液相色譜-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜法測(cè)定針葉櫻桃粉中抗壞血酸的碳穩(wěn)定同位素比值

王道兵,馮迪,曹翠峰,鐘其頂,3*,翟鵬貴,武竹英, 岳紅衛(wèi),童玲,張燚,洪玉玲,張紅霞,徐勝,張洛琪

1(國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管技術(shù)創(chuàng)新中心(輕工消費(fèi)品質(zhì)質(zhì)量安全),北京,100015) 2(中輕技術(shù)創(chuàng)新中心有限公司,北京,100015)3(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司,北京,100015) 4(養(yǎng)生堂藥業(yè)有限公司,海南 ?？?570216)5(農(nóng)夫山泉股份有限公司,浙江 杭州,310024)

L-抗壞血酸,又稱(chēng)維生素C,在水果和蔬菜中含量豐富,是一種重要的水溶性抗氧化劑[1],參與膠原蛋白、細(xì)胞間質(zhì)和神經(jīng)遞質(zhì)的合成,有助于改善機(jī)體免疫系統(tǒng)功能[2]。由于人體不能合成維生素C,需要依靠膳食水果和蔬菜等攝入每日的必需量。針葉櫻桃被認(rèn)為是天然維生素C之王,它是一種產(chǎn)于中美洲至南美洲北部的水果,深受消費(fèi)者青睞,由于其富含抗壞血酸,常被用作天然抗壞血酸的典型來(lái)源[3]?？箟难岙a(chǎn)品有著廣闊的市場(chǎng)前景,針葉櫻桃是我國(guó)天然維生素C產(chǎn)品的主要原料,由于巨大的市場(chǎng)需求,針葉櫻桃粉主要依靠北美、歐洲和日本等國(guó)家進(jìn)口。近年來(lái)在針葉櫻桃粉相關(guān)產(chǎn)品中摻入合成抗壞血酸的事件時(shí)有發(fā)生,盡管添加了工業(yè)合成的抗壞血酸,但仍聲稱(chēng)是天然抗壞血酸,該行為造成消費(fèi)者利益受損,行業(yè)信譽(yù)度損失。因此,亟需建立一種高精度快速檢測(cè)抗壞血酸產(chǎn)品中外源添加合成抗壞血酸的分析方法。

穩(wěn)定同位素技術(shù)是當(dāng)前國(guó)際食品摻假鑒別領(lǐng)域打擊假冒偽劣產(chǎn)品有效的科技手段之一[4]。該技術(shù)具有常規(guī)理化方法不可比擬的優(yōu)越性,已經(jīng)通過(guò)該技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)葡萄酒[5-6]、調(diào)味品[7-10]、油脂[11-14]、蜂蜜[15-17]等食品的摻假鑒別、質(zhì)量評(píng)價(jià)及產(chǎn)地溯源。目前,國(guó)內(nèi)尚無(wú)利用穩(wěn)定同位素技術(shù)對(duì)抗壞血酸測(cè)定的相關(guān)研究,國(guó)外已陸續(xù)有應(yīng)用元素分析-同位素比值質(zhì)譜(elemental analysis-stable isotope ratio mass spectrometry, EA-IRMS)和氣相色譜-燃燒-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜(gas chromatography-combustion-stable isotope ratio mass spectrometry, GC-C-IRMS)對(duì)橘子汁、針葉櫻桃汁中抗壞血酸穩(wěn)定同位素比值進(jìn)行測(cè)定[18-19]的報(bào)道。EA-IRMS適合全樣品檢測(cè),前處理步驟繁瑣復(fù)雜;GC-C-IRMS測(cè)定抗壞血酸需要衍生化,對(duì)操作人員的要求較高。本文首次采用液相色譜-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜法對(duì)樣品中抗壞血酸在線分離并準(zhǔn)確測(cè)定其δ13C值,具有操作簡(jiǎn)單、無(wú)需衍生化、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品遵循同等處理原則(principle of identical treatment, PIT)的優(yōu)勢(shì)。

本研究擬建立利用穩(wěn)定同位素技術(shù)鑒別天然來(lái)源和合成來(lái)源抗壞血酸的碳穩(wěn)定同位素特征。建立液相色譜穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜(liquid chromatography-stable isotope ratio mass spectrometry, LC-IRMS)準(zhǔn)確測(cè)定抗壞血酸δ13C值的方法,對(duì)方法進(jìn)行了優(yōu)化及驗(yàn)證。探究了天然和合成來(lái)源抗壞血酸的碳穩(wěn)定同位素差異,以實(shí)現(xiàn)對(duì)天然抗壞血酸產(chǎn)品真實(shí)性的準(zhǔn)確測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

