代謝工程產(chǎn)2′-巖藻糖基乳糖的研究

涂班策,黃廣文,黃明珠,2,劉斌,陳雪嵐,2*

1(江西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 國(guó)家淡水魚(yú)加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心,江西 南昌, 330027) 2(江西師范大學(xué) 健康學(xué)院,江西 南昌, 330027)

對(duì)于剛出生的嬰幼兒來(lái)說(shuō),母乳是一種重要的營(yíng)養(yǎng)資源。它不僅給新生兒提供生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),而且對(duì)新生兒腸道微生物和免疫系統(tǒng)的發(fā)育有著重要影響。人乳低聚糖(human milk oligosaccharide,HMOs)作為人乳中最關(guān)鍵的碳水化合物,在其中發(fā)揮著重要的作用。迄今,已發(fā)現(xiàn)超200種HMOs,其中2′-巖藻糖基乳糖(2′-fucosyllactose,2′-FL)是母乳中含量最豐富的人乳低聚糖,約占其總含量的30%[1],在人母乳中的含量達(dá)到2 g/L[2],其結(jié)構(gòu)如圖1所示[3]。研究表明,2′-FL可以在嬰兒腸道上皮細(xì)胞上形成一種糖脂類似物,競(jìng)爭(zhēng)性地和病原菌結(jié)合,從而抑制病原菌對(duì)嬰兒機(jī)體的侵染[4-5],如2′-FL能降低導(dǎo)致嬰兒腹瀉的主要原因之一的空腸彎曲桿菌對(duì)腸上皮細(xì)胞的侵染,效率達(dá)到80%。2′-FL的發(fā)酵產(chǎn)物,包括乳酸和一些短鏈脂肪酸,可以調(diào)節(jié)腸道pH值,從而提高乳酸菌和雙歧桿菌在腸道的定殖能力,并協(xié)同發(fā)揮抗炎作用[6];此外2′-FL對(duì)腸道細(xì)胞和呼吸道上皮細(xì)胞的黏附有明顯的抑制作用[7],且發(fā)現(xiàn)嬰兒感染人體免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)的存活率與母乳中2′-FL的含量有關(guān)。因此,美國(guó)食品和藥物管理局和歐洲食品安全局先后批準(zhǔn)其成為嬰幼兒配方食品及兒童和成人健康食品中的有益制劑[8]。

鑒于此,2′-FL作為營(yíng)養(yǎng)健康與藥用的功能性食品成分受到了極大的關(guān)注,越來(lái)越多的科研人員投入到對(duì)2′-FL生產(chǎn)研究中。本文對(duì)2′-FL的合成方法、生物合成途徑及構(gòu)建高產(chǎn)工程菌的策略等進(jìn)行了綜述,以期為相關(guān)研究者提供參考。

圖1 2′-FL結(jié)構(gòu)示意圖[3]Fig.1 Structural of 2′-FL[3]

1 2′-FL的合成

1.1 2′-FL的合成方法

目前合成2′-FL的方法有4種,包括直接提純法、化學(xué)合成法、酶促合成法及微生物合成法[9],這幾種方法的優(yōu)缺點(diǎn)具體見(jiàn)表1。從表1中比較可看到,目前已知最高效環(huán)保的方法就是微生物生產(chǎn)2′-FL,而且微生物合成的2′-FL與天然的2′-FL功能相同,臨床試驗(yàn)也不會(huì)引起不良反應(yīng)。此外微生物合成法與上述其他3種方法相比,生產(chǎn)2′-FL 的方法更加方便快捷,合成過(guò)程不會(huì)添加有毒試劑,大大提高了產(chǎn)物的安全性,且成本低廉,合成底物可以是葡萄糖和甘油等。因此微生物合成法生產(chǎn)2′-FL成為研究熱點(diǎn)。

