基于GABA能神經(jīng)系統(tǒng)探究淫羊藿次苷Ⅱ的抗抑郁作用及機制 Δ

熊庭旺 ，張 玨 ，孫成新 ，尹彩霞 ，陳 犀 ，陳發(fā)菊 （.遵義醫(yī)藥高等專科學?？蒲刑帲F州 遵義 56006；.遵義醫(yī)藥高等?？茖W校藥學系，貴州 遵義 56006；.遵義醫(yī)科大學藥學院，貴州 遵義 56006；.貴州省中國科學院天然產(chǎn)物化學重點實驗室，貴陽 5500）

抑郁癥是以心境障礙、快感缺失為主要癥狀的一種精神、心理障礙性疾病，嚴重損害個人身心健康。目前全球抑郁癥患者已超過2.6 億，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢，給家庭和社會帶來沉重負擔[1]?，F(xiàn)有抗抑郁藥物大多存在治愈率不高、副反應較多、患者停藥后易復發(fā)等不足。中醫(yī)藥文化歷史悠久，中藥資源豐富；同時，中藥具有多成分、多靶點、綜合治療的特點，且多數(shù)中藥安全范圍較廣，因此以中藥為基礎挖掘防治抑郁癥的新藥是近年來抗抑郁研究的一大熱點[2]。

淫羊藿為小檗科植物淫羊藿EpimediumbrevicornuMaxim.、箭葉淫羊藿Epimediumsagittatum（Sieb. et Zucc.）Maxim.、柔毛淫羊藿EpimediumpubescensMaxim.或朝鮮淫羊藿EpimediumkoreanumNakai 的干燥葉，為臨床常用中藥，具有補腎陽、強筋骨、祛風濕等功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，淫羊藿對心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等均有調(diào)節(jié)作用[3]。淫羊藿次苷Ⅱ（icariside Ⅱ，ICSⅡ）是淫羊藿的主要活性成分之一，對缺血性腦卒中和阿爾茨海默病模型動物具有較好的神經(jīng)保護作用[3―4]。

γ 氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是機體重要的抑制性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)之一，參與了神經(jīng)元分化、遷移等過程；GABA能神經(jīng)系統(tǒng)是目前抗抑郁研究的重要新靶點之一，降低谷氨酸（glutamic acid，Glu）含量、增加GABA含量對抑郁癥具有積極的改善作用[5]。本研究綜合考慮ICSⅡ及其他有效成分的抗抑郁、抗精神分裂作用[6]，擬采用慢性不可預知溫和應激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）法復制小鼠抑郁模型[7]，基于GABA能神經(jīng)系統(tǒng)初步探究ICSⅡ的抗抑郁活性及潛在機制，以期為該成分的進一步開發(fā)利用，以及以中醫(yī)藥為基礎抗抑郁新藥的研發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究使用的主要儀器有ZH-OFT型曠場行為學系統(tǒng)、ZH-QPT型強迫游泳實驗系統(tǒng)、ZH-XWT型懸尾實驗系統(tǒng)（安徽正華生物儀器設備有限公司），TP1020型自動組織脫水機、EG1150 型組織包埋機、CM2245 型輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機、DM6M 型光學顯微鏡（德國Leica 公司），iMark 型酶標儀、1658001 型電泳儀、GelDoc XR 型凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

ICSⅡ?qū)φ掌罚ㄅ?13558-15-9，經(jīng)高效液相色譜法檢測純度不低于98%）購自成都德思特生物技術(shù)有限公司；草酸艾司西酞普蘭片[簡稱“ECS”，陽性對照藥，批號2202210，規(guī)格5 mg（以C20H21FN2O計）]由山東京衛(wèi)制藥有限公司生產(chǎn)；甲苯胺藍染料（批號220220618）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號PC0020）均購自北京索萊寶科技有限公司；GABA 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（批號JL13490）、Glu ELISA試劑盒（批號JL13490）均購自南京建成生物工程研究所；兔β-肌動蛋白（β-actin）多克隆抗體（批號31662984）購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；小鼠GABA A 受體α1[GABA A receptor alpha 1，GABA（A）Rα1]單克隆抗體（批號ab94585）、兔GABA囊泡轉(zhuǎn)運體（vesicular GABA transporter，VGAT）多克隆抗體（批號ab42939）、小鼠谷氨酸脫羧酶67（glutamate decarboxylase 67，GAD67）單克隆抗體（批號ab26116）均購自英國Abcam 公司；兔GABA（B）R1 多克隆抗體（批號#3835）、兔GABA膜轉(zhuǎn)運體3（GABA membranal transporter-3，GAT-3）多克隆抗體（批號#25438）均購自美國Cell Signaling Technology 公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 二抗（批號21002）、辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG二抗（批號21005）均購自艾比瑪特醫(yī)藥科技（上海）有限公司；ECL顯影劑（批號16929851）購自美國GE Healthcare公司。