7個(gè)不同品牌的維生素C片,從電商旗艦店購(gòu)買(mǎi),研磨后備用;19個(gè)不同濃度、不同地區(qū)的針葉櫻桃粉從廠家直接購(gòu)買(mǎi)。L-抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品,純度≥99.8%,購(gòu)自上海葉源生物科技有限公司;

IAEA-CH-6蔗糖[δ13CPDB=(-10.449±0.2)‰],奧地利維也納國(guó)際原子能機(jī)構(gòu),作為碳穩(wěn)定同位素比值分析的參考物質(zhì);濃硫酸(優(yōu)級(jí)純)、磷酸(優(yōu)級(jí)純)和過(guò)硫酸鈉(Na2S2O8, 純度≥99%),國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Flash 2000元素分析儀配有Conflo IV接口、LC端(LC IsoLink+ConFlo IV)、Delta V Advantage穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀(isotope ratio mass spectrometry,IRMS),美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;十萬(wàn)分之一天平,瑞士Mettler-Toledo公司;渦旋振蕩器,北京科偉永興儀器有限公司。

1.3 前處理方法

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.500 g樣品加入50 mL超純水渦旋振蕩,過(guò)0.45 μm水系濾膜,移取200 μL稀釋至抗壞血酸含量0.10～0.50 g/L后保存試樣,吸取1 mL至棕色進(jìn)樣小瓶LC-IRMS測(cè)定抗壞血酸δ13C值。

1.4 EA-IRMS測(cè)定條件

EA-IRMS直接測(cè)定抗壞血酸純品的碳穩(wěn)定同位素比率。EA-IRMS儀器的氧化管溫度為960 ℃,還原管溫度為650 ℃,氣相色譜柱爐溫為50 ℃,氦氣流速為100 mL/min,準(zhǔn)確稱(chēng)取0.2～0.3 mg樣品,每個(gè)樣品平行測(cè)定2次。進(jìn)行樣品測(cè)試時(shí),每個(gè)樣品的分析起始和結(jié)尾階段通入CO2參考?xì)?用于對(duì)進(jìn)樣過(guò)程穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)。

1.5 LC-IRMS測(cè)定條件

LC-IRMS測(cè)定樣品中抗壞血酸的δ13C值。

色譜條件:色譜柱為Syncronis C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm);流動(dòng)相為水-pH 2硫酸溶液 (90∶10, 體積比),流速0.250 mL/min;柱溫30 ℃,進(jìn)樣體積10 μL。磷酸溶液和過(guò)二硫酸鈉溶液作為反應(yīng)助劑,流速0.050 mL/min,反應(yīng)爐溫度99.5 ℃,將色譜在線分離的有機(jī)物轉(zhuǎn)換成CO2。

質(zhì)譜條件:離子源為電子轟擊離子源(EI源);掃描方式為正離子掃描;氦氣壓力為0.4 MPa;離子源電壓為9.488 kV;真空度為2.6×10-6mBar。每次測(cè)定樣品前后分別測(cè)定3次CO2標(biāo)準(zhǔn)參考?xì)?每次20 s)。

1.6 數(shù)據(jù)校正與計(jì)算

穩(wěn)定同位素比率的計(jì)算是將已知同位素比率的標(biāo)準(zhǔn)品作為參考,計(jì)算未知樣本穩(wěn)定同位素比率的相對(duì)值,結(jié)果以(千分差,‰)表示,按公式(1)計(jì)算:

δ13C=(R樣品/R標(biāo)準(zhǔn)-1)×1 000

(1)

式中:R樣品,樣品中重同位素與輕同位素的豐度比,即13C/12C;R標(biāo)準(zhǔn),國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)美國(guó)南卡羅萊納州白堊系Pee Dee組擬箭石化石(pee dee belemnite,PDB)的碳重同位素與輕同位素的豐度比。本研究選擇IAEA-CH-6[δ13CPDB=(-10.449±0.2)‰]作為實(shí)際測(cè)定中的參考物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果由Isodat 3.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和計(jì)算,Excel分析數(shù)據(jù),Origin 2019軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

LC-IRMS在線將目標(biāo)物和其他物質(zhì)分開(kāi),并將目標(biāo)物中碳元素轉(zhuǎn)化成CO2測(cè)定,要求流動(dòng)相不含有機(jī)溶劑,對(duì)流速、柱溫等也有要求,相比常規(guī)液相在應(yīng)用上存在一定局限性。因此,實(shí)驗(yàn)首先建立LC-IRMS測(cè)定抗壞血酸δ13C值的液相方法的優(yōu)化。

