵育120 min， 仍保持100%相對(duì)活性。 巨大芽孢桿菌XT2 所產(chǎn)纖維素酶最適溫度和最適pH 分別為50 ℃和6.0，K+對(duì)纖維素酶具有激活作用，Mg2+、Ca2+和Mn2+對(duì)酶活具有抑制作用（趙龍妹等，2021）。貝萊斯茅孢桿菌XH-4 來(lái)源的纖維素酶，最適溫度和最適pH 分別為50 ℃和6.0， 金屬離子Ag+對(duì)纖維素酶活性促進(jìn)作用最強(qiáng)，Ca2+、Fe3+、K+對(duì)其活性有抑制作用（孫會(huì)剛等，2021）。根據(jù)以上研究可以得知，這些纖維素酶與本研究最適溫度和最適pH 相似， 但在穩(wěn)定性和耐金屬離子方面njcel6 具有更強(qiáng)的金屬離子耐受性和熱穩(wěn)定性。 這預(yù)示njcel6 纖維素酶在生物工程和食品行業(yè)有光明應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

本研究從大理牛街熱泉富集物中獲得一個(gè)重組耐熱的纖維素酶基因（njcel6），在大腸桿菌中成功進(jìn)行異源表達(dá)，njcel6 最適反應(yīng)溫度及pH 分別為50 ℃和5.0，55 ℃孵育2 h 仍保持80%以上相對(duì)活性，在pH 3 ～10 緩沖液中孵育24 h，仍能保持80%以上相對(duì)活性， 試驗(yàn)測(cè)試的11 種金屬離子， 對(duì)酶活力均無(wú)明顯的抑制作用， 抑制劑SDS存在明顯抑制作用。 說(shuō)明該纖維素酶是一種耐高溫耐酸環(huán)境耐金屬離子，pH 范圍廣泛的酶， 在飼料及食品加工生產(chǎn)中有很大的應(yīng)用潛力。 綜上所述，纖維素酶njcel6 可為后續(xù)纖維素酶在食品、飼料和纖維素乙醇等方面的運(yùn)用提供參考。