止得咳顆粒在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物研究 Δ

梁 潔 ，鄭飄雪 陳輝華 黃春燕 ，梁炎麗 陸春蓮 謝晶晶 馬玉明 彭嘉文 趙立春 ，陳日蘭 （1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧 3000；.廣西高校中藥提取純化與質(zhì)量分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 3000；3.中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心華南分中心，南寧 3000；.廣西壯瑤藥工程技術(shù)研究中心，南寧 3000；.欽州市檢驗(yàn)檢測(cè)中心，廣西 欽州 3000；.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院藥劑科，南寧 30011）

止得咳顆粒是在廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院臨床經(jīng)驗(yàn)方的基礎(chǔ)上研制而成的中藥復(fù)方制劑，由龍脷葉、射干、桔梗、白前、黃芩、柴胡、青天葵等10味藥材配伍而成，現(xiàn)已獲得藥物臨床試驗(yàn)批準(zhǔn)。相關(guān)藥理學(xué)研究表明，止得咳顆粒具有止咳、化痰和利咽等功效，常用于急、慢性支氣管炎、肺炎的治療[1]。但目前止得咳顆粒的研究?jī)H限于質(zhì)量控制、提取工藝和藥效學(xué)研究[2―4]，尚未有其體內(nèi)代謝產(chǎn)物的相關(guān)研究。通過研究中藥復(fù)方制劑代謝產(chǎn)物，鑒定其被吸收的活性成分，確定該復(fù)方制劑的藥效活性成分，是闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制的重要環(huán)節(jié)。但中藥復(fù)方成分的復(fù)雜性和體內(nèi)代謝的多樣性，導(dǎo)致其代謝產(chǎn)物的鑒定具有一定難度。超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜（UPLC-QExactive-MS）技術(shù)具有高靈敏度、高選擇性和高分辨率的特點(diǎn)，能在復(fù)雜體系中快速識(shí)別與定量分析化學(xué)成分，現(xiàn)已成為中藥代謝產(chǎn)物鑒定的重要手段?；诖?，本研究采用UPLC-Q-Exactive-MS技術(shù)分析止得咳顆粒的化學(xué)成分，并對(duì)大鼠給予止得咳顆粒后的血清、尿液和糞便進(jìn)行檢測(cè)，分析其原型成分及可能的代謝產(chǎn)物，以期為闡明該制劑的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和指導(dǎo)臨床安全用藥提供依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

Ultimate 3000型超高效液相色譜儀和Q-Exactive高分辨質(zhì)譜儀均購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；XW-80A 型渦旋儀購自上海滬西分析儀器廠有限公司；Milli-Q Gradient A10 型超純水純化系統(tǒng)購自美國Millipore 公司；5415R 型低溫高速離心機(jī)購自艾本德中國有限公司；NDK200-2N 型氮吹儀購自杭州米歐儀器有限公司。

1.2 藥品與試劑

止得咳顆粒由廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院自制（批號(hào)20210608）；野鳶尾黃素、黃芩素、橙皮苷、黃芩苷、檸檬酸、右旋奎尼酸、柴胡皂苷C、D-（+）-蔗糖、尿苷、L-酪氨酸、蘆薈大黃素、圣草酚-7-O-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、漢黃芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、綠原酸、咖啡酸、異鼠李素、山柰酚、木犀草素、柚皮素、香葉木素、黃芩新素、喬松素、次野鳶尾黃素、漢黃芩素（純度均大于98%，批號(hào)分別為RP211021、RP220627、RP220321、RP220827、RP220527、RP200120、RP200604、RP210204、RP210525、RP200602、RP220614、RP220426、RP210827、RP221114、RP221223、RP210916、RP220610、RP211118、RP200312、RP210105、RP220113、RP210718、RP221129、RP211213、RP221130）對(duì)照品均購自成都麥德生科技有限公司；甲醇、乙腈為質(zhì)譜純，甲酸、甲酸銨為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 動(dòng)物

本研究所用動(dòng)物為雄性清潔級(jí)健康SD 大鼠，共24只，體重（220±20）g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（湘）2019-0001。本文涉及的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)DW20220726-159。

