GW501516對低氧致肺動脈內(nèi)皮細胞損傷的影響及機制 Δ

陳昌貴，易春峰，余志華，王 棟，李立為，賀立群 （武漢市第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，武漢 430022）

低氧性肺動脈高壓（hypoxic pulmonary hypertension，HPH）是低氧所致的肺動脈高壓，屬于肺動脈高壓的第三大類。持續(xù)的低氧可引起肺血管重構(gòu)，進而導致HPH，長期過高的肺動脈壓力會誘發(fā)患者出現(xiàn)難以控制的右心衰竭而死亡。肺動脈內(nèi)皮細胞（pulmonary artery endothelial cells，PAECs）在低氧肺血管重構(gòu)中起至關重要的作用，一旦PAECs 發(fā)生損傷，肺血管重構(gòu)過程即同步啟動，表現(xiàn)為血管收縮與舒張功能紊亂、肺動脈平滑肌細胞異常遷移與增殖、細胞外基質(zhì)合成增加，最終導致肺動脈高壓[1]。此外低氧還可誘導PAECs產(chǎn)生氧化應激，進而損傷PAECs，導致低氧肺血管重構(gòu)和HPH[1]。因此，具有逆轉(zhuǎn)低氧致PAECs 損傷作用的藥物，可能會改善低氧肺血管重構(gòu)。

過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs）是一種核受體，在配體激活時充當轉(zhuǎn)錄因子促進細胞轉(zhuǎn)錄，包含PPARα、PPARγ和PPARδ 3種亞型。既往研究發(fā)現(xiàn)，PPARδ具有抑制炎癥反應、抗氧化應激、改善內(nèi)皮細胞功能、抗動脈粥樣硬化等作用[2]。GW501516 是一種人工合成的PPARδ 激動劑，已被用于治療肥胖癥、脂質(zhì)紊亂和心血管疾病。動物實驗發(fā)現(xiàn)，每天以3 mg/kg GW501516 喂食低密度脂蛋白受體基因敲除小鼠，可減輕小鼠高脂飲食誘導的血管重構(gòu)[3]；體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)，GW501516能夠改善內(nèi)皮細胞功能[4]?；钚匝酰╮eactive oxygen species，ROS）是參與氧化應激的主要分子之一，在血管緊張素Ⅱ誘導的血管平滑肌細胞肥大模型中，GW501516可抑制血管平滑肌細胞內(nèi)產(chǎn)生ROS[5]。由此推測GW501516可能通過抑制氧化應激，保護PAECs，從而在低氧肺血管重構(gòu)中發(fā)揮保護作用。因此，本研究從GW501516 調(diào)控氧化應激的角度探討了其對低氧致PAECs損傷的影響及機制，以期為GW501516用于臨床治療HPH提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究使用的主要儀器包括Dmil Led 型倒置熒光顯微鏡（德國Leica 公司）、3131 型和311 型細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）、Synergy HT型多功能酶標儀（美國Bio-Tek 公司）、NovoCyte 型流式細胞儀（美國ACEA Biosciences 公司）、ChemiDoc XRS 型化學發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.2 主要藥品與試劑

GW501516（批號SML1491）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（批號D2625）、抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）（批號A0150000）均購自美國Sigma-Aldrich 公司，純度均≥98%；核因子E2 相關因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）激活劑富馬酸二甲酯（dimethyl fumarate，DMF）（批號S2586）、Nrf2 抑制劑ML385（批號S8790）均購自美國Selleck 生物科技有限公司，純度均≥99%；CCK-8 試劑盒購自日本同仁化學研究所；Annexin Ⅴ-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒（批號556547）購自美國BD 公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）（批號C0017）、ROS（批號S0033S）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）（批號S0101S）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）（批號S0058）、過氧化氫酶（catalase，CAT）（批號S0051）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）（批號S0131S）檢測試劑盒、BCA 試劑盒（批號P0012S）、細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒（批號P0028）均購自上海碧云天生物技術有限公司；兔源PPARδ（批號74076）、Nrf2（批號12721）、血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）（批號43966）、裂解型胱天蛋白酶3（cleaved-caspase-3，C-caspase-3）（批號9661）、核纖層蛋白B1（Lamin B1）（批號13435）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）（批號5174）等一抗均購自美國Cell Signaling Technology 公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗人IgG二抗（批號ab6858）購自英國Abcam公司。

