阿奇霉素對新生大鼠支氣管肺發(fā)育不良的改善作用及機制 Δ

杜維納，高淑強 ，巨 容，習(xí)玉峰（電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦女兒童醫(yī)院/成都市婦女兒童中心醫(yī)院新生兒重癥醫(yī)學(xué)科，成都 611731）

支氣管肺發(fā)育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）是多發(fā)于早產(chǎn)兒的慢性肺損傷性疾病，該病具有較高的病死率，使存活患兒多遺留有明顯的肺功能不全并伴隨生長發(fā)育遲滯，嚴(yán)重威脅患兒的生活質(zhì)量[1―2]。研究證實，在機械通氣及氧療過程中，吸入氧濃度過高及氧療時間較長均可導(dǎo)致早產(chǎn)兒體內(nèi)釋放大量的活性氧和自由基，引發(fā)白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等炎癥因子釋放量明顯升高，并進一步誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，從而引起肺損傷，甚至進展為BPD[2―3]。但目前關(guān)于BPD的病因及發(fā)生機制尚未完全揭示，且臨床缺乏切實有效的預(yù)防及治療手段。因此探究BPD 有效的預(yù)防與治療方法具有重要意義。

阿奇霉素是一種半合成的15 元環(huán)結(jié)構(gòu)的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，其在血液中的半衰期長達35～48 h，藥效持續(xù)時間較長，具有良好的抗菌藥物后效應(yīng)，在免疫調(diào)控及抗炎方面發(fā)揮重要的作用[4]。目前已有研究證實了阿奇霉素在預(yù)防及治療BPD方面的作用，然而其具體作用機制尚未確切[5]。故基于上述背景，本研究考察了阿奇霉素對新生大鼠BPD 的改善作用及機制，旨在為BPD的預(yù)防和治療提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括BH-5160CRP 型全自動血液分析儀（南京貝登醫(yī)療股份有限公司）、PE-300型顯微鏡（廣州科適特科學(xué)儀器有限公司）、HD-3001型核酸蛋白濃度檢測儀（上海金鵬分析儀器有限公司）、Light Cycler480型實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（瑞士Roche公司）、DW-86L959BPT型80 ℃超低溫冰箱（杭州諾丁科學(xué)器材有限公司）、GenoSens 220 型凝膠成像系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器公司）。

1.2 主要藥品與試劑

阿奇霉素注射液（規(guī)格2 mL∶0.1 g，國藥準(zhǔn)字H20051466）購自亞寶藥業(yè)集團股份有限公司；吸入用布地奈德混懸液（陽性對照藥，規(guī)格2 mL∶1 mg，國藥準(zhǔn)字H20203649）購自深圳太太藥業(yè)有限公司/健康元海濱藥業(yè)有限公司；蘇木精-伊紅（HE）染液（批號G1005）購自武漢賽維爾生物科技有限公司；兔源血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）單克隆抗體（批號ab32152）、兔源缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）單克隆抗體（批號ab129733）、兔源HIF-2α單克隆抗體（批號2608）均購自武漢益普生物科技有限公司；TNF-α、IL-6、IL-1β酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（批號分別為KE1002、KE10007、19811-1-AP）均購自美國Proteintech 公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）ELISA 試劑盒（批號分別為20211016、20211112、20211218）均購自南京建成生物工程研究所；β-肌動蛋白（β-actin）抗體（批號191050722）、羊抗兔二抗（批號139931）均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；DAB 顯色劑（批號G32415）購自廣州展晨生物科技有限公司；RIPA 裂解液（批號20220416）購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；Trizol 試劑（批號NR0002）購自北京康瑞納生物科技有限公司。

1.3 實驗動物

新生SD大鼠60只，2日齡，雌雄各半，體重5～10 g，購自北京希諾谷生物科技有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2021-0001。所有大鼠飼養(yǎng)于SPF 級動物實驗房，溫度22～25 ℃，相對濕度40%～60%，均自由攝食、飲水，隔日更換墊料。本實驗方案經(jīng)成都市婦女兒童中心醫(yī)院動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)通過[批件號：科研倫審2023（51）-2號]。