2 方法

2.1 止得咳顆粒藥液的制備

取止得咳顆粒500 g，研細(xì)，加入超純水5 000 mL，攪拌至完全溶解，即得止得咳顆粒藥液，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 動(dòng)物分組及給藥

將24 只雄性SD 大鼠隨機(jī)分為空白組（n＝6）、給藥組（n＝18）。實(shí)驗(yàn)前，所有大鼠均于SPF 級(jí)屏障環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)4 d，自由攝食、飲水；給藥前禁食12 h（自由飲水），給藥組大鼠按9.45 g/kg（臨床等效劑量）灌胃止得咳顆粒藥液，空白組大鼠灌胃等體積超純水，每天2次，每次灌胃間隔6～8 h，連續(xù)3 d。

2.3 生物樣品的收集與處理

末次給藥后1 h，取給藥組大鼠6 只，用戊巴比妥鈉麻醉后行腹主動(dòng)脈采血，于4 ℃下以3 000 r/min離心20 min，取上清液，得血清樣品。將給藥組剩余的12只大鼠均分后置于2個(gè)代謝籠中，其中一個(gè)代謝籠用于收集12 h 內(nèi)尿液，另一個(gè)用于收集12 h 內(nèi)糞便。將收集的尿液以3 500 r/min 離心10 min，取上清液，以氮?dú)鉂饪s至2 mL，得尿液樣品；將收集的糞便于50 ℃烘干，碾碎，得糞便樣品?？瞻捉M大鼠同法收集血清、尿液及糞便樣品。以上樣品均置于－80 ℃冰箱中保存。

2.4 生物供試品溶液的制備

2.4.1 血清供試品溶液的制備

解凍血清樣品，吸取100 μL，加入乙腈300 μL，渦旋30 s，于－20 ℃下超聲（功率250 W，頻率40 kHz，下同）提取20 min，于4 ℃下以13 000 r/min離心5 min；取上清液300 μL以氮?dú)獯蹈?，用超純?00 μL復(fù)溶，渦旋振蕩1 min，于4 ℃下以13 000 r/min 離心5 min，取全部上清液，即得。

2.4.2 尿液供試品溶液的制備

解凍尿液樣品，渦旋1 min，取500 μL 置于1.5 mL離心管中，于4 ℃下以13 000 r/min離心5 min；取全部上清液，過0.22 μm水相濾膜，取濾液80 μL，即得。

2.4.3 糞便供試品溶液的制備

稱取糞便樣品10 mg，加入1%甲酸乙腈溶液1 mL，渦旋30 s，于－20 ℃下超聲提取20 min，于4 ℃下以13 000 r/min 離心5 min；取上清液800 μL 以氮?dú)獯蹈桑?0%乙腈溶液（含1%甲酸）100 μL 復(fù)溶，于4 ℃下以13 000 r/min離心5 min，取全部上清液，即得。

2.5 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取“1.2”項(xiàng)下各對(duì)照品適量，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，混勻，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得適宜質(zhì)量濃度的單一對(duì)照品溶液。

2.6 分析條件

2.6.1 色譜條件

以Waters HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）為色譜柱；正離子模式下流動(dòng)相為0.1%甲酸溶液（A）和含0.1%甲酸的甲醇溶液（B），負(fù)離子模式下流動(dòng)相為10 mmol/L 甲酸銨溶液（A）和含10 mmol/L 甲酸銨的95%甲醇溶液（B），進(jìn)行梯度洗脫（0～1 min，90%A；1～13 min，90%A→2%A；13～18 min，2%A；18～18.5 min，2%A→90%A；18.5～20 min，90%A）；流速為0.3 mL/min；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量為2 μL。

2.6.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI），選擇正、負(fù)離子模式分開檢測(cè)，一級(jí)分辨率為70 000 FWHM，二級(jí)分辨率為17 500 FWHM；離子源噴霧電壓分別為3.8、3.2 kV；毛細(xì)管溫度為300 ℃；鞘氣流速為40 Arb；霧化器溫度為350 ℃。