表1 2′-FL的合成方法Table 1 Synthesis methods of 2′-FL

1.2 2′-FL的生物合成途徑

2′-FL的微生物合成是在α-1,2-巖藻糖及轉(zhuǎn)移酶的作用下,將巖藻糖殘基從GDP-巖藻糖轉(zhuǎn)移到乳糖上,因此GDP-巖藻糖是合成2′-FL的重要前體物質(zhì)。在微生物內(nèi)合成2′-FL有2條代謝途徑,分別是從頭合成途徑(denovo)和補(bǔ)救途徑(salvage)[17]。合成途徑如圖2所示。

GDP-巖藻糖的從頭合成途徑始于果糖-6-磷酸,然后經(jīng)過(guò)甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶(ManA)、磷酸甘露糖變位酶(ManB)、甘露糖-1-磷酸鳥(niǎo)苷酸轉(zhuǎn)移酶(ManC)、GDP-甘露糖4,6-脫水酶(Gmd)和GDP-L-巖藻糖合成酶(WcaG)等一系列酶的催化反應(yīng)。合成的GDP-巖藻糖在1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FT)的作用下使GDP-巖藻糖轉(zhuǎn)化成最終產(chǎn)物2′-FL[18]。

圖2 2′-FL的合成途徑Fig.2 Metabolic pathway for 2′-FL biosynthesis

而補(bǔ)救合成途徑則是通過(guò)外源添加GDP-巖藻糖,然后經(jīng)過(guò)雙功能酶[19](Fkp)-巖藻糖激酶和GDP-巖藻糖焦磷酸化酶的作用形成前體物質(zhì)GDP-巖藻糖,再經(jīng)過(guò)1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶催化合成2′-FL。補(bǔ)救合成途徑只需要經(jīng)過(guò)2個(gè)酶的作用即可形成最終產(chǎn)物,比從頭合成途徑方便快捷。但前體物質(zhì)GDP-巖藻糖的價(jià)格極高,造成成本很高。因此大部分研究都是通過(guò)從頭合成途徑來(lái)產(chǎn)生2′-FL[20]。

2 從頭合成途徑提高2′-FL產(chǎn)量的策略

2.1 GDP-巖藻糖的積累

GDP-巖藻糖是2′-FL合成的關(guān)鍵前體,因此提高GDP-巖藻糖的在胞內(nèi)的積累能有效提高2′-FL的產(chǎn)量。

大腸桿菌作為最簡(jiǎn)單的模式生物之一,且其自身能內(nèi)源性合成GDP-巖藻糖,使大腸桿菌成為2′-FL合成研究里最常用的宿主[21-22]。在大腸桿菌中,RcsA是大腸桿菌可拉酸合成的正向轉(zhuǎn)錄因子,GDP-巖藻糖合成途徑上的基因,包括manB、manC和gmd、wacG都受到rcsA基因的正向調(diào)控,因此,rcsA的過(guò)表達(dá)能上調(diào)合成GDP-巖藻糖的基因。但是RcsA會(huì)被溫度敏感的ATP依賴性蛋白Lon迅速降解,因此在大腸桿菌中敲除lon基因能提高胞內(nèi)GDP-巖藻糖的積累[23-24]。對(duì)于不能內(nèi)源性合成GDP-巖藻糖宿主,如谷氨酸棒桿菌[25]、枯草芽孢桿菌[26-27]和釀酒酵母菌[28]等。則需要引入外源基因,構(gòu)建一條合成GDP-巖藻糖的通路。在報(bào)道的通過(guò)從頭合成途徑生產(chǎn)GDP-巖藻糖的策略中,共同過(guò)表達(dá)4個(gè)基因,包括manB、manC和gmd、wacG,有利于前體物質(zhì)GDP-巖藻糖的積累。LI等[29]利用不同拷貝的質(zhì)粒過(guò)表達(dá)manB、manC和gmd、wacG4個(gè)基因,發(fā)現(xiàn)高拷貝質(zhì)粒中的manB和wacG的轉(zhuǎn)錄水平比低拷貝高出11.8和12倍,細(xì)胞內(nèi)GDP-巖藻糖的量相比也有明顯提高,最終2′-FL的產(chǎn)量提高到1.45 g/L,提高了70.6%。表明提高這些基因的表達(dá)量能有效促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)前體物質(zhì)GDP-巖藻糖的積累,前體物質(zhì)積累量提高,2′-FL產(chǎn)量也會(huì)隨之提高。LI等[30]也通過(guò)對(duì)加強(qiáng)上述4個(gè)基因的表達(dá)水平提高了GDP-巖藻糖的產(chǎn)量,使之從0.2 mg/L達(dá)到了11.2 mg/L。因此,提高GDP-巖藻糖是促進(jìn)2′-FL產(chǎn)量的一個(gè)重要策略。

