光皮木瓜特征圖譜及3種黃酮類成分含量測(cè)定研究 Δ

朱田密 ，陳樹(shù)和 ，嚴(yán)勁松 ，王新桂 ，段雨晴 ，楊孝義 （.湖北省中醫(yī)院/湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院/湖北省中醫(yī)藥研究院藥事部，武漢 43006；.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，武漢 430065）

光皮木瓜是薔薇科木瓜屬植物木瓜Chaenomeles sinensis（Thouin） Koehne 的成熟或近成熟果實(shí)，又名榠楂、木李[1―2]，因果皮干燥后仍光滑，不皺，故稱“光皮木瓜”[1]。其果實(shí)清香，味酸、澀，性平，具有和胃舒筋、祛風(fēng)除濕、消痰止咳之功效[2]，可藥食兩用，易與皺皮木瓜[薔薇科木瓜屬植物貼梗海棠C.speciosa（Sweet） Nakai 的果實(shí)]混淆[3]。光皮木瓜含有豐富的黃酮類、有機(jī)酸類、揮發(fā)油、萜類、生物酶以及維生素C、粗纖維等成分，具有抗氧化、抗菌消炎、抗過(guò)敏以及保護(hù)神經(jīng)等多種活性[4―6]。光皮木瓜在我國(guó)有著悠久的藥用史和栽培史，其藥品標(biāo)準(zhǔn)已被湖南、湖北、陜西等地的中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)或炮制規(guī)范收載。關(guān)于光皮木瓜的質(zhì)量控制，目前僅少數(shù)省份的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了總黃酮、總有機(jī)酸的含量。近年來(lái)，雖也有光皮木瓜中齊墩果酸、熊果酸含量測(cè)定的文獻(xiàn)報(bào)道和指紋圖譜研究，但未指認(rèn)化學(xué)成分，或僅指認(rèn)圖譜中的1～2種成分[7―9]。筆者前期經(jīng)薄層色譜已鑒別出光皮木瓜中含有綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷，并且發(fā)現(xiàn)光皮木瓜中含有的黃酮類成分比皺皮木瓜多[10]。為此，本文采用高效液相色譜（HPLC）法建立光皮木瓜的特征圖譜及3種黃酮類成分（蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷）的含量測(cè)定方法，以期更全面地控制光皮木瓜質(zhì)量。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括Waters e2695型HPLC儀（美國(guó)Waters 公司）、ES 225SM-DR 型電子天平（瑞士Precisa 公司）、KQ-500VDE 型雙頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器有限公司）、FW177型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）、UPT-Ⅱ-10T型超純水器（成都超純科技有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

綠原酸對(duì)照品（批號(hào)110753-202018，純度96.1%）、蘆丁對(duì)照品（批號(hào)100080-202012，純度91.6%）、金絲桃苷對(duì)照品（批號(hào)111521-201809，純度94.9%）、槲皮苷對(duì)照品（純度111538-202007，純度93.5%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

光皮木瓜藥材、皺皮木瓜藥材均由湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陳科力教授鑒定，分別為薔薇科木瓜屬植物木瓜C.sinensis（Thouin） Koehne的干燥果實(shí)，薔薇科木瓜屬植物貼梗海棠C.speciosa（Sweet） Nakai 的干燥果實(shí)。樣品與植物標(biāo)本保存于湖北省中醫(yī)藥研究院，具體來(lái)源信息見(jiàn)表1。

表1 光皮木瓜和皺皮木瓜樣品的來(lái)源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC特征圖譜的建立

2.1.1 色譜條件

以Agilent 5 TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱；以乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～5 min，10%A→20%A；5～28 min，20%A→30%A；28～32 min，30%A→90%A；32～36 min，90%A；36～44 min，90%A→10%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm，輔以全波長(zhǎng)掃描210～400 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

2.1.2 供試品溶液的制備

取樣品藥材粉末（過(guò)3 號(hào)篩）約1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率400 W，頻率45 kHz）處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.1.3 對(duì)照品溶液的制備

稱取綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷對(duì)照品8.02、9.28、8.70、9.26 mg，精密稱定，分別置于25 mL 容量瓶中，用甲醇溶解至刻度，配成質(zhì)量濃度分別為308.29、340.02、330.25、346.32 μg/mL的單一對(duì)照品溶液。分別精密吸取以上4種單一對(duì)照品溶液1.0、2.0、0.2、1.3 mL，置于同一25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，再精密吸取2 mL，置于5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，配成綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷質(zhì)量濃度分別為4.93、10.88、1.06、7.20 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.1.4 精密度試驗(yàn)