1.3 實驗細胞

人PAECs 購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，批號為GPC0037。

2 方法

2.1 GW501516對PAECs的細胞毒性檢測

2.1.1 實驗分組與給藥

將細胞分為對照組和GW501516 組，對照組給予0.1%DMSO 孵育12、24、48 h，GW501516 組給予100 nmol/L GW501516[6]孵育12、24、48 h。

2.1.2 PAECs相對存活率的檢測

采用CCK-8 試劑盒檢測細胞相對存活率，評估GW501516 的細胞毒性。細胞以5×103個/孔均勻接種于96孔板，每組設6個復孔。按“2.1.1”項下方法分組及給藥后，按照試劑盒說明書加入CCK-8 溶液，同時設置空白組（培養(yǎng)基 100 μL+CCK-8 溶液 10 μL），繼續(xù)孵育3 h 后于450 nm 波長處測定吸光度（OD）值。細胞的相對存活率＝（實驗組OD－空白組OD）/（對照組OD－空白組OD）×100%。

2.2 低氧條件下PAECs 中PPARδ 蛋白表達水平的檢測

2.2.1 實驗分組與給藥

將細胞分為對照組（常氧+0.1%DMSO）、低氧組（低氧+0.1%DMSO）、GW501516 干預組（低氧+100 nmol/L GW501516），低氧刺激時間為24 h。低氧刺激前1 h 用GW501516 孵育PAECs，當PAECs 融合度達到80%～90%時，1∶2 傳代培養(yǎng)。各組細胞在低氧刺激前用不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h使細胞同步化。模擬低氧條件為含1%O2、5%CO2和94%N2的空氣，模擬常氧為含5%CO2的空氣（下同）。

2.2.2 PAECs中PPARδ蛋白表達水平的檢測

采用Western blot 法檢測PPARδ 蛋白的表達水平。細胞以1.5×105個/孔均勻接種于6 孔板，每組設3 個復孔。按“2.2.1”項下方法分組及給藥后，使用細胞裂解液裂解細胞提取細胞總蛋白，通過BCA 試劑盒檢測細胞總蛋白濃度。采用沸水浴滅活蛋白，上樣前將各組細胞蛋白稀釋成相同濃度，每個樣本取15 μg總蛋白加樣，并用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，再轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜中，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST 緩沖液洗膜，接著加入PPARδ、GAPDH 一抗（稀釋比分別為1∶1 000、1∶5 000），4 °C 孵育過夜；洗膜后加入二抗（稀釋比為1∶10 000），然后于室溫下孵育1 h，TBST 緩沖液洗膜后，滴加ECL混合溶液，暗室中曝光，測定蛋白條帶灰度值。以PPARδ 和GAPDH 條帶灰度值的比值表示PPARδ蛋白的表達水平。

2.3 低氧條件下PAECs 的凋亡率、細胞活力、LDH 活性和ROS水平的檢測

2.3.1 實驗分組與給藥

將細胞分為對照組（常氧+0.1%DMSO）、低氧組（低氧+0.1%DMSO）、NAC 干預組（陽性對照，低氧+10 mmol/L NAC[7]）、GW501516 干預組（低氧+100 nmol/L GW501516）。各藥物干預組在低氧刺激前1 h給予不同藥物孵育PAECs，低氧刺激時間為24 h。

2.3.2 細胞凋亡率的檢測

采用Annexin Ⅴ-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒聯(lián)合流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。細胞以1.5×105個/孔均勻接種于6 孔板，每組設3 個復孔。按“2.3.1”項下方法分組及給藥后，以胰酶消化收集細胞，取約1×106個細胞，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌后，依次加入PBS 200 μL、Annexin Ⅴ-FITC 10 μL 和PI 10 μL 重懸細胞，4 ℃避光孵育30 min后加入PBS 200 μL，通過流式細胞儀檢測細胞凋亡率，使用NovoExpress軟件分析數(shù)據(jù)。