1.3 實驗動物

SPF級昆明小鼠60只，雄性，體重18～22 g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（京）2019-0010。所有小鼠均飼養(yǎng)于每12 h 光照/黑暗循環(huán)、室溫22～25 ℃、相對濕度50%～60%的環(huán)境下，自由進食、飲水。實驗操作嚴格遵循實驗動物倫理標準，實驗方案經(jīng)遵義醫(yī)藥高等?？茖W校科技倫理委員會審批（編號ZMPC-2308-001）。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將小鼠分為對照組（C 組，10 只）和造模組（50 只），造模組小鼠采用CUMS 法（含禁食、禁水、晝夜顛倒、光電刺激等刺激因素）造模，具體參照文獻方法[8]實施。刺激21 d后，將造模組小鼠隨機分為抑郁模型組（NS 組）、陽性對照藥組（ECS 組）和ICSⅡ低、中、高劑量組（ICSⅡ-L、ICSⅡ-M、ICSⅡ-H 組），每組10 只。ICSⅡ-L、ICSⅡ-M、ICSⅡ-H 組小鼠分別灌胃10、20、30 mg/（kg·d）的ICSⅡ，ECS 組小鼠灌胃15 mg/（kg·d）的ECS，C 組和NS組小鼠灌胃等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)14 d。各藥物組劑量參照Yan 等[7]研究設置，以生理鹽水為溶劑。

2.2 小鼠行為學檢測

2.2.1 糖水偏愛率

于給藥第10天開始糖水訓練，即將各組小鼠單籠飼養(yǎng)，給予1%蔗糖溶液進行適應性訓練48 h，期間定時交換蔗糖溶液和水的位置以防止位置偏愛。訓練結(jié)束后禁水24 h，再于籠中放入1%蔗糖溶液和水各1 瓶，中途交換蔗糖溶液和水的位置1次。記錄24 h內(nèi)蔗糖溶液和水的消耗量，并按下式計算各組小鼠的糖水偏愛率：糖水偏愛率＝蔗糖溶液消耗量/（蔗糖溶液消耗量+水消耗量）×100%[8]。

2.2.2 運動總距離

末次給藥1 h后進行曠場實驗。將小鼠于曠場箱固定角落以頭朝上沿箱壁放入，觀察其5 min 內(nèi)的活動情況并記錄運動總距離。每只小鼠測試結(jié)束后清理曠場箱并以乙醇擦拭，待揮干后，再進行下次測試。

2.2.3 靜止不動時間

（1）懸尾實驗：末次給藥4 h后進行懸尾實驗。將醫(yī)用膠帶粘于小鼠尾根2～3 cm 處，將小鼠固定并倒掛在懸尾實驗架上，觀察其5 min 內(nèi)的活動情況并記錄靜止不動時間（以小鼠放棄掙扎視為靜止不動）。每只小鼠測試結(jié)束后清理地面糞便并以乙醇擦拭，待揮干后，再進行下次測試。

（2）強迫游泳實驗：末次給藥10 h 后進行強迫游泳實驗。將小鼠以頭朝上沿強迫游泳實驗桶桶壁放入水（水溫約25 ℃）中，觀察其5 min內(nèi)在水中的活動情況并記錄靜止不動時間（以小鼠放棄掙扎視為靜止不動）。每3只小鼠實驗后換水1次。

2.3 小鼠海馬組織病理形態(tài)學觀察

行為學實驗結(jié)束后，將小鼠麻醉并脫頸椎處死，采用尼氏染色法觀察小鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)及尼氏體情況。隨機選取每組4只小鼠的全腦組織，置于多聚甲醛溶液中固定；取出，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片、撈片、烤片、脫蠟、沖洗后，滴加甲苯胺藍染色液于60 ℃下染色15 min；沖洗、脫水、透明后封片，使用光學顯微鏡觀察各組小鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元及尼氏體的形態(tài)，并對結(jié)構(gòu)完整的神經(jīng)元進行數(shù)量統(tǒng)計。

2.4 小鼠海馬組織中GABA、Glu含量測定

取各組剩余6 只小鼠的部分海馬組織，加入生理鹽水適量，冰上勻漿、離心后取上清液，采用ELISA法以酶標儀檢測其GABA、Glu 含量，并計算GABA/Glu 的比值。上述檢測嚴格按照相應試劑盒說明書操作。