2 方法

2.1 分組、建模與給藥

將60 只新生SD 大鼠隨機分為陰性對照（NC）組、BPD 組、阿奇霉素組、布地奈德組（陽性對照），每組15只，其中NC組大鼠正常呼吸空氣，其余3組大鼠通過在高濃度氧（保持氧含量＞90%）中暴露14 d 構(gòu)建BPD 大鼠模型[6]。待建模成功后，阿奇霉素組大鼠按200 mg/kg腹腔注射阿奇霉素注射液[6]，布地奈德組大鼠按1.5 mg/kg霧化吸入布地奈德混懸液20 min[2]，同時2組均予以等量生理鹽水灌胃，每日1 次，連續(xù)14 d；BPD 組和NC 組大鼠不做任何處理。

2.2 肺組織病理學(xué)觀察

每組各取5 只大鼠，處死，分離肺組織，一部分置于－80 ℃超低溫冰箱中保存，另一部分由4%多聚甲醛固定。取出固定的肺組織，通過石蠟包埋切片，然后分別放入二甲苯及梯度乙醇（70%、80%、90%、100%）中脫蠟至水，蘇木素染色，磷酸鹽緩沖液沖洗，經(jīng)鹽酸、乙醇分化后再次通過梯度乙醇（100%、90%、80%、70%）脫水，二甲苯透明處理后封片。在PE-300型顯微鏡下觀察各組大鼠的肺組織病理學(xué)變化，并進一步通過Image J軟件檢測放射狀肺泡計數(shù)和肺泡平均截距。

2.3 支氣管肺泡灌洗液中白細胞計數(shù)檢測

麻醉各組剩余10 只大鼠，由大鼠氣管插入細靜脈管，注入生理鹽水，然后收集支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），離心后留取沉淀并通過全自動血液分析儀檢測其中白細胞計數(shù)。

2.4 BALF中炎癥因子及氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測

收集各組剩余10 只大鼠的BALF，在4 ℃下以3 000 r/min離心10 min，取上清液，按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測其中TNF-α、IL-6、IL-1β、SOD、CAT、MDA水平。

2.5 肺組織中VEGF、HIF-1α 和HIF-2α mRNA 表達檢測

BALF 收集結(jié)束后，將剩余的10 只大鼠處死，采用Trizol 法提取總RNA，經(jīng)HD-3001 型核酸蛋白濃度檢測儀檢測后將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并進一步擴增。反應(yīng)體系：SYBR Premix 12.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，cDNA 0.5 μL，ddH2O 10 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35 個循環(huán)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參，按2－ΔΔCt法檢測VEGF、HIF-1α、HIF-2α mRNA 的相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列及產(chǎn)物長度

2.6 肺組織中VEGF、HIF-1α和HIF-2α蛋白表達檢測

取出低溫保存的肺組織適量，加入RIPA 裂解液提取總蛋白，經(jīng)蛋白濃度測定后，變性。取變性蛋白樣品適量，電泳分離后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，封閉2 h后加入兔源VEGF、HIF-1α、HIF-2α一抗（稀釋比例均為1∶1 000），于4 ℃下過夜；次日通過TBST 緩沖液漂洗后加入羊抗兔二抗（稀釋比例為1∶2 000），于室溫下孵育2 h，加入ECL 顯色，置于GenoSens 220 型凝膠成像系統(tǒng)成像，通過Quantity One軟件分析VEGF、HIF-1α、HIF-2α蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin的灰度值比值，表示目的蛋白表達量。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布及方差齊性的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。檢驗水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 大鼠肺組織病理學(xué)變化

NC 組大鼠肺組織及肺泡結(jié)構(gòu)正常，未發(fā)現(xiàn)損傷癥狀；BPD 組大鼠肺組織出現(xiàn)明顯損傷，肺泡融合變大且間隔不均勻，肺泡數(shù)量顯著減少，有明顯的炎癥細胞浸潤；阿奇霉素組大鼠肺組織上述病理癥狀有所改善，且與布地奈德組改善程度相似。結(jié)果見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織病理學(xué)變化（HE染色）

3.2 大鼠BALF 中白細胞計數(shù)和肺組織中放射狀肺泡計數(shù)及肺泡平均截距變化

與NC組比較，BPD組大鼠BALF中白細胞計數(shù)、肺泡平均截距均顯著上調(diào)，放射狀肺泡計數(shù)顯著下調(diào)（P＜0.05）。與BPD 組比較，阿奇霉素組和布地奈德組大鼠的白細胞計數(shù)、肺泡平均截距均顯著下調(diào)，放射狀肺泡計數(shù)顯著上調(diào)（P＜0.05）。阿奇霉素組與布地奈德組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠BALF 中白細胞計數(shù)、放射狀肺泡計數(shù)及肺泡平均截距比較（±s）

