長期冷凍對ELISA 法檢測血漿標(biāo)本中HBsAg結(jié)果的影響

連斯敏 陳曉華 林樹波 郭自約 肖澤斌

（汕頭市中心血站，廣東 汕頭 515064）

隨著輸血事業(yè)的發(fā)展，嚴(yán)格做好血液檢測之外，科學(xué)儲(chǔ)存和追溯血液留樣標(biāo)本已成為采供血機(jī)構(gòu)工作中的重要一環(huán)[1]。為了處理可能因輸血引起的醫(yī)療糾紛，保障獻(xiàn)血者和受血者的權(quán)益，本站通過封閉的血袋導(dǎo)管保留了獻(xiàn)血者的血液標(biāo)本，在低溫冰箱冷凍保存，使臨床上的每1袋血都具有溯源性。驗(yàn)證長期低溫保存是否會(huì)影響血液標(biāo)本的病毒篩檢結(jié)果，對保證采供血機(jī)構(gòu)對血液標(biāo)本的保存質(zhì)量具有重要的意義[2]。本站檢驗(yàn)科通過ELISA法對無償獻(xiàn)血者的血液標(biāo)本進(jìn)行輸血相關(guān)傳染病4項(xiàng)檢測，其中HBsAg是主要不合格項(xiàng)目。我們以本站2014 年5 月—2015 年3 月間100 份已經(jīng)過HBsAg ELISA檢測結(jié)果為陽性的獻(xiàn)血者血漿標(biāo)本為研究對象，探討長時(shí)間的凍存對血漿標(biāo)本的再次檢測結(jié)果是否存在影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

本站2014 年5 月—2015 年3 月無償獻(xiàn)血者血液標(biāo)本，經(jīng)2遍不同廠家ELISA法HBsAg檢測結(jié)果均呈反應(yīng)性，選取雙試劑吸光度/臨界值（S/CO值）≥1的標(biāo)本100份，分裝置于-20°C冰箱凍存，將初次反應(yīng)雙孔S/CO 值作為統(tǒng)計(jì)資料并記錄在案。HBsAg陽性的判定標(biāo)準(zhǔn)：采用2種不同生產(chǎn)廠家的試劑盒對標(biāo)本進(jìn)行HBsAg篩查，單試劑或雙試劑反應(yīng)性標(biāo)本進(jìn)行雙孔復(fù)核檢測，復(fù)檢結(jié)果為單或雙試劑反應(yīng)性。其中對試劑判讀S/CO 值下限值20%（即0.8≤S/CO＜1，判讀為反應(yīng)性）設(shè)為灰區(qū)，灰區(qū)標(biāo)本作為反應(yīng)性標(biāo)本處理。

1.2 試劑與儀器

HBsAg ELISA 檢測試劑盒（索林公司，批號(hào)：D217110、D224610、D281510、D972210）；珠海麗珠公司，批號(hào)：2014010208、2014051108、2014081708、2014101908、2014112008）；廈門新創(chuàng)公司，批號(hào)：2022105133）；FAME 24/20、FAME 24/30 全自動(dòng)酶免分析儀（哈美頓公司）；BEPIII全自動(dòng)酶免分析儀（西門子公司）；URANUS AE268全自動(dòng)酶免儀后處理系統(tǒng)（深圳愛康公司）。

1.3 方法

100 份HBsAg 陽性凍存標(biāo)本使用索林、新創(chuàng)2個(gè)廠家的試劑重新檢測，2 個(gè)廠家試劑有至少1 種為反應(yīng)性即判為HBsAg 陽性，另對于S/CO≥0.8 的標(biāo)本判為反應(yīng)性。將本次檢測結(jié)果與凍存前結(jié)果做一致性分析，同時(shí)比較凍存前后經(jīng)索林試劑檢測的S/CO值變化。由于8年前條件所限，檢測結(jié)果的吸光度值最高為3，所以對于本次檢測結(jié)果為反應(yīng)性且吸光度≥3的標(biāo)本，記錄結(jié)果為3。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graphpad prism8.0 軟件制圖，SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)軟件作數(shù)據(jù)處理，檢測所得S/CO 值差異用中位數(shù)表示，采用非參數(shù)檢驗(yàn)的Wilcoxon 符號(hào)秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)表示，符合率指凍存后經(jīng)2 種試劑定性為陽性的標(biāo)本數(shù)占凍存前陽性標(biāo)本總數(shù)的比例，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 凍存血漿HBsAg ELISA結(jié)果