2.2 競(jìng)爭(zhēng)模塊的調(diào)控

為了最大化使代謝物流向目標(biāo)途徑而不被其他路徑分流,很多研究者都著手調(diào)控競(jìng)爭(zhēng)路徑的基因[31]。如在大腸桿菌中GDP-巖藻糖會(huì)在wacJ表達(dá)的UDP-葡萄糖脂質(zhì)載體轉(zhuǎn)移酶的作用下生成與細(xì)胞壁合成有關(guān)的可拉酸,因此wacJ基因的失活明顯提高了2′-FL的產(chǎn)量[30]。2′-FL另一個(gè)前體物質(zhì)為乳糖,有效地利用乳糖亦是生產(chǎn)2′-FL的重要因素之一。在生命體內(nèi),乳糖會(huì)被β-半乳糖苷酶水解成葡萄糖和半乳糖,因此敲除胞內(nèi)編碼β-半乳糖苷酶的基因能有效減少乳糖的消耗。

除了上述描繪的直接影響前體物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)途徑,糖酵解和PPP途徑某種意義上來(lái)說(shuō)也是影響產(chǎn)物的競(jìng)爭(zhēng)模塊。細(xì)胞需要生長(zhǎng),代謝流需要流向糖酵解、PPP等途徑;細(xì)胞需要生產(chǎn),代謝流則需要流向生產(chǎn)代謝途徑。但是細(xì)胞的生產(chǎn)離不開(kāi)細(xì)胞的生長(zhǎng),細(xì)胞足夠的生長(zhǎng)量是生產(chǎn)的前提。而單獨(dú)的刪除或弱化糖酵解途徑基因會(huì)極大地影響細(xì)胞的生長(zhǎng),因此平衡細(xì)胞的生長(zhǎng)和終產(chǎn)物的積累,即實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)調(diào)控策略成為科研工作者的思考[32]。如WU等[31]利用一個(gè)雙功能的溫度傳感器,通過(guò)控制不同的溫度來(lái)調(diào)控不同基因的表達(dá)量。在細(xì)胞前期生長(zhǎng)階段時(shí),提高糖酵解和PPP途徑的表達(dá)量而抑制生產(chǎn)途徑基因的表達(dá);在細(xì)胞生長(zhǎng)到平穩(wěn)期時(shí)則抑制生長(zhǎng)途徑相關(guān)的基因而提高生產(chǎn)途徑基因的表達(dá)[33],作者通過(guò)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的不同時(shí)期動(dòng)態(tài)調(diào)控不同模塊基因的表達(dá),經(jīng)過(guò)18 h搖瓶發(fā)酵,使2′-FL的產(chǎn)量從356.5 mg/L顯著增加到了1 399.5 mg/L,極大的提高了2′-FL產(chǎn)量。因此,合理地通過(guò)動(dòng)態(tài)調(diào)控生長(zhǎng)和生產(chǎn)的平衡是提高2′-FL生產(chǎn)的一個(gè)有效策略。

2.3 α-1,2-FT的高效表達(dá)