2.7 分析方法

取血清供試品溶液、糞便供試品溶液、尿液供試品溶液、止得咳顆粒藥液，按“2.6”項(xiàng)下分析條件進(jìn)樣。采用MS-DIAL 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，將得到的數(shù)據(jù)結(jié)果與MSBank、KEGG數(shù)據(jù)庫比對(duì)，對(duì)各個(gè)色譜峰進(jìn)行初步推測(cè)，得到化合物的準(zhǔn)分子離子峰和二級(jí)碎片離子、分子式等信息，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)及質(zhì)譜裂解規(guī)律，進(jìn)一步對(duì)化合物進(jìn)行推測(cè)及鑒定。

3 結(jié)果

正負(fù)離子模式下得到的總離子流圖見圖1、圖2（正負(fù)離子模式下空白樣品的總離子流圖略）。通過與止得咳顆粒藥液以及空白組樣品進(jìn)行對(duì)比，并結(jié)合對(duì)照品相關(guān)信息后發(fā)現(xiàn)，止得咳顆粒中共鑒定出31個(gè)化學(xué)成分，包含17個(gè)黃酮及其苷類化合物、7個(gè)有機(jī)酸類化合物、3個(gè)皂苷類化合物、4 個(gè)其他類化合物（表1）。大鼠的血清、尿液和糞便樣品共鑒定出16 個(gè)原型成分和11 個(gè)代謝產(chǎn)物。其中，血清樣品中鑒定出8 個(gè)原型成分和4 個(gè)代謝產(chǎn)物；尿液樣品中鑒定出10個(gè)原型成分和7個(gè)代謝產(chǎn)物；糞便樣品中鑒定出8 個(gè)原型成分和5 個(gè)代謝產(chǎn)物（表2）。

表1 止得咳顆粒中化學(xué)成分鑒定結(jié)果

表2 止得咳顆粒在大鼠血清、糞便、尿液中的主要原型成分和代謝產(chǎn)物

圖1 正離子模式下給藥組樣品及止得咳顆粒藥液的總離子流圖

圖2 負(fù)離子模式下給藥組樣品及止得咳顆粒藥液的總離子流圖

3.1 止得咳顆粒化學(xué)成分及原型成分的鑒定

3.1.1 黃酮及其苷類化合物

黃酮類化合物大部分以游離、與糖結(jié)合成苷類等形式存在，其裂解規(guī)律主要包括失去中性離子CH3、CO、CO2、H2O，糖苷鍵的斷裂及發(fā)生逆狄爾斯-阿爾德裂解反應(yīng)等[5]。

化合物13 的保留時(shí)間為9.448 min，準(zhǔn)分子離子峰m/z269.045 4[M－H]－，分子式為C15H10O5。準(zhǔn)分子離子峰m/z269.045 4[M－H]－的鄰二羥基結(jié)構(gòu)脫去H2O后生成m/z251.033 0[M－H－H2O]－，同時(shí)還失去了CO、CO2、H2O 等小分子，生成碎片離子m/z241.049 3[MH－CO]－、m/z225.054 7[M－H－CO2]－、m/z197.060 6[M－H－CO－CO2]－、m/z195.045 3[M－H－H2O－2CO]－、m/z169.065 1[M－H－2CO－CO2]－。這與文獻(xiàn)報(bào)道的黃芩素裂解規(guī)律基本一致[5]；此外，化合物13 的保留時(shí)間與黃芩素對(duì)照品一致，故推測(cè)其為黃芩素。

依據(jù)上述黃酮類成分的裂解規(guī)律，推測(cè)化合物2、5、7、10、11、12、14、15、16和17分別為異鼠李素、山柰酚或木犀草素、柚皮素、野鳶尾黃素、鳶尾黃素、香葉木素、黃芩新素、次野鳶尾黃素、松屬素和漢黃芩素。

黃酮類化合物大多數(shù)以苷類形式存在于自然界，而糖苷鍵的斷裂是黃酮苷類化合物的主要裂解途徑?；衔?在負(fù)離子模式下的保留時(shí)間為7.487 min，由一級(jí)質(zhì)譜得到準(zhǔn)分子離子峰m/z609.187 4[M－H]－，分子式為C28H34O15。主要碎片離子包括m/z301.069 5[M－HRha－Glc]－、m/z286.047 8[M－H－Rha－Glc－CH3]－、m/z242.056 8[M－H－Rha－Glc－CH3－CO2]－、m/z151.020 0[M－H－Rha－Glc－C9H10O2]－、m/z125.022 5[M－HRha－Glc－C10H8O3]－。這與文獻(xiàn)報(bào)道的橙皮苷裂解規(guī)律一致[5]，經(jīng)與對(duì)照品比對(duì)，確認(rèn)該化合物為橙皮苷。