100份標(biāo)本中99份雙試劑檢測均為反應(yīng)性，判為HBsAg 陽性；1 份標(biāo)本索林試劑檢測為反應(yīng)性，新創(chuàng)試劑檢測為無反應(yīng)性，根據(jù)“有至少1 種試劑檢測結(jié)果為反應(yīng)性即判為陽性標(biāo)本”將該標(biāo)本判為HBsAg陽性，再檢符合率100%。

2.2 標(biāo)本凍存前后檢測不同S/CO 值區(qū)間標(biāo)本數(shù)比較

長期凍存會(huì)使HBsAg ELISA 檢測S/CO 值降低，見表1。

表1 100份標(biāo)本凍存前后不同試劑S/CO值結(jié)果Table 1 S/CO of 100 samples detected by different reagents before and after refrigeration

2.3 標(biāo)本凍存前后同廠家試劑檢測S/CO 值變化情況

100份標(biāo)本索林檢測，凍存前的S/CO值范圍是2.54～30.93，中位數(shù)為27.52。凍存后的S/CO 值范圍是0.93～23.26，中位數(shù)19.03，每份標(biāo)本凍存后的S/CO 均比凍存前的S/CO 值?。╖=-8.682，P＜0.05），2個(gè)S/CO值對應(yīng)關(guān)系見圖1，圖2。

圖1 100份標(biāo)本凍存前后檢測S/CO值分布散點(diǎn)圖Figure 1 Scatter plot of S/CO distribution of 100 samples before and after refrigeration

圖2 100份標(biāo)本凍存前后檢測S/CO值對應(yīng)關(guān)系Figure 2 Relation diagram between S/CO of 100 samples before and after refrigeration

3 討論

乙型肝炎是我國常見的1 種主要經(jīng)血液傳播的傳染性疾病，目前采供血機(jī)構(gòu)普遍使用ELISA法檢測人血清（或血漿）中乙肝表面抗原（HBsAg）的水平，是1種定性或半定量的檢測方法[3-5]。根據(jù)本研究的設(shè)計(jì)假設(shè)，若凍存血漿在8年前后定性檢測結(jié)果一致性低，在排除前后試劑原理不同的情況下，說明血漿凍存會(huì)對ELISA 檢測結(jié)果有影響，但若結(jié)果符合率高，則說明長時(shí)間的凍存對HBsAg定性檢測結(jié)果影響不大。從本研究結(jié)果分析，100份HBsAg陽性標(biāo)本經(jīng)8年凍存后，用雙試劑復(fù)檢結(jié)果均為陽性，凍存前后定性檢測結(jié)果一致性極佳，說明血漿經(jīng)長期凍存后，抗原特性沒有發(fā)生較大變化，對ELISA法HBsAg定性檢測結(jié)果影響不大。

本研究中有1 份標(biāo)本凍存后用新創(chuàng)試劑檢測結(jié)果為無反應(yīng)性，索林試劑檢測結(jié)果為反應(yīng)性，根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)該標(biāo)本判為陽性，說明采用雙試劑雙重檢測是必要的。嚴(yán)格的血液檢測是防止輸血后感染的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，采供血機(jī)構(gòu)采用2 次ELISA＋1 次NAT 核酸的檢測模式，有利于加強(qiáng)血液檢測的監(jiān)控，保證血液質(zhì)量和安全[6-7]。