2.5 小鼠海馬組織中GABA能神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)蛋白表達水平檢測

采用Western blot法進行檢測。取“2.4”項下各組小鼠的剩余海馬組織，于冰上勻漿并提取蛋白，以BCA法定量后進行變性處理。取變性蛋白適量，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)膜、封閉；洗膜后，加入β-actin、GABA（A）Rα1、GABA（B）R1、GAD67、GAT-3、VGAT一抗（稀釋比例均為1∶1 000），孵育過夜；再次洗膜后，加入相應二抗（稀釋比例均為1∶2 000），孵育2 h；洗膜后，加入ECL 顯影劑顯影，并置于凝膠成像系統(tǒng)下成像。使用Quantity One軟件計算目的蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin）的灰度值比值，以表示目的蛋白的表達水平（結(jié)果以C組為參照進行歸一化處理）。

2.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗（方差齊）或Dunnett’sT3檢驗（方差不齊）。檢驗水準α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 ICSⅡ?qū)π∈笮袨閷W的影響

3.1.1 糖水偏愛率

與C 組比較，NS 組小鼠的糖水偏愛率顯著降低（P＜0.05）；與NS 組比較，各藥物組小鼠的糖水偏愛率均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖1A。

圖1 ICSⅡ?qū)π∈笮袨閷W的影響（±s，n＝10）

3.1.2 運動總距離

與C 組比較，NS 組小鼠的運動總距離顯著縮短（P＜0.05）；與NS組比較，ECS組和ICSⅡ-H組小鼠的運動總距離均顯著延長（P＜0.05）。結(jié)果見圖1B。

3.1.3 靜止不動時間

與C 組比較，NS 組小鼠懸尾實驗和強迫游泳實驗的靜止不動時間均顯著延長（P＜0.05）；與NS 組比較，各藥物組小鼠上述實驗的靜止不動時間均顯著縮短（P＜0.05）。結(jié)果見圖1C、1D。

3.2 ICSⅡ?qū)π∈蠛ｑR組織病理形態(tài)的影響

與C 組比較，NS 組小鼠海馬CA3 區(qū)的神經(jīng)元形態(tài)不規(guī)則，細胞核深染、固縮明顯，尼氏體（呈藍色，下同）減少，結(jié)構(gòu)完整的神經(jīng)元數(shù)量顯著減少（P＜0.05）；與NS組比較，各藥物組小鼠海馬CA3 區(qū)的神經(jīng)元均排列整齊、結(jié)構(gòu)完整清晰，尼氏體增多，結(jié)構(gòu)完整的神經(jīng)元數(shù)量均顯著增加（P＜0.05）。結(jié)果見圖2、圖3A。

圖2 ICSⅡ?qū)π∈蠛ｑR組織病理形態(tài)的影響（標尺＝50 μm）

圖3 ICSⅡ?qū)π∈蠛ｑRCA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)量和海馬組織中GABA、Glu含量及比值的影響

3.3 ICSⅡ?qū)π∈蠛ｑR組織中GABA、Glu含量的影響

與C 組比較，NS 組小鼠海馬組織中GABA 含量和GABA/Glu 比值均顯著降低（P＜0.05），Glu 含量顯著升高（P＜0.05）；與NS 組比較，各藥物組小鼠海馬組織中GABA 含量和GABA/Glu 比值均顯著升高（P＜0.05），Glu含量均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖3B～3D。

3.4 ICSⅡ?qū)π∈蠛ｑR組織中GABA 能神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)蛋白表達的影響

與C組比較，NS組小鼠海馬組織中GABA（A）Rα1、GABA（B）R1、GAD67、GAT-3、VGAT 蛋白的表達水平均顯著降低（P＜0.05）；與NS 組比較，各藥物組小鼠海馬組織中GABA（A）Rα1（ICSⅡ-L組除外）、GABA（B）R1（ICSⅡ-H 組除外）、GAD67、GAT-3（ICSⅡ-L、ICSⅡ-M組除外）、VGAT蛋白的表達水平均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖4。

圖4 ICSⅡ?qū)π∈蠛ｑR組織中GABA能神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)蛋白表達的影響

4 討論

CUMS 由光電刺激、噪聲刺激、夾尾、禁食、禁水等多種刺激因素組成，是模擬人類長期遭遇壓力、挫折致抑郁的常用動物模型，其操作簡便且造模成功率高[8―9]。經(jīng)CUMS 刺激后，動物表現(xiàn)出快感缺失、行為絕望及自發(fā)活動減少等特征[8]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)CUMS 誘導后，NS組小鼠的糖水偏愛率顯著降低，曠場實驗的運動總距離顯著縮短，懸尾實驗和強迫游泳實驗的靜止不動時間均顯著延長，表明其出現(xiàn)了明顯的快感缺失、行為絕望特征，提示造模成功。經(jīng)ICSⅡ干預后，小鼠上述行為得到了不同程度的改善，提示ICSⅡ具有一定的抗抑郁活性。