取編號(hào)為S2 的光皮木瓜藥材粉末，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次。以蘆丁為參照峰，計(jì)算得到各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.33%（n＝6），相對(duì)峰面積的RSD均小于2.91%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取編號(hào)為S2 的光皮木瓜藥材粉末，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于制備后0、2、6、12、18 h時(shí)按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以蘆丁為參照峰，計(jì)算得到各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD 均小于0.52%（n＝5），相對(duì)峰面積的RSD均小于3.52%（n＝5），表明供試品溶液在室溫下放置18 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取編號(hào)為S2 的光皮木瓜藥材粉末，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6 份，再按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以蘆丁為參照峰，計(jì)算得到各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.21%（n＝6），相對(duì)峰面積的RSD均小于3.73%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.1.7 光皮木瓜特征圖譜的建立與相似度評(píng)價(jià)

分別精密稱取15 批光皮木瓜藥材（編號(hào)S1～S15）粉末1.0 g，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。將15批樣品的色譜圖以AIA文件格式導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》，以圖譜輪廓較為典型的S1為參照?qǐng)D譜，采用多點(diǎn)校正法進(jìn)行匹配，以平均數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜（R）。樣品疊加圖譜和對(duì)照指紋圖譜見(jiàn)圖1。將15批樣品與對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，15 批樣品共確定了11 個(gè)特征峰，相似度為0.783～0.969，表明15批樣品的相似度良好，化學(xué)成分具有一致性。

圖1 15批光皮木瓜藥材的HPLC圖譜和對(duì)照指紋圖譜（R）

2.1.8 色譜峰的指認(rèn)及相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的計(jì)算

在15批光皮木瓜藥材的共有峰中選擇11個(gè)峰作為特征峰，通過(guò)與混合對(duì)照品溶液圖譜（圖2）中各峰的保留時(shí)間及紫外吸收光譜進(jìn)行比對(duì)，共指認(rèn)出4種成分，分別是1 號(hào)峰綠原酸、2 號(hào)峰蘆丁、3 號(hào)峰金絲桃苷、8 號(hào)峰槲皮苷。其中2號(hào)峰的峰面積與保留時(shí)間適中，故以其為參照峰計(jì)算其他特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 15批光皮木瓜特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.1.9 不同地區(qū)光皮木瓜藥材的差異分析

使用SPSS 23.0軟件對(duì)15批光皮木瓜藥材HPLC特征圖譜的10個(gè)特征峰[2號(hào)峰～11號(hào)峰，由于1號(hào)峰綠原酸在同一產(chǎn)地的不同樣品中亦可發(fā)生較大變化（如樣品S1 和S2 中，S3 和S4 中），故不納入產(chǎn)地差異分析]的峰面積進(jìn)行聚類分析，采用組間連接法，以余弦距離為度量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行聚類，當(dāng)余弦距離大于15時(shí)，15批樣品聚為2類：S5～S8為一類，其他為一類（圖3）。S5～S8來(lái)自湖北省建始縣和房縣，其特征是11號(hào)峰顯著，而其他批次樣品中該色譜峰較微弱，其中S3、S12～S15樣品中均未檢出該峰，故特征圖譜在一定程度上反映了產(chǎn)地差異。

圖3 15批光皮木瓜藥材的聚類分析樹(shù)狀圖

2.1.10 光皮木瓜與皺皮木瓜的特征圖譜比較

皺皮木瓜是光皮木瓜最常見(jiàn)的混淆品，二者為同科同屬近緣種，故以皺皮木瓜藥材（編號(hào)S16～S22）與光皮木瓜藥材進(jìn)行對(duì)比。按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備7批皺皮木瓜的供試品溶液，再按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖（圖4）。對(duì)比光皮木瓜對(duì)照指紋圖譜（R）與皺皮木瓜的特征圖譜發(fā)現(xiàn)，兩種藥材存在明顯差異：7批皺皮木瓜的HPLC 圖譜中也含有綠原酸色譜峰（1 號(hào)峰），且極為顯著，遠(yuǎn)高于光皮木瓜，同時(shí)還含有較弱的2號(hào)峰（蘆丁）以及4 號(hào)峰；除了S20 樣品檢出微弱的3 號(hào)峰（金絲桃苷），其他6批皺皮木瓜中均未檢出3號(hào)峰；此外，7批皺皮木瓜均未檢出5～11號(hào)峰。

圖4 光皮木瓜對(duì)照指紋圖譜（R）和皺皮木瓜藥材的HPLC色譜圖譜

2.2 3種黃酮類成分的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

除檢測(cè)波長(zhǎng)為350 nm，其余色譜條件同“2.1.1”項(xiàng)。

2.2.2 供試品溶液的制備

供試品溶液的制備方法同“2.1.2”項(xiàng)。

2.2.3 對(duì)照品溶液的制備蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷混合對(duì)照品溶液的制備方法，除不加綠原酸對(duì)照品，其余同“2.1.3”項(xiàng)。

2.2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密吸取“2.2.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液和“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液各10 μL，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示，蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷的色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論板數(shù)以蘆丁計(jì)不低于10 000。結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 混合對(duì)照品溶液和供試品溶液的HPLC圖