表2 各組大鼠BALF 中白細胞計數(shù)、放射狀肺泡計數(shù)及肺泡平均截距比較（±s）

a：與NC組比較，P＜0.05；b：與BPD組比較，P＜0.05。

組別NC組BPD組阿奇霉素組布地奈德組FP白細胞計數(shù)（n＝10）/（×107 L－1）26.27±0.96 146.93±4.67a 71.53±2.90b 68.27±2.91b 3 819.510＜0.000 1肺泡平均截距（n＝5）/μm 39.93±1.75 54.40±2.29a 39.87±1.13b 40.93±1.83b 233.332＜0.000 1放射狀肺泡計數(shù)（n＝5）/個11.00±1.00 4.80±0.41a 10.27±0.88b 10.53±0.92b 182.804＜0.000 1

3.3 大鼠BALF中炎癥因子水平變化

與NC 組比較，BPD 組大鼠BALF 中TNF-α、IL-6、IL-1β水平均顯著上調(diào)（P＜0.05）。與BPD組比較，阿奇霉素組和布地奈德組大鼠BALF 中TNF-α、IL-6、IL-1β水平均顯著下調(diào)（P＜0.05）。阿奇霉素組與布地奈德組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠BALF 中TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平比較（±s，n＝10）

表3 各組大鼠BALF 中TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平比較（±s，n＝10）

a：與NC組比較，P＜0.05；b：與BPD組比較，P＜0.05。

組別NC組BPD組阿奇霉素組布地奈德組FP IL-1β/（pg/mg）246.10±24.41 832.13±71.53a 269.00±31.13b 259.10±35.56b 622.849＜0.000 1 TNF-α/（ng/mg）0.89±0.07 1.89±0.08a 1.12±0.04b 1.12±0.04b 778.641＜0.000 1 IL-6/（ng/mg）0.55±0.05 1.29±0.11a 0.61±0.05b 0.61±0.03b 394.143＜0.000 1

3.4 大鼠BALF中氧化應(yīng)激指標(biāo)變化

與NC組比較，BPD組大鼠BALF中SOD、CAT水平均顯著下調(diào)，MDA水平顯著上調(diào)（P＜0.05）。與BPD組比較，阿奇霉素組和布地奈德組大鼠BALF 中SOD、CAT 水平均顯著上調(diào)，MDA 水平顯著下調(diào)（P＜0.05）。阿奇霉素組與布地奈德組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表4。

表4 各組大鼠BALF 中SOD、MDA 和CAT 水平比較（±s，n＝10）

表4 各組大鼠BALF 中SOD、MDA 和CAT 水平比較（±s，n＝10）

a：與NC組比較，P＜0.05；b：與BPD組比較，P＜0.05。

組別NC組BPD組阿奇霉素組布地奈德組FP CAT/（U/mg）80.67±11.34 44.39±7.20a 72.62±9.96b 75.15±10.15b 41.365＜0.000 1 SOD/（U/mg）121.23±11.11 75.11±8.24a 114.37±9.23b 116.89±9.86b 73.397＜0.000 1 MDA/（nmol/mg）5.78±0.34 9.85±1.12a 5.90±0.40b 5.75±0.42b 144.138＜0.000 1

3.5 大鼠肺組織中VEGF、HIF-1α和HIF-2α mRNA表達變化

與NC 組比較，BPD 組大鼠肺組織中VEGF、HIF-1α、HIF-2α mRNA 相對表達量均顯著下調(diào)（P＜0.05）。與BPD組比較，阿奇霉素組和布地奈德組大鼠肺組織中VEGF、HIF-1α、HIF-2α mRNA 相對表達量均顯著上調(diào)（P＜0.05）。阿奇霉素組與布地奈德組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見圖2。

圖2 各組大鼠肺組織中VEGF、HIF-1α 和HIF-2α mRNA表達比較（n＝10）

3.6 大鼠肺組織中VEGF、HIF-1α和HIF-2α蛋白表達變化

與NC 組比較，BPD 組大鼠肺組織中VEGF、HIF-1α、HIF-2α 蛋白表達量均顯著下調(diào)（P＜0.05）。與BPD組比較，阿奇霉素組和布地奈德組大鼠肺組織中VEGF、HIF-1α、HIF-2α 蛋白表達量均顯著上調(diào)（P＜0.05）。阿奇霉素組與布地奈德組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見圖3。