依據(jù)上述黃酮苷類成分的裂解規(guī)律，推測(cè)化合物1、3、6、8和9分別為圣草酚-7-O-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、黃芩苷、漢黃芩苷和芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷。

3.1.2 有機(jī)酸類化合物

有機(jī)酸是一類廣泛存在于植物中的具有酸性的有機(jī)化合物，其裂解規(guī)律通常為失去CO、CO2、H2O等中性碎片。

化合物18 的保留時(shí)間為0.945 min，由一級(jí)質(zhì)譜圖得到準(zhǔn)分子離子峰m/z191.056 [M－H]－，分子式為C7H12O6。準(zhǔn)分子離子峰發(fā)生裂解，失去2 個(gè)H2O 和CO后得到碎片離子m/z127.038 5[M－H－2H2O－CO]－，或失去3 個(gè)H2O 和CO2后得到碎片離子m/z93.033 0[MH－3H2O－CO2]－。結(jié)合文獻(xiàn)[5]，經(jīng)與對(duì)照品比對(duì)，確認(rèn)該化合物為右旋奎寧酸。

依據(jù)上述有機(jī)酸類成分的裂解規(guī)律，推測(cè)化合物19和24均為阿魏酸/異阿魏酸，化合物20、21、22、23分別為綠原酸、檸檬酸、壬二酸、咖啡酸。

3.1.3 皂苷類化合物

止得咳顆粒中的皂苷類化合物主要來源于柴胡，該類化合物易失去母核上連接的葡萄糖、海藻糖基、CO2、H2O等中性分子。

化合物25 的保留時(shí)間為9.987 min，準(zhǔn)分子離子峰m/z925.515 4[M－H]－，分子式為C48H78O17。準(zhǔn)分子離子峰結(jié)合1 個(gè)羧基后得到碎片離子m/z970.459 4[M－H+COOH]+；準(zhǔn)分子離子峰脫去1個(gè)海藻糖基（Fuc，146 Da）后產(chǎn)生碎片離子m/z779.453 2[M－H－Fuc]－，再脫去葡萄糖基（Glu，162 Da）后產(chǎn)生碎片離子m/z617.455 4[MH－Fuc－Glu]－。這與文獻(xiàn)報(bào)道柴胡皂苷C的裂解規(guī)律一致[6]，經(jīng)與對(duì)照品比對(duì)，鑒定該化合物為柴胡皂苷C。其可能的裂解路徑見圖3。

3.1.4 其他類化合物

化合物28 的保留時(shí)間為0.975 min，準(zhǔn)分子離子峰m/z341.111 3[M－H]－，分子式為C12H22O11。二級(jí)質(zhì)譜中存在由準(zhǔn)分子離子峰發(fā)生裂解失去C9H16O8后產(chǎn)生的碎片離子m/z89.023 1[M－H－C9H16O8]－，此碎片繼續(xù)裂解失去1 個(gè)H2O 產(chǎn)生碎片離子m/z71.012 3[M－HC9H16O8－H2O]－。這與文獻(xiàn)報(bào)道的蔗糖質(zhì)譜信息相同[5]，經(jīng)與對(duì)照品比對(duì)，確認(rèn)該化合物為蔗糖。

3.2 止得咳顆粒在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物鑒定

化合物M1 的保留時(shí)間為1.701 min，準(zhǔn)分子離子峰m/z303.231 5[M－H]－，分子式為C15H12O7。二級(jí)質(zhì)譜碎片離子有m/z285.043 8、m/z241.047 6、m/z169.061 5。碎片離子與山柰酚或木犀草素的特征碎片一致，預(yù)測(cè)該化合物的母核可能為山柰酚或木犀草素，且發(fā)現(xiàn)準(zhǔn)分子離子峰m/z303.231 5[M－H]－比碎片離子m/z285.043 8多1 個(gè)H2O，因此推測(cè)該化合物可能為山柰酚或木犀草素水合產(chǎn)物[7]。