2.1.1 流動(dòng)相選擇

LC-IRMS要求色譜流動(dòng)相不含甲醇等有機(jī)洗脫液,因此實(shí)驗(yàn)選擇純水-pH2硫酸溶液體系探究流動(dòng)相比例對(duì)目標(biāo)峰的分離度的情況。以抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品為研究對(duì)象,選擇流動(dòng)相水-pH2硫酸溶液分別以體積比為100、90∶10、80∶20的配制比例測(cè)定,出峰情況見(jiàn)圖1。流動(dòng)相為100%純水時(shí),目標(biāo)峰的出峰時(shí)間相對(duì)提前,且抗壞血酸峰較寬,分離度差(圖1-a);改變流動(dòng)相水-pH2硫酸溶液的體積比至90∶10時(shí),能顯著改善峰形,峰分離度較好(圖1-b);再增加硫酸溶液體積比至80∶20時(shí),出峰時(shí)間稍稍延遲,與流動(dòng)相體積比90∶10相比,峰形無(wú)明顯差異(圖1-c)。綜合考慮,選擇流動(dòng)相水-pH2硫酸溶液體積比為90∶10作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的條件。

2.1.2 柱溫及流速選擇

柱溫越高,色譜分離過(guò)程會(huì)加快,通常效率也會(huì)更高,但存在一些樣品混合物共洗脫的可能性[20],且抗壞血酸水溶液存在遇熱易氧化的特性。因此,LC-IRMS測(cè)定關(guān)鍵組分的在線分離,選擇合適的柱溫度控制是必要的。實(shí)驗(yàn)以抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品為研究對(duì)象,選擇25、30、35、40、45 ℃的梯度溫度,在每個(gè)梯度下對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)3次測(cè)定,探究柱溫對(duì)δ13C值測(cè)定的影響。由表1可知,在25～35 ℃,抗壞血酸δ13C值的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)偏差≤0.06‰,說(shuō)明測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定且不同溫度時(shí)的測(cè)定結(jié)果也無(wú)明顯差異,而由于樣品遇熱易氧化特性,在色譜柱溫度較高的情況下,δ13C值測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)偏差較大。故綜合考慮實(shí)驗(yàn)選取30 ℃作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的柱溫條件。

表1 色譜柱溫度對(duì)抗壞血酸δ13C值測(cè)定的影響Table 1 Effect of column temperature on determination of δ13C value of ascorbic acid

一般流速越高,出峰時(shí)間越快,樣品測(cè)定時(shí)間越短。LC-IRMS由于流動(dòng)相為水溶液體系,在色譜柱中滯黏度較高,故流速不宜太快。以抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品為研究對(duì)象,研究在0.200～0.450 mL/min流速內(nèi)δ13C測(cè)定值(n=3)的變化特征。由表2可知,隨著流速提高,出峰時(shí)間提前,抗壞血酸的δ13C值測(cè)定結(jié)果較穩(wěn)定,因此在實(shí)際分析中可在0.200～0.450 mL/min范圍內(nèi)任意設(shè)定一個(gè)流速參數(shù)?？紤]到隨著流速增加,色譜柱柱壓逐漸增高,為了延長(zhǎng)色譜柱的壽命及分析效率,本方法選擇0.250 mL/min作為流動(dòng)相流速。

綜上,LC-IRMS測(cè)定抗壞血酸的δ13C值的分析條件為:Syncronis C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)色譜柱,流動(dòng)相為水-pH2硫酸溶液(90∶10, 體積比),色譜柱溫度30 ℃,流速0.250 mL/min,進(jìn)樣量10 μL,抗壞血酸在980 s左右出峰。選擇一款針葉櫻桃粉樣品按照1.3節(jié)前處理?xiàng)l件水解后,1.4節(jié)方法進(jìn)行測(cè)定,測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1-d,抗壞血酸目標(biāo)峰與其他峰可以完全分離準(zhǔn)確測(cè)定。

表2 流速對(duì)抗壞血酸δ13C值測(cè)定的影響Table 2 Effect of flow rate on determination of δ13C value of ascorbic acid

a-流動(dòng)相為100% H2O的標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖; b-流動(dòng)相為90% H2O和10% PH2 H2SO4溶液的標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖; c-流動(dòng)相為80% H2O和20%PH2 H2SO4的標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖; d-色譜條件優(yōu)化后對(duì)針葉櫻桃粉樣品測(cè)定的色譜圖圖1 不同條件下抗壞血酸色譜圖Fig.1 The peak chromatogram of ascorbic acid under different conditions