2.2.5 線性關(guān)系考察

分別精密稱取蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷對(duì)照品適量，用甲醇配成蘆丁質(zhì)量濃度分別為54.40、21.76、5.44、2.18、0.87、0.44 μg/mL，金絲桃苷質(zhì)量濃度分別為10.57、4.23、1.06、0.42、0.17、0.08 μg/mL，槲皮苷質(zhì)量濃度分別為27.71、11.08、2.77、1.11、0.44、0.22 μg/mL 的系列混合對(duì)照品溶液。按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，以各對(duì)照品的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 3種待測(cè)成分的回歸方程與線性范圍

2.2.6 定量限與檢測(cè)限考察

精密量取“2.2.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，用甲醇倍比稀釋后，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以信噪比10∶1、3∶1分別計(jì)算定量限、檢測(cè)限。結(jié)果顯示，蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷的定量限分別為0.13、0.08、0.07 μg/mL；檢測(cè)限分別為0.04、0.02、0.02 μg/mL。

2.2.7 精密度試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)S2），按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次。結(jié)果顯示，蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷峰面積的RSD 分別為1.53%、4.21%、2.90%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取編號(hào)為S2 的光皮木瓜藥材粉末，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于制備后0、2、6、12、18 h時(shí)按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示，蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷峰面積的RSD 分別為2.50%、4.05%、3.67%（n＝5），表明供試品溶液于室溫放置18 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取編號(hào)為S2 的光皮木瓜藥材粉末，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6 份，再按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，代入回歸方程計(jì)算含量。結(jié)果顯示，蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷含量的RSD 分別為2.66%、4.46%、4.11%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn)

取編號(hào)為S2的已知含量的光皮木瓜藥材粉末6份，每份0.5 g，精密稱定，分別按已知含量的1∶1加入蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷對(duì)照品，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示，蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷的加樣回收率分別為89.85%～94.83%、94.63%～103.94%、94.76%～101.96%，RSD 分別為2.17%、3.46%、2.92%（n＝6）。

2.2.11 樣品含量測(cè)定

取15 批光皮木瓜藥材和7 批皺皮木瓜藥材，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，代入回歸方程計(jì)算含量，每批樣品測(cè)2次。結(jié)果顯示，光皮木瓜藥材中蘆丁含量高于皺皮木瓜藥材，且皺皮木瓜藥材中均未檢出金絲桃苷（S20樣品除外）和槲皮苷。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 15 批光皮木瓜藥材和7 批皺皮木瓜藥材中3 種黃酮類成分的含量測(cè)定結(jié)果（μg/g，n＝2）

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

綠原酸與黃酮類均是光皮木瓜藥材的特征性成分，特征圖譜的檢測(cè)波長(zhǎng)選擇330 nm，能夠兼顧顯示這兩類成分。經(jīng)全波長(zhǎng)掃描發(fā)現(xiàn)，光皮木瓜藥材中大多數(shù)黃酮類成分的最大吸收波長(zhǎng)位于350 nm附近，故含量測(cè)定選取檢測(cè)波長(zhǎng)為350 nm，且所受其他色譜峰的干擾最小，能滿足含量測(cè)定的要求。

3.2 光皮木瓜特征圖譜差異的影響因素

各特征峰在不同樣品中的相對(duì)保留時(shí)間一致，但相對(duì)峰面積差異較大（表2），可能是由樣品中次生代謝產(chǎn)物表達(dá)量的高低不同所致，該現(xiàn)象在中藥材特征圖譜中較為常見(jiàn)。光皮木瓜藥材的特征圖譜除了與產(chǎn)地有一定關(guān)系（見(jiàn)“2.1.9”項(xiàng)），還受果實(shí)個(gè)體差異和批次的影響，例如S1與S2來(lái)自同一產(chǎn)地，二者的特征圖譜中前段色譜峰強(qiáng)弱不同，但中段（黃酮類）色譜峰強(qiáng)弱很相似；此外還可能受加工方式的影響，例如筆者對(duì)湖北省鄖陽(yáng)區(qū)產(chǎn)的S1、S2鮮果采取了不同的加工方式（S1為鮮果剖開(kāi)后直接曬干，S2為鮮果剖開(kāi)后用沸水燙后曬干），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二者的特征圖譜前段顯示色譜峰強(qiáng)弱有差別。

3.3 光皮木瓜和皺皮木瓜藥材中黃酮類成分含量比較

本文比較了15 批光皮木瓜藥材與7 批皺皮木瓜藥材中黃酮類成分的含量，結(jié)果顯示，光皮木瓜藥材中黃酮類成分的種類和含量均較皺皮木瓜藥材多，與季榮進(jìn)等[11]進(jìn)行的黃酮理化鑒別結(jié)果“皺皮木瓜顯天藍(lán)色熒光，光皮木瓜顯鮮黃色熒光”一致，且與筆者前期報(bào)道結(jié)果一致[10]。

綜上所述，本研究所建立的光皮木瓜的特征圖譜和3種黃酮類成分的含量測(cè)定方法可用于光皮木瓜的質(zhì)量控制及其與皺皮木瓜的鑒別。