化合物M2 的保留時(shí)間為5.500 min，準(zhǔn)分子離子峰m/z367.158 1[M－H]－，分子式為C17H20O9。二級(jí)質(zhì)譜中存在碎片離子m/z193.050 3、m/z191.056 1、m/z173.045 4、m/z134.036 3，其中碎片離子m/z191.056 1、m/z134.036 3為綠原酸特征碎片，且準(zhǔn)分子離子峰m/z368.158 1[MH]－比綠原酸m/z353.088 6[M－H]－多1 個(gè)CH2，因此預(yù)測(cè)該化合物可能為綠原酸甲基化產(chǎn)物[8]。

化合物M3 的保留時(shí)間為7.415 min，準(zhǔn)分子離子峰m/z463.088 2[M+H]+，分子式為C21H18O12。二級(jí)質(zhì)譜碎片離子有m/z287.053 6、m/z270.047 6、m/z169.011 8，與黃芩苷二級(jí)碎片離子相同，故預(yù)測(cè)該化合物的母核為黃芩苷；又因準(zhǔn)分子離子峰比母核多1 個(gè)OH－，因此推測(cè)該化合物可能為黃芩苷羥基化產(chǎn)物[9]。

4 討論

止得咳顆粒的化學(xué)成分及代謝的原型成分主要為黃酮及其苷類化合物、有機(jī)酸類化合物等。黃酮類成分包括野鳶尾黃素、黃芩素、黃芩苷等，具有抗菌、抗炎等活性[5，10―11]；有機(jī)酸類化合物包括綠原酸、咖啡酸等，具有抗炎、止咳、平喘等功效[12―13]。這與本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)止得咳顆粒具有止咳、抗炎的功效相一致[2]，可為該制劑的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供理論依據(jù)。代謝產(chǎn)物的研究結(jié)果顯示，本研究檢測(cè)到黃芩苷原型及3個(gè)可能的代謝產(chǎn)物，因此筆者推斷大鼠在給予止得咳顆粒后，黃芩苷在其體內(nèi)主要發(fā)生了甲基化、羥基化和葡萄糖醛酸化，這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的黃芩苷代謝途徑一致[7]；另外，本研究還檢測(cè)到鳶尾黃素原型及3個(gè)可能的代謝產(chǎn)物，因此筆者推斷大鼠在給予止得咳顆粒后，鳶尾黃素在其體內(nèi)主要發(fā)生了甲基化、去甲基化和去甲氧基化，這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的鳶尾黃素代謝途徑一致[14]。本研究還發(fā)現(xiàn)，在大鼠的血清、尿液和糞便中能檢測(cè)到黃芩苷、黃芩素、次野鳶尾黃素和綠原酸等原型成分，表明止得咳顆粒進(jìn)入大鼠體內(nèi)后，并不是完全經(jīng)過代謝轉(zhuǎn)化排出體外，還有一部分以原型成分直接排出體外。

從代謝產(chǎn)物的結(jié)果可知，鑒定出的成分大部分來源于射干、黃芩等藥材，這可能與龍脷葉和青天葵等藥材的化學(xué)成分研究較少，以及文獻(xiàn)資料信息不足等有關(guān)。而且，僅從一級(jí)質(zhì)譜、二級(jí)質(zhì)譜和分子式等信息鑒定化學(xué)成分，對(duì)于具有相似結(jié)構(gòu)的同分異構(gòu)體無法區(qū)分。因此，若想明確化合物的具體結(jié)構(gòu)，還需通過對(duì)照品比對(duì)，以及結(jié)合半制備液相色譜等技術(shù)進(jìn)一步研究止得咳顆粒的化學(xué)成分。

綜上所述，本研究通過UPLC-Q-Exactive-MS 技術(shù)對(duì)止得咳顆粒在大鼠血清、尿液和糞便中的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分析，共鑒定出16個(gè)原型成分及11個(gè)代謝產(chǎn)物，主要涉及甲基化、羥基化、葡萄糖醛酸化等代謝途徑。