無錫地區(qū)HBsAg-/HBV DNA+獻血人群HBcrAg 檢出特點分析

王嫣 金建懷 許友山 郝慶欽 夏衛(wèi)

（無錫市中心血站，江蘇 無錫 214000）

新型血清標志物乙型肝炎核心相關抗原（hepatitis B core-related antigen，HBcrAg）由前C基因和C基因編碼的HBcAg、HBeAg、p22cr 3種蛋白組成，它們共同擁有1 段149 個氨基酸的序列，可被同1抗體檢測。松弛環(huán)狀DNA（rcDNA）感染肝細胞后，首先要被修復成共價閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）[1]。HBV cccDNA 是復制的原始模板，它的形成和持續(xù)存在是引起HBV 慢性感染和導致慢乙肝患者難以治愈及肝癌發(fā)生的關鍵因素，也是激活隱匿性HBV 感染（occult HBV infection,OBI）的主要原因[2]。臨床上肝活組織檢查可以準確反映肝組織內HBV cccDNA 的水平，但肝活檢是1 種有創(chuàng)檢查，且需要進行多次有創(chuàng)檢查，多數患者很難接受，故通過肝活組織檢查來監(jiān)測患者HBV cccDNA 水平還存在著較大的困難，目前迫切需要尋找1種操作方便且能反映肝組織內cccDNA水平的血清學替代指標。

HBcrAg 能夠反映肝組織cccDNA 的含量和轉錄活性，是近年來的研究熱點[3]。研究表明，在未治療及經NAs 治療后的慢乙肝患者中，無論HBeAg陽性或陰性患者，HBcrAg與cccDNA具有顯著相關性[4]。我國是乙型病毒性肝炎感染大國，慢性感染人數至少2.57 億人[5]，獻血者中潛在的HBsAg-/HBV DNA+感染者排除窗口期感染即為OBI。OBI作為HBV 持續(xù)性感染的特殊形式，成為威脅血液制品安全和受血者健康的隱患，隨著核酸技術與酶聯免疫吸附技術在血液篩查中互補開展應用逐漸被最大限度檢出。目前有關新型血清標志物HBcrAg 的研究多為慢性乙肝感染、肝硬化、肝癌患者等。本研究從血液安全角度出發(fā)，旨在分析血清中HBcrAg 在獻血人群篩檢HBsAg-/HBV DNA+感染者的表達情況，為探討其在OBI感染發(fā)病機制中的作用提供新的思路，從而改進血液HBV篩查方法，降低漏檢率，提高臨床用血安全。

1 對象與方法

1.1 研究對象

對無錫市中心血站2019—2020 年104 917 名無償獻血者進行2遍酶聯免疫吸附法及1遍實時熒光定量PCR 核酸初篩，選取了47 名HBsAg-/HBV DNA+獻血者進行電話追蹤，成功追蹤到37名至本站采集血液標本。37 份HBsAg-/HBV DNA+獻血者血液標本進行1 遍電化學發(fā)光法和PCR 核酸檢測篩查出22 名HBsAg-/HBV DNA+獻血者標本作為OBI組。選取20名經過2遍酶聯免疫吸附法及1遍PCR核酸檢測都合格的獻血者作為健康對照組，選取20名經無錫市第五人民醫(yī)院臨床診斷為慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者作為CHB組，其中男15名，女5名；年齡25～51歲，所有病例6個月內未使用抗病毒制劑；診斷標準參照《乙型病毒性肝炎診斷標準》(WS299-2008)以及《慢性乙型肝炎防治指南》(2015更新版)[6]。

1.2 試劑與儀器

HBsAg ELISA 檢測試劑（英科新創(chuàng)公司，批號：B20201139;上?？迫A公司，批號：202009231），Cobas TaqScreen MPX test HBV 核酸檢測試劑(羅氏診斷公司，批號：G11355)。乙肝兩對半：乙型肝炎病毒抗原抗體檢測系統（HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc）檢測試劑盒（化學發(fā)光法）（上海博陽生物科技有限公司，批號：A2001)；HBcrAg 檢測試劑（廈門侖昌碩公司，批號：202102210033）。LICA500 自動化學發(fā)光檢測儀（上海博陽公司），Hamilton STAR全自動加樣儀、Microlab FAME 全自動酶聯免疫分析系統（Hamilton 公司），Cobas S201 全自動核酸檢測系統（羅氏診斷公司），RT-6100 酶標分析儀（Rayto 公司）;AU480 全自動生化分析儀（貝克曼公司）。