2.2 方法準(zhǔn)確性驗(yàn)證

由于缺少抗壞血酸碳穩(wěn)定同位素的參考物質(zhì),因而不能直接測(cè)量參考物質(zhì)的形式對(duì)LC-IRMS測(cè)定抗壞血酸δ13C值的準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證。為了探究建立的LC-IRMS測(cè)定抗壞血酸δ13C值過(guò)程是否發(fā)生同位素分餾,選擇抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品為研究對(duì)象,分別使用本章建立的LC-IRMS測(cè)定方法和文獻(xiàn)中報(bào)道的EA-IRMS方法進(jìn)行處理后測(cè)定(n=5),測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知,采用本方法測(cè)定的抗壞血酸δ13C值與EA-IRMS測(cè)定方法相比,測(cè)定結(jié)果的差值均小于0.25%,說(shuō)明LC-IRMS方法測(cè)定抗壞血酸δ13C值準(zhǔn)確有效,液相色譜在線分離提取抗壞血酸與參考物質(zhì)時(shí)遵循同等轉(zhuǎn)化原則。

表3 LC-IRMS和EA-IRMS測(cè)定抗壞血酸δ13C值的比較 單位:‰

2.3 方法精密度驗(yàn)證

以抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品和針葉櫻桃粉為研究對(duì)象,按照1.3節(jié)步驟前處理后在重復(fù)條件下分別測(cè)定δ13C值,連續(xù)測(cè)定6次,在再現(xiàn)性條件下,5 d內(nèi)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品完成6次獨(dú)立測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表4。可見(jiàn)測(cè)定抗壞血酸δ13C的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.06‰～0.15‰,說(shuō)明該方法滿足抗壞血酸δ13C檢測(cè)要求。

表4 LC-IRMS測(cè)定抗壞血酸δ13C的重復(fù)性和再現(xiàn)性(n=6) 單位:‰

2.4 不同來(lái)源抗壞血酸碳穩(wěn)定同位素比值測(cè)定

從市面上隨機(jī)購(gòu)買(mǎi)了不同產(chǎn)地的合成維生素C片和針葉櫻桃粉共26個(gè)產(chǎn)品,用LC-IRMS測(cè)定并分析不同來(lái)源抗壞血酸同位素特征,測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。不同產(chǎn)地的合成來(lái)源維生素C片δ13C值為-11.74‰～-10.28‰,而天然針葉櫻桃粉中抗壞血酸δ13C值為-25.00‰～-22.01‰,兩者具有顯著的碳同位素分布特征(圖2)。本方法檢測(cè)天然和合成來(lái)源抗壞血酸的δ13C值數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)一致[19]。

從現(xiàn)有數(shù)據(jù)來(lái)看,產(chǎn)地對(duì)合成來(lái)源維生素C的δ13C值分布無(wú)影響,且維生素C的生產(chǎn)過(guò)程使用了C4植物糖作為起始材料。合成維生素C的方式主要有化學(xué)合成法和發(fā)酵法,市售的抗壞血酸大多為發(fā)酵法生產(chǎn),該法具有經(jīng)濟(jì)、安全、可大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)勢(shì)。發(fā)酵法主要以D-葡萄糖、山梨糖等為原料,并加入假單胞桿菌等進(jìn)行發(fā)酵,發(fā)酵完成后,進(jìn)行提取和精制等步驟以獲得精品維生素C。因此,可根據(jù)天然來(lái)源的抗壞血酸δ13C值分布規(guī)律鑒別產(chǎn)品中的抗壞血酸是否存在外源添加的現(xiàn)象。

表5 不同來(lái)源樣品中抗壞血酸的δ13C值Table 5 δ13C values of ascorbic acid in samples from different sources

圖2 天然和合成來(lái)源抗壞血酸δ13C值分布圖Fig.2 Distribution of δ13C value of ascorbic acid from natural and synthetic sources

3 結(jié)論與討論

本研究基于穩(wěn)定同位素技術(shù)在食品摻假鑒別領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用基礎(chǔ),建立了LC-IRMS測(cè)定針葉櫻桃粉中抗壞血酸的δ13C值的方法,標(biāo)準(zhǔn)品和樣品遵循同等處理原則,在發(fā)生同位素分餾的情況下仍能對(duì)碳穩(wěn)定同位素比值準(zhǔn)確測(cè)定。該方法具有前處理方法簡(jiǎn)單、測(cè)定時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn),方法的精密度和準(zhǔn)確性較好。在實(shí)際樣品分析中,實(shí)現(xiàn)了天然和合成來(lái)源抗壞血酸的有效分離測(cè)定,豐富了抗壞血酸相關(guān)產(chǎn)品的檢測(cè)和鑒別技術(shù),有助于保障消費(fèi)者利益,維護(hù)相關(guān)產(chǎn)品的市場(chǎng)公平競(jìng)爭(zhēng)。