無(wú)論是從頭合成途徑或補(bǔ)救途徑,都需要在合成途徑的關(guān)鍵限速酶α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(α-1,2-FT)的作用下使前體物質(zhì)最終變成2′-FL。然而,微生物來(lái)源的α-1,2-FT活性是一般代謝酶的1%,且該酶的水溶性較差,因此在合成2′-FL的過(guò)程中,篩選出高活性的α-1,2-FT及提高該酶的溶解性是積累2′-FL的重要手段。HUANG等[23]挑選了10個(gè)來(lái)源不同物種的α-1,2-FT進(jìn)行實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)在這10個(gè)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶中來(lái)自幽門(mén)螺旋桿菌的α-1,2-FT效果最好。并且在目前研究中該酶也是使用最多的酶。但是,該酶的溶解性依舊處于一個(gè)非常低的水平,因此研究者們還采用各種手段來(lái)設(shè)法提高α-1,2-FT的溶解性。

早在大腸桿菌中已經(jīng)證實(shí)表達(dá)標(biāo)簽的使用能提高α-1,2-FT的表達(dá)量,用GST、脂肪酶前肽、麥芽糖結(jié)合蛋白和富含天冬氨酸的小肽來(lái)標(biāo)記FT,都有助于此酶在大腸桿菌中的溶解性[34-35]。因此,科研工作者進(jìn)一步研究了不同標(biāo)簽對(duì)FT功能的影響。HOLLANDS等[28]在FutC酶上添加了一段SUMOstar?標(biāo)簽,發(fā)現(xiàn)含有帶標(biāo)簽的FutC酶的耶式酵母中2′-FL的產(chǎn)量比未帶標(biāo)簽的高出30%,產(chǎn)量近60 mmol/L。WAN等[36]在利用短肽RIDD-RIAD將Fkp和FutC酶組裝成多酶復(fù)合物來(lái)提高2′-FL產(chǎn)量時(shí),發(fā)現(xiàn)其中短肽RIDD也能提高FutC酶的溶解性,并且2′-FL的產(chǎn)量相比原始菌株有了顯著提高,達(dá)到了1.2 g/L,比不帶標(biāo)簽的產(chǎn)量提高約50%。這表明,可以探索更多的融合標(biāo)簽來(lái)提高α-1,2-FT的溶解性。

2.4 輔因子的再生

NADPH和GTP是參與生物能量和碳代謝的重要輔助因子,有助于維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡。目前,加強(qiáng)與代謝產(chǎn)物相關(guān)的內(nèi)源性輔助因子已成為提高工業(yè)微生物化學(xué)品產(chǎn)量的有效方法。因此加強(qiáng)2′-FL代謝途徑中所需要的NADPH和GTP的再生也能有效提高2′-FL的產(chǎn)量[37]。其中NADPH的主要來(lái)源是磷酸戊糖途徑(PPP途徑),因此過(guò)表達(dá)PPP途徑中的關(guān)鍵基因可以促進(jìn)NADPH的生成。

在合成過(guò)程中由甘露糖-1-磷酸到GDP-甘露糖的合成過(guò)程需要消耗一個(gè)GTP,因此GTP作為合成過(guò)程的一個(gè)關(guān)鍵輔因子,不僅為代謝過(guò)程提供能源物質(zhì),也作為GDP的一個(gè)供體,因此提高GTP的供給能有效的促進(jìn)2′-FL代謝途徑。LI等[29]在大腸桿菌中共同過(guò)表達(dá)gsk和zwf基因促進(jìn)了GTP和NADPH的再生,得到的重組菌中2′-FL的產(chǎn)量達(dá)到了2.24 g/L,相較于對(duì)照菌產(chǎn)量提高了53.8%。而GTP的代謝調(diào)控與鳥(niǎo)苷酸激酶(GMK)、核苷二磷酸(NDK)和黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(XPT)3個(gè)酶息息相關(guān)。研究表明,過(guò)表達(dá)ndk和gmk可以優(yōu)化GTP供應(yīng)并提高2′-FL的產(chǎn)量。如YU[38]通過(guò)啟動(dòng)子動(dòng)態(tài)調(diào)控GTP供應(yīng)模塊來(lái)加強(qiáng)GTP的供應(yīng),在枯草芽孢桿菌中過(guò)表達(dá)GTP供應(yīng)模塊中的基因gmk和ndk,使得2′-FL的產(chǎn)量達(dá)到了1 839.7 mg/L,相較未過(guò)表達(dá)的菌株2′-FL產(chǎn)量提高了31.5%。