1.3 方法

1.3.1 標本采集

無菌操作采集37 份既往HBsAg-/HBV DNA+獻血者的新鮮血清，分成酶免(分離膠)檢測和核酸(帶分離膠，EDTA-K2抗凝)檢測各1 管（5 mL/管）。采血后4 h 內1 800×g，離心20 min，2～8℃保存，并在48 h內完成檢測。剩余血清-80℃保存。

1.3.2 血清學檢測

對37 份既往HBsAg-/HBV DNA+獻血者血清用化學發(fā)光法檢測HBsAg，若為陰性，則進行下一步核酸檢測。

1.3.3 核酸檢測

采用Cobas Taqsceen MPX 試劑進行單標本檢測，單標本檢測有反應性判定為NAT 陽性，即為HBsAg-/HBV DNA+OBI 組；單標本檢測無反應性判定為NAT陰性，不納入本研究范圍。

1.3.4 乙肝兩對半檢測

對納入研究的OBI 組標本進行化學發(fā)光法檢測乙肝抗原抗體系統。

1.3.5 丙氨酸氨基轉移酶（ALT）檢測

對OBI組標本進行ALT檢測,檢測范圍是5～50 U/L。

1.3.6 HBcrAg含量的檢測

對本研究的3 組標本都采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測，實驗嚴格按照試劑盒說明書進行。實驗重復3 次。檢測范圍是（0.25～8）ng/mL。

1.3.7 HBV DNA定量

采用實驗室內部自建系統定量（標準曲線法）[7]。

1.4 統計學分析

數據采用SPSS20.0 軟件進行統計分析。正態(tài)分布的計量資料以±s 表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較用單因素方差分析。HBcrAg與乙肝血清學相關指標采用Pearson相關性分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 研究對象一般資料

CHB 組、OBI 組與健康對照組在年齡、性別構成比、ALT 方面均無差異（P＞0.05），各組間具有可比性，見表1。

表1 3組研究對象基本信息Table 1 Basic information of 3 groups of research subjects

2.2 OBI組乙肝兩對半的檢出特征

37份獻血者標本經化學發(fā)光法檢測HBsAg 和核酸篩查，檢出22 份HBsAg-/HBV DNA+標本，檢出率59.46%(22/37)，對這22 例OBI 進行乙肝兩對半的檢測，HBsAg 檢測都為陰性，HBcAb 檢出率86.36%(19/22)，HBeAb檢出率22.73%（5/22）。

2.3 CHB 組、OBI 組與健康對照組的血清中HBcrAg表達水平比較

HBcrAg表達水平在3組間兩兩比較（單因素方差分析），均有差異（P＜0.05），見表2。

表2 3組研究對象HBcrAg表達比較（±s）Table 2 Comparison of the expression of HBcrAg among three groups（x±s）

表2 3組研究對象HBcrAg表達比較（±s）Table 2 Comparison of the expression of HBcrAg among three groups（x±s）

注：F=49.87，P＜0.05

CHB組1.14±0.23 HBcrAg（ng/mL）健康對照組0.47±0.09 0BI組0.92±0.13

2.4 OBI 組HBcrAg 與HBeAb、HBcAb、ALT、HBV DNA的相關性

HBcrAg 與HBeAb、HBcAb、ALT、HBV DNA 無相關性（P＞0.05），見表3。

表3 OBI 組HBcrAg 與HBeAb、HBcAb、ALT、HBV DNA的相關性Table 3 Correlation between HBcrAg and HBeAb, HBcAb,ALT,and HBV DNA in the OBI group