尼氏體是神經(jīng)元的特征性結(jié)構(gòu)之一，能被甲苯胺藍等堿性染料染成藍色或藍紫色。當神經(jīng)元受到刺激時，尼氏體會減少，其尼氏染色切片顏色較淺[10]。研究指出，長期應激刺激最先受損的大腦核團是海馬組織[10]。因此，本研究采用尼氏染色法觀察了小鼠海馬CA3區(qū)的受損情況，結(jié)果顯示，NS 組小鼠神經(jīng)元明顯丟失，細胞核深染、固縮增多，變性壞死增加，尼氏體減少，完整的神經(jīng)元數(shù)量顯著減少，與既往文獻報道基本一致[1，10]。經(jīng)ICSⅡ干預后，各藥物組小鼠神經(jīng)元的損傷情況明顯減輕，完整的神經(jīng)元數(shù)量均顯著增多，提示ICSⅡ?qū)UMS 所致的小鼠海馬神經(jīng)元損傷具有明顯的改善作用。

GABA和Glu分別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性和興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。GABA以Glu為底物，在GAD的作用下合成，后經(jīng)中間神經(jīng)元釋放，進而參與神經(jīng)元的遷移、分化及神經(jīng)環(huán)路形成[7]。研究表明，抑郁患者腦內(nèi)GABA能中間神經(jīng)元丟失，GABA含量降低，Glu含量增加，GABA、Glu含量嚴重失衡，GABA的轉(zhuǎn)運速率降低，重攝取的GABA 增加，突觸間隙的GABA 減少；同時，GABA受體表達下調(diào)，呈現(xiàn)出GABA能神經(jīng)系統(tǒng)功能低下的狀態(tài)[7，11]?？挂钟羲幬锟赏ㄟ^增加GABA 含量，調(diào)節(jié)GABA 的合成、釋放、轉(zhuǎn)運及受體相關(guān)蛋白的表達等方式來發(fā)揮對實驗動物抑郁癥狀的改善作用[7，12]。本研究結(jié)果顯示，NS 組小鼠海馬組織中Glu 含量顯著升高，GABA 含量和GABA/Glu 比值均顯著降低，GABA 能神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)蛋白GAD67、GAT-3、VGAT蛋白的表達均顯著下調(diào)；經(jīng)ICSⅡ干預后，小鼠上述大部分指標均得以逆轉(zhuǎn)，提示ICSⅡ?qū)ABA能神經(jīng)系統(tǒng)有一定的調(diào)節(jié)作用。

GABA（B）R在突觸前、后膜均有分布，GABA（B）R、GABA（A）R 是多種抗精神疾病藥物的重要靶點，阻斷或敲除GABA（B）R 編碼基因能促進神經(jīng)元增殖，同時上調(diào)GABA（B）R、GABA（A）R 蛋白及基因的表達與藥物抗抑郁作用的積極發(fā)揮密切相關(guān)[7，13]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)CUMS 誘導后，小鼠海馬組織中GABA（A）Rα1、GABA（B）R1 蛋白的表達均顯著下調(diào)；經(jīng)藥物干預后，ECS 組和ICSⅡ-M、ICSⅡ-H 組小鼠海馬組織中GABA（A）Rα1 蛋白，以及ECS 組和ICSⅡ-L、ICSⅡ-M組小鼠海馬組織中GABA（B）R1 蛋白的表達均顯著上調(diào)。但需注意的是，ICSⅡ-H 組小鼠海馬組織中GABA（B）R1 蛋白的表達水平與NS 組接近，這可能與不同（劑量）藥物對GABA（B）R的影響有所差異相關(guān)[13]：陽性對照藥和低、中劑量的ICSⅡ可能通過上調(diào)突觸后膜GABA（B）R 的表達來發(fā)揮受體后效應，從而激活GABA 能神經(jīng)系統(tǒng)，最終發(fā)揮積極的抗抑郁作用；而高劑量的ICSⅡ則可能通過下調(diào)突觸前膜GABA（B）R的表達，從而使GABA 的重攝取減少、突觸間隙GABA含量增加，最終發(fā)揮改善小鼠抑郁樣行為的積極作用，但具體機制有待后續(xù)研究進一步驗證。

綜上所述，ICSⅡ能夠改善抑郁模型小鼠的抑郁樣行為，其機制可能與調(diào)節(jié)GABA、Glu 平衡，增加GABA的合成、轉(zhuǎn)運、釋放及調(diào)節(jié)相關(guān)受體的表達進而改善GABA 能神經(jīng)系統(tǒng)功能有關(guān)。本課題組下一步將采用不同的抑郁模型圍繞抑郁癥的其他發(fā)病機制，并結(jié)合體內(nèi)、體外實驗方法充分論證ICSⅡ的抗抑郁作用。