2.5 2′-FL的輸出

對(duì)于所有的宿主菌,大部分的2′-FL都存在細(xì)胞內(nèi),而胞內(nèi)積累過(guò)多的2′-FL可能會(huì)通過(guò)反饋?zhàn)饔脕?lái)抑制2′-FL的產(chǎn)生,從而影響2′-FL的產(chǎn)量[39-40]。因此,篩選一個(gè)合適的糖轉(zhuǎn)運(yùn)體也是很重要的。HOLLANDS[28]通過(guò)篩選27個(gè)糖轉(zhuǎn)運(yùn)體,通過(guò)檢測(cè)發(fā)酵液中2′-FL的產(chǎn)量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)來(lái)自大腸桿菌的SetA和粗糙脈孢菌的纖維糊精轉(zhuǎn)運(yùn)體CDT2能夠較好地將2′-FL從酵母細(xì)胞中輸出。

3 結(jié)論與討論

2′-FL在嬰幼兒的健康及發(fā)育中起著重要的作用,其化學(xué)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,可通過(guò)母乳直接提取、化學(xué)合成、酶促合成以及微生物生產(chǎn)4種方式獲得;而微生物合成由于其安全經(jīng)濟(jì)等優(yōu)勢(shì),成為研究者所關(guān)注的熱點(diǎn)。微生物高效合成2′-FL有5個(gè)關(guān)鍵部分需要關(guān)注,包括GDP-巖藻糖的生產(chǎn)、競(jìng)爭(zhēng)途徑的調(diào)控、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的選擇、輔因子的供給以及2′-FL的排出,表2對(duì)上述采用這5種策略的科研工作進(jìn)行了總結(jié)。在早期研究中,大部分只是通過(guò)過(guò)表達(dá)或者敲除等常規(guī)方式來(lái)調(diào)控基因的表達(dá),但在不同的生長(zhǎng)時(shí)期所需要調(diào)控的基因并不相同,例如在前期細(xì)胞生長(zhǎng)階段,更期望細(xì)胞專注于自身生長(zhǎng);而在細(xì)胞趨于成熟后,則調(diào)控細(xì)胞成為生產(chǎn)的工廠,生產(chǎn)所需要的終產(chǎn)物。因此在改造微生物工廠時(shí),要獲得終產(chǎn)物高產(chǎn)和細(xì)胞工廠數(shù)量的平衡,選擇一個(gè)合適的動(dòng)態(tài)調(diào)控的方式可能是一個(gè)較好的策略。此外,大多數(shù)研究都引用了外源質(zhì)粒,而質(zhì)粒的引入需要抗生素篩選,但抗生素的使用在食品安全生產(chǎn)中存在風(fēng)險(xiǎn),因此盡量避免質(zhì)粒的運(yùn)用,將外源基因直接整合到基因組會(huì)是更為安全可靠的策略。此外,大腸桿菌由于能直接合成GDP-巖藻糖而被大多數(shù)研究者所青睞,但大腸桿菌會(huì)有產(chǎn)內(nèi)毒素的風(fēng)險(xiǎn),因此選用更為安全的食品級(jí)微生物作為工程菌來(lái)生產(chǎn)2′-FL將會(huì)更有前景。

表2 生產(chǎn)2′-FL工程菌株的構(gòu)建Table 2 Construction of Engineered Strains for 2′-FL Production