2.3.3 細胞活力的檢測

采用CCK-8 試劑盒檢測細胞活力。細胞以5×103個/孔均勻接種于96孔板，每組設6個復孔。按“2.3.1”項下方法分組及給藥后，按“2.1.2”項下方法操作，檢測細胞存活率。

2.3.4 LDH活性的檢測

使用LDH檢測試劑盒檢測細胞中LDH活性。細胞以5×103個/孔均勻接種于96孔板，每組設6個復孔。按“2.3.1”項下方法分組及給藥后，每孔加入LDH 釋放液10 μL，孵育1 h后以400×g 離心5 min，取上清液，按試劑盒說明書加入LDH 檢測液后，于450 nm 波長處測定OD，檢測LDH活性。

2.3.5 ROS水平的檢測

采用二乙酰二氯氫化熒光素（DCFH-DA）探針聯(lián)合熒光酶標儀測定細胞內(nèi)ROS水平。細胞以3×104個/孔均勻接種于24孔板，每組設6個復孔。按“2.3.1”項下方法分組及給藥后，吸出培養(yǎng)基，加入10 μmol/L無血清培養(yǎng)基稀釋的DCFH-DA，37 ℃孵育20 min后將培養(yǎng)基吸出，PBS 洗滌3 次后，置于熒光酶標儀（激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525 nm）下檢測細胞內(nèi)ROS水平。

2.4 GW501516對低氧致PAECs損傷的作用機制研究

2.4.1 實驗分組與給藥

將細胞分為對照組（常氧+0.1%DMSO）、低氧組（低氧+0.1%DMSO）、DMF 干預組（陽性對照，低氧+75 μmol/L DMF[8]）、GW501516 干預組（低氧+100 nmol/L GW501516）、GW501516+ML385 干預組（低氧+100 nmol/L GW501516+5 μmol/L ML385[9]）。各藥物干預組在低氧刺激前1 h 給予不同藥物孵育PAECs，低氧刺激時間為24 h。

2.4.2 PAECs中HO-1蛋白和細胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達水平的檢測

采用Western blot 法檢測HO-1 蛋白和Nrf2 蛋白的表達水平。細胞以1.5×105個/孔均勻接種于6 孔板，每組設3 個復孔。按“2.4.1”項下方法分組及給藥后，使用細胞裂解液裂解細胞提取細胞總蛋白，使用細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒提取細胞核蛋白。按“2.2.2”項下方法檢測HO-1蛋白和Nrf2蛋白的表達水平，HO-1、Nrf2、Lamin B1 和GAPDH 的稀釋比例分別為1∶1 000、1∶1 000、1∶2 000、1∶5 000，以HO-1蛋白與GAPDH蛋白的灰度值比值表示HO-1 蛋白的表達水平，以Nrf2 蛋白與Lamin B1 蛋白的灰度值比值表示Nrf2 蛋白的表達水平。

2.4.3 PAECs 中SOD、GPx、CAT、MDA、ROS 水平的檢測

采用ELISA 法檢測PAECs 中SOD、GPx、CAT、MDA水平；采用DCFH-DA探針聯(lián)合熒光酶標儀測定細胞中ROS 水平。細胞以1.5×105個/孔均勻接種于6 孔板，每組設6個復孔。按“2.4.1”項下方法分組及給藥后，按試劑盒說明書檢測PAECs 中SOD、GPx、CAT、MDA水平；細胞中ROS水平的檢測方法同“2.3.5”。

2.4.4 PAECs 的凋亡率、細胞活力、LDH 活性和Ccaspase-3蛋白表達水平的檢測

按“2.4.1”項下方法分組及給藥后，按“2.3.2”項下方法檢測細胞凋亡率；按“2.1.2”項下方法檢測細胞活力；按“2.3.4”項下方法檢測LDH 活性；按“2.2.2”項下方法檢測C-caspase-3 蛋白表達水平，其中C-caspase-3 一抗稀釋比例為1∶1 000，以C-caspase-3與GAPDH條帶灰度值的比值表示C-caspase-3蛋白的表達水平。