一般來說，S/CO 值可當(dāng)作病毒性肝炎標(biāo)志物的半定量指標(biāo)，在一定程度上可以反映病毒標(biāo)志物的強(qiáng)弱[8-9]。從本研究結(jié)果看，同一試劑檢測每份標(biāo)本對應(yīng)的前后2 個(gè)S/CO 值均為下降趨勢。說明抗原量會(huì)受長時(shí)間凍存的影響，且對于凍存前HBsAg結(jié)果為弱S/CO 值的標(biāo)本，其在凍存后可能下降至結(jié)果為無反應(yīng)性。雖然前后都使用同一廠家同一試劑，但是仍然存在不同批次間試劑顯色反應(yīng)強(qiáng)度差異[10]。由于HBsAg 陽性標(biāo)本的收集是在近1 年期內(nèi)進(jìn)行的，Cut-off值因其計(jì)算方式受標(biāo)本所在批次的陰性對照吸光度值影響而波動(dòng)，將直接影響標(biāo)本S/CO值[11]。本研究選擇的獻(xiàn)血者標(biāo)本中高S/CO值標(biāo)本占較大比例，所得結(jié)果的S/CO 值多數(shù)居于分布散點(diǎn)圖上方且較為分散，而凍存后再檢方法的進(jìn)行是在同一批次的實(shí)驗(yàn)中，Cut-off 值固定，所以得到結(jié)果的S/CO值較為集中。

血液篩查中ELISA 法是1 種定性檢測方法，在“陽性”與“陰性”之間有1條明確的分界線，也就是所謂的臨界值（Cut-off值），Cut-off值的上移或下移均可導(dǎo)致假陽性或假陰性[12]。本研究中的1份標(biāo)本在凍存前后索林試劑檢測結(jié)果從S/CO=2.54 下降至S/CO=0.93（處在灰區(qū)），此類低S/CO值標(biāo)本在凍存后下降除了受長時(shí)間凍存影響，也可能與當(dāng)日當(dāng)批次標(biāo)本檢測過程中加樣量、孵育溫度、時(shí)間等多因素有關(guān)[13]，導(dǎo)致其在Cut-off值附近波動(dòng)。本試驗(yàn)在凍存標(biāo)本之初僅將100 份血漿標(biāo)本單管分裝凍存，經(jīng)過解凍進(jìn)行試驗(yàn)后，反復(fù)凍融可能會(huì)導(dǎo)致標(biāo)本的生物活性發(fā)生改變，使用此分裝標(biāo)本進(jìn)行復(fù)檢會(huì)影響結(jié)果的有效性，同時(shí)標(biāo)本剩余的血漿量不足以進(jìn)行HBsAg確證試驗(yàn)的中和試驗(yàn)和HBV DNA檢測[14]，無法對該標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測。

血液在經(jīng)過血站實(shí)驗(yàn)室檢測合格后輸送至臨床，其血液留樣通常采用以下2 種方式：一是以血袋上預(yù)留的血辮經(jīng)離心分離出血漿后熱合的方式；二是在加樣的同時(shí)，使用96 孔深孔微板完成標(biāo)本的留取，這2種血液留樣方式均可為追查獻(xiàn)血者血液標(biāo)本的結(jié)果提供可靠依據(jù)。按照2009年衛(wèi)生部下發(fā)關(guān)于《血站管理辦法》第三十一條規(guī)定，“血液標(biāo)本的保存期為全血或成分血使用后2年”。為保證標(biāo)本保存完整和有效，參考冰凍血漿的保存期為自血液采集之日起4 年，結(jié)合本研究結(jié)果，我們建議血液留樣至少可保留6年。這其中以-65°C以下保存的冰凍紅細(xì)胞時(shí)間最長，保存期為自血液采集之日起10 年，即在條件允許的情況下此血液留樣將最長應(yīng)存放12 年。而本研究僅對血漿凍存8 年后HBsAg 檢測結(jié)果進(jìn)行比較分析，對于留樣12 年的標(biāo)本的有效性需要進(jìn)一步在保存過程中回顧性評(píng)價(jià)。

綜上所述，采供血機(jī)構(gòu)應(yīng)結(jié)合實(shí)際工作情況，將血液留樣標(biāo)本以1種有效的方式儲(chǔ)存起來，確保血液留樣標(biāo)本能夠進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，以便維護(hù)采供血機(jī)構(gòu)、臨床及患者各自的權(quán)益，同時(shí)這也是采供血機(jī)構(gòu)質(zhì)量管理的重要內(nèi)容。