3 討論

血清HBV DNA 水平易受抗病毒藥物，特別是核苷（酸）類似物抗HBV 藥物的影響，不能很好地反映肝內HBV 的復制情況[8]，新型血清標志物HBcrAg不但可避免反復肝臟穿刺取材檢測cccDNA的風險與繁瑣及被檢者的痛苦，而且能反映整合HBV DNA 的轉錄活性，是反映肝內HBV cccDNA水平的較好替代指標，其準確性優(yōu)于血清HBV DNA和HBsAg水平[9]。唐紅等[10]曾對139例接受肝活組織檢查的慢乙肝患者血清中HBcrAg、HBsAg、HBV DNA和肝內cccDNA的水平進行檢測，發(fā)現血清HBcrAg水平與肝內HBV cccDNA水平呈顯著相關(r=0.929，P＜0.05)，且這一相關性明顯優(yōu)于HBsAg(r=0.742，P＜0.05) 和HBV DNA(r=0.854，P＜0.05)。由于cccDNA 主要存在于肝細胞核中，當肝細胞受到嚴重損害時，才釋放到血液中，血清中微乎其微，幾乎檢測不到，因此臨床上采取檢測肝活組織的cccDNA 的含量才能準確評估患者HBV 的復制程度和制定相應的診療方案。本研究中的22例OBI 雖然檢測HBV DNA 有反應性，但病毒載量不高，不足以嚴重損害肝細胞，其釋放于血清的cccDNA極低，目前檢測技術尚未能檢測到其含量，故未做血清HBcrAg 與肝活組織HBV cccDNA 之間的相關性研究。

本研究中的3 組研究對象HBcrAg 水平依次為：CHB 組＞OBI 組＞健康對照組。推測其原因，是由于HBV cccDNA即使量很少，在慢性乙型肝炎中通常只占肝內HBV DNA 總量的1%以下[11]，卻可以十分穩(wěn)定地存在，目前臨床廣泛使用的核苷（酸）類似物抗HBV藥物對其沒有直接抑制作用。采供血機構篩查出的HBsAg-/HBV DNA+感染者都是未使用過核苷（酸）類似物的自然人，其潛在的cccDNA完整的保留在肝細胞中，但并不是所有的受血者都會發(fā)生HBV感染，宿主的免疫功能、輸血量和患者的病毒載量會影響其發(fā)生率[12]。臨床上78%的接受抗病毒治療的患者經常無法檢測到血清HBV DNA，卻可檢測到血清HBcrAg[13]，其原因是cccDNA的穩(wěn)定存在，也是導致隱匿性肝炎再激活的主要原因之一。

西方等發(fā)達國家HBV 的流行率低，大多采用聯合HBsAg 與抗-HBc 或HBV 核酸檢測的方法來篩查獻血者，輸血后肝炎發(fā)生率非常低[14]。本研究中OBI 組HBcAb 檢出率為86.36%，提示我們可以將HBcAb和HBsAg同時做為篩查獻血者的血清指標。另外，HBeAb 是感染者血液中HBV 復制受到抑制而表現出乙肝病毒減少，可以出現在慢性乙肝患者和無癥狀HBsAg 攜帶者。我們對22 名HBsAg-/HBV DNA+感染者的HBcrAg 與其HBeAb、HBcAb、ALT、HBV DNA 等血清學檢測指標進行相關性分析的結果表明HBcrAg與上述指標之間無相關性。其原因是本研究僅為本中心小樣本的追蹤性實驗，追蹤的數量和時間有限，需要在今后研究中擴大樣本量并且聯合多中心進行針對不同年齡、不同病程的OBI 感染者對其拉長持續(xù)追蹤的時間和增加次數，動態(tài)了解HBsAg-/HBV DNA+人群的HBcrAg 表達水平，才能更充分體現出血清HBcrAg水平在篩查HBsAg-/HBV DNA+人群的優(yōu)越性，最大限度降低輸血HBV殘余風險。

雖然試驗用的是傳統的酶聯免疫吸附法檢測血清HBcrAg 水平，但這與目前我國血站檢測HBsAg 的方法一致，且目前很少有文獻報道此方法檢測血清HBcrAg 水平與HBsAg-/HBV DNA+獻血者的相關性，這是本研究的創(chuàng)新點之一。綜上所述，新型血清標志物血清HBcrAg在本研究中對篩查出HBsAg-/HBV DNA+感染者有一定的影響和應用前景，在一定程度上可反映肝細胞中的cccDNA 的存在水平。