2.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 GW501516對PAECs的細胞毒性

GW501516 組PAECs 孵育12、24、48 h 后的細胞相對存活率[（98.37±2.14）%、（102.10±4.61）%、（103.24±3.66）%]與對照組PAECs孵育12、24、48 h后的細胞相對存活率[（100.00±2.68）%、（100.00±3.75）%、（100.00±4.23）%]比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3.2 低氧條件下GW501516 對PAECs 中PPARδ 蛋白表達水平的影響

與對照組比較，低氧組PAECs中PPARδ蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）；與低氧組比較，GW501516 干預組PAECs 中PPARδ 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖1。

圖1 低氧條件下GW501516 對PAECs 中PPARδ 蛋白表達的影響

3.3 低氧條件下GW501516 對PAECs 的凋亡率、細胞活力、LDH活性和ROS水平的影響

與對照組比較，低氧組PAECs的凋亡率、LDH活性、ROS 水平均顯著升高（P＜0.05），細胞活力顯著降低（P＜0.05）；與低氧組比較，NAC干預組和GW501516干預組細胞凋亡率、LDH活性、ROS水平均顯著降低（P＜0.05），細胞活力均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖2、表1。

表1 低氧條件下PAECs 的凋亡率、細胞活力、LDH 活性和ROS水平的檢測結(jié)果（±s）

表1 低氧條件下PAECs 的凋亡率、細胞活力、LDH 活性和ROS水平的檢測結(jié)果（±s）

a：與對照組比較，P＜0.05；b：與低氧組比較，P＜0.05。

組別對照組低氧組NAC干預組GW501516干預組ROS水平（n＝6）1.00±0.15 8.85±0.96a 2.14±0.38b 3.81±0.27b細胞凋亡率（n＝3）/%6.03±1.34 20.42±4.47a 13.55±2.06b 11.37±1.85b細胞活力（n＝6）/%100.00±5.67 70.91±5.23a 85.13±4.25b 88.86±5.92b LDH活性（n＝6）1.00±0.12 6.26±0.51a 3.32±0.23b 2.14±0.27b

圖2 各組細胞的凋亡流式圖

3.4 GW501516對低氧致PAECs損傷的作用機制

3.4.1 PAECs中HO-1蛋白和細胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達水平的檢測結(jié)果

與對照組比較，低氧組PAECs 中HO-1 蛋白和細胞核內(nèi)Nrf2 蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05）；與低氧組比較，DMF干預組和GW501516干預組PAECs中HO-1 蛋白和細胞核內(nèi)Nrf2 蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）；與GW501516 干預組比較，GW501516+ML385 干預組PAECs中HO-1蛋白和細胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖3。

3.4.2 PAECs 中SOD、GPx、CAT、MDA、ROS 水平的檢測結(jié)果

與對照組比較，低氧組PAECs中SOD、GPx、CAT水平均顯著降低（P＜0.05），MDA、ROS 水平均顯著升高（P＜0.05）；與低氧組比較，DMF干預組和GW501516干預組PAECs 中SOD、GPx、CAT 水平均顯著升高（P＜0.05），MDA、ROS 水平均顯著降低（P＜0.05）；與GW501516 干預組比較，GW501516+ML385 干預組PAECs 中SOD、GPx、CAT 水平均顯著降低，MDA、ROS水平均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