圖3 各組大鼠肺組織中VEGF、HIF-1α 和HIF-2α 蛋白表達比較

4 討論

BPD發(fā)生機制較復(fù)雜，早產(chǎn)兒出生后就存在肺發(fā)育不全的情況，加之吸入高濃度氧氣，這就顯著提高了早產(chǎn)兒BPD 的發(fā)生風(fēng)險[7]。早產(chǎn)兒發(fā)生BPD 后可對其兒童及青春期的肺功能產(chǎn)生不同程度的影響，胎齡越小的早產(chǎn)兒，這兩個時期的肺功能損傷率就越高[6]。目前人們公認吸入高濃度氧氣可導(dǎo)致活性氧、自由基及促炎因子表達顯著上調(diào)，對發(fā)育過程中的肺組織造成破壞并影響其修復(fù)，最終引發(fā)BPD[8―9]。中性粒細胞浸潤及TNF-α、IL-6、IL-1β 等促炎因子的大量釋放在BPD 發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[10]。本研究通過將大鼠置于高濃度氧氣中暴露14 d的方式構(gòu)建BPD模型，取其肺組織，經(jīng)HE 染色后發(fā)現(xiàn)，BPD 大鼠肺組織發(fā)生明顯損傷，肺泡融合變大且間隔不均勻，肺泡數(shù)量顯著降低，有明顯的炎癥細胞浸潤；除此之外，BPD 大鼠BALF 中白細胞計數(shù)、肺泡平均截距和TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA水平均顯著上調(diào)，放射狀肺泡計數(shù)和SOD、CAT 水平均顯著下調(diào)，這提示BPD大鼠建模成功。

阿奇霉素具有較強的抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用，在降低肺功能損傷及感染方面效果顯著；與其他大環(huán)內(nèi)酯類抗生素不同的是，阿奇霉素可參與抑制內(nèi)部形式半酮羧酸醛反應(yīng)[11]。研究顯示，阿奇霉素在促進嗜酸性粒細胞及白細胞凋亡等過程中作用顯著，同時亦可對白細胞趨化活性產(chǎn)生影響，并阻止外周血中性粒細胞分泌活性氧簇，降低組胺水平，最終發(fā)揮抗炎作用[6，11]。既往報道顯示，預(yù)防性使用阿奇霉素可有效降低機械通氣早產(chǎn)兒BPD 的發(fā)生及死亡風(fēng)險[12]。布地奈德作為一種糖皮質(zhì)激素藥物，已廣泛應(yīng)用于多種肺部疾病的治療，具有高效的局部抗炎作用，在改善支氣管炎、哮喘及防治BPD中發(fā)揮重要作用，因此本研究將布地奈德作為陽性對照藥。本研究結(jié)果顯示，與BPD 組比較，阿奇霉素組和布地奈德組大鼠肺組織中出現(xiàn)的BPD 病理癥狀均有所改善，BALF中白細胞計數(shù)、肺泡平均截距和TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA水平均顯著下調(diào)，放射狀肺泡計數(shù)和SOD、CAT水平均顯著上調(diào)，這說明阿奇霉素可改善因高濃度氧所致的BPD大鼠模型肺組織損傷，抑制炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)。

HIF-1α 及HIF-2α 均屬于轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可參與缺氧過程并發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠吸入高濃度氧后可抑制其末梢氣道上皮細胞中HIF-2α/VEGF/VEGF受體信號通路激活，并下調(diào)VEGF 表達，抑制肺泡化進程，最終參與BPD發(fā)生[13]。本研究結(jié)果顯示，與NC組比較，BPD組大鼠肺組織中VEGF、HIF-1α、HIF-2α mRNA相對表達量及蛋白表達量均顯著下調(diào)，說明在BPD發(fā)生發(fā)展過程中HIF-1α/HIF-2α/VEGF信號通路的激活被抑制；而經(jīng)阿奇霉素干預(yù)后，BPD 大鼠肺組織中上述指標(biāo)均被逆轉(zhuǎn)，這提示阿奇霉素可能通過激活HIF-1α/HIF-2α/VEGF 信號通路來改善BPD 大鼠模型肺組織損傷，抑制炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)，進而發(fā)揮肺保護作用。

綜上所述，阿奇霉素可明顯改善新生大鼠BPD的不良癥狀，抑制炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)，其作用機制可能是通過激活HIF-1α/HIF-2α/VEGF信號通路來實現(xiàn)肺保護作用。