表2 PAECs 中SOD、GPx、CAT、MDA、ROS 水平的檢測結(jié)果（±s，n＝6）

表2 PAECs 中SOD、GPx、CAT、MDA、ROS 水平的檢測結(jié)果（±s，n＝6）

a：與對照組比較，P＜0.05；b：與低氧組比較，P＜0.05；c：與GW501516干預組比較，P＜0.05。

組別對照組低氧組DMF干預組GW501516干預組GW501516+ML385干預組SOD 1.00±0.08 0.48±0.05a 0.95±0.06b 0.87±0.07b 0.34±0.03c GPx 1.00±0.15 0.15±0.01a 0.76±0.05b 0.58±0.07b 0.12±0.02c CAT 1.00±0.09 0.30±0.04a 0.75±0.05b 0.94±0.10b 0.25±0.03c MDA 1.00±0.08 7.56±0.81a 2.38±0.38b 3.66±0.26b 6.15±0.52c ROS 1.00±0.12 7.62±0.56a 2.53±0.15b 2.79±0.11b 5.81±0.47c

3.4.3 PAECs 的凋亡率、細胞活力、LDH 活性和Ccaspase-3蛋白表達水平的檢測結(jié)果

與對照組比較，低氧組PAECs的凋亡率、C-caspase-3蛋白表達水平、LDH活性均顯著升高，細胞活力顯著降低（P＜0.05）；與低氧組比較，DMF干預組和GW501516干預組PAECs 的凋亡率、C-caspase-3 蛋白表達水平、LDH活性均顯著降低，細胞活力均顯著升高（P＜0.05）；與GW501516 干預組比較，GW501516+ML385 干預組PAECs 的凋亡率、C-caspase-3 蛋白表達水平、LDH 活性均顯著升高，細胞活力顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖4、表3、圖5。

表3 機制研究中PAECs 的凋亡率、細胞活力、LDH 活性的檢測結(jié)果（±s）

表3 機制研究中PAECs 的凋亡率、細胞活力、LDH 活性的檢測結(jié)果（±s）

a：與對照組比較，P＜0.05；b：與低氧組比較，P＜0.05；c：與GW501516干預組比較，P＜0.05。

LDH活性（n＝6）1.00±0.09 8.65±0.81a 4.67±0.35b 3.26±0.51b 8.05±0.78c組別對照組低氧組DMF干預組GW501516干預組GW501516+ML385干預組細胞凋亡率（n＝3）/%4.69±0.82 21.55±3.13a 12.94±2.06b 9.24±1.86b 22.92±3.54c細胞活力（n＝6）/%100.00±6.06 73.85±4.58a 87.11±6.23b 84.86±5.82b 73.04±4.24c

圖4 機制研究中各組細胞的凋亡流式圖

圖5 GW501516 對低氧條件下PAECs 中C-caspase-3蛋白表達水平的影響

4 討論

低氧能夠誘導PAECs 損傷，使其凋亡增加，抑制PAECs 損傷和凋亡能夠逆轉(zhuǎn)HPH[1]。正常條件下LDH不能穿透細胞膜，但當細胞受損或死亡后，LDH 可以釋放到細胞外，其釋放水平能夠反映細胞損傷程度[10]。caspase-3 是調(diào)控細胞凋亡的關鍵介質(zhì)，可被外源性（死亡配體）和內(nèi)源性（線粒體）凋亡途徑激活，是最重要的胱天蛋白酶。caspase-3 激活后生成的C-caspase-3 是細胞凋亡的主要執(zhí)行者之一，亦是細胞凋亡的標志蛋白[11]。研究發(fā)現(xiàn)，PPARδ合成型激動劑L-165041能夠抑制H2O2誘導的人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞損傷，抑制其凋亡，而PPARδ的沉默逆轉(zhuǎn)了這種作用[2]。此外，PPARδ可通過激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B通路來抑制缺氧誘導的內(nèi)皮祖細胞凋亡[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，在低氧刺激下，PAECs 中PPARδ 蛋白表達水平降低，細胞凋亡率升高，C-caspase-3表達水平升高，細胞活力降低，LDH活性升高；而GW501516 可上調(diào)PPARδ 蛋白的表達，抑制低氧誘導的PAECs 損傷，且實驗濃度的GW501516 對PAECs無明顯細胞毒性。因此，本課題組推測低氧通過抑制PPARδ蛋白表達來損傷內(nèi)皮細胞，GW501516則通過激活PPARδ來發(fā)揮保護內(nèi)皮細胞的作用。

低氧能夠誘導氧化應激，導致PAECs 的損傷和凋亡，抑制氧化應激可抑制PAECs 損傷及HPH 的形成[1,13―14]。有研究表明，PPARδ能夠抑制高糖誘導的血管內(nèi)皮功能障礙及ROS 的產(chǎn)生[15]。在動脈粥樣硬化的動物模型中發(fā)現(xiàn)，PPARδ 可減少ROS 的產(chǎn)生，從而發(fā)揮保護內(nèi)皮細胞的作用[16]。另有研究表明，GW501516 能夠通過抑制ROS 產(chǎn)生而抑制血管緊張素Ⅱ誘導的血管平滑肌細胞肥大[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，GW501516 及NAC 均可抑制低氧誘導的PAECs損傷及ROS產(chǎn)生。因此，本課題組推測GW501516 可通過抑制氧化應激來抑制低氧誘導的PAECs損傷。

Nrf2是一種參與氧化應激的關鍵轉(zhuǎn)錄因子，其在細胞核內(nèi)可與抗氧化反應元件結(jié)合，來促進下游抗氧化酶或蛋白的表達，從而發(fā)揮抗氧化應激作用。CAT、GPx、HO-1 和SOD 是Nrf2 通路下游的主要抗氧化酶。其中，HO-1 可降解血紅素，產(chǎn)生一氧化碳、亞鐵和膽綠素，而HO-1以及血紅素分解代謝產(chǎn)物均具有抗氧化作用，并能夠緩解肺血管重構(gòu)[17]；SOD可將超氧化自由基分解為H2O2，促進氧自由基的清除，上調(diào)SOD活性，減輕肺血管重構(gòu)[18]；GPx可催化谷胱甘肽與H2O2或其他過氧化物的反應，生成氧化型谷胱甘肽和H2O，從而消除ROS[11]；CAT 能催化H2O2生成H2O 與O2。氧化應激能導致細胞脂質(zhì)過氧化，MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，其水平與氧化應激呈負相關。Nrf2 激活劑能夠通過上調(diào)肺動脈組織內(nèi)SOD、HO-1 活性，降低MDA 及ROS 水平，抑制低氧誘導的氧化應激，從而緩解大鼠低氧肺血管重構(gòu)[19]。在高糖誘導人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞氧化應激的細胞模型中發(fā)現(xiàn)，PPARδ 激動劑GW0742 和L165041 可激活Nrf2，并以濃度依賴的方式上調(diào)人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞內(nèi)HO-1 蛋白和mRNA 的表達，抑制ROS 產(chǎn)生，從而發(fā)揮保護人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞的作用[20]。在內(nèi)皮細胞中，GW0742通過誘導SOD、CAT等抗氧化酶的表達，減少腫瘤壞死因子α誘導的內(nèi)皮細胞產(chǎn)生ROS[2]。內(nèi)皮細胞特異性PPARδ基因敲除小鼠主動脈內(nèi)CAT 和GPx 的表達降低，氧化應激增強[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2 激活劑DMF 和GW501516 均可升高Nrf2 蛋白、HO-1 蛋白的表達水平及SOD、GPx、CAT 水平，降低MDA、ROS 水平，減輕低氧誘導的PAECs 損傷，且Nrf2 抑制劑ML385 能夠逆轉(zhuǎn)GW501516 的上述作用。這說明GW501516 可通過抑制氧化應激，減輕低氧誘導的PAECs 損傷，其機制可能與激活Nrf2有關。

綜上所述，GW501516可通過激活Nrf2，抑制氧化應激來減輕低氧誘導的PAECs 損傷。本研究僅從細胞水平探討了GW501516 對低氧誘導PAECs 損傷及氧化應激的影響，本課題組將在后續(xù)動物實驗中觀察GW501516 對低氧誘導的肺動脈高壓大鼠內(nèi)皮細胞功能、氧化應激及肺血管重構(gòu)的影響。