嗜酸乳桿菌與枯草芽孢桿菌協(xié)同發(fā)酵玉米淀粉糖渣

李少雷,陳旭升,張宏建,王靚,張建華*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122) 2(江南大學(xué),工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室,江蘇 無錫,214122)

玉米淀粉糖渣是玉米淀粉液化、糖化后壓濾得到的殘渣,其含有豐富的還原糖、蛋白質(zhì)和膳食纖維等成分。根據(jù)姚宇晨等[1]的預(yù)測,到2023年,我國玉米淀粉糖產(chǎn)量將超過2 400萬t。相應(yīng)地,預(yù)計每年將產(chǎn)生大約200萬t的糖渣。目前,多數(shù)企業(yè)直接將糖渣作為飼料原料進(jìn)行銷售,但由于糖渣適口性差且含有營養(yǎng)限制因子,導(dǎo)致糖渣的飼喂效率較低[2]。

利用微生物發(fā)酵能夠提升蛋白含量、改善風(fēng)味、消除營養(yǎng)抑制因子,是實現(xiàn)糖渣高值利用的有效手段[3]。在玉米淀粉糖渣的發(fā)酵方式中,固體發(fā)酵具有對設(shè)備和發(fā)酵環(huán)境要求低、能耗低、排廢少且利用率高等優(yōu)勢[4]。趙建國[5]以Y9601酵母為出發(fā)菌,固體發(fā)酵玉米淀粉渣, 通過工藝條件優(yōu)化,產(chǎn)物酵母數(shù)可達(dá)7.45×109個/g,表觀粗蛋白增加12.7%,真蛋白凈增加5.46%,但該方法并不能改善玉米淀粉糖渣的風(fēng)味、口味;曹磊[6]對玉米淀粉糖渣生產(chǎn)功能性乳酸菌活菌飼料進(jìn)行了研究,在液態(tài)發(fā)酵中,將鼠李糖乳桿菌的活菌數(shù)由4.10×108CFU/mL提高到1.08×109CFU/mL,達(dá)到乳酸菌發(fā)揮有益作用要求的菌體密度;還對鼠李糖桿菌的固態(tài)發(fā)酵工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化,得到了1.10×109CFU/g的活菌數(shù)。前人研究表明,利用糖渣生產(chǎn)乳酸菌制劑是可行的。

本研究以玉米淀粉糖渣為原料,采用枯草芽孢桿菌協(xié)同乳桿菌發(fā)酵,旨在提高對糖渣中糖的利用率和乳桿菌的活菌數(shù)。對雙菌發(fā)酵進(jìn)行了種子液接種量、含水量、起始pH、裝料量等因素的單因素優(yōu)化,再選取3個顯著影響的條件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化,以提高乳桿菌活菌數(shù)。對雙菌發(fā)酵產(chǎn)物和單菌發(fā)酵的產(chǎn)物的蛋白質(zhì)、氨基酸、風(fēng)味物質(zhì)、抗?fàn)I養(yǎng)因子和抗氧化能力進(jìn)行了分析檢測。本研究將為提升玉米淀粉糖渣附加值提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

玉米淀粉糖渣由山東菱花集團(tuán)提供;麩皮采購于市場;化學(xué)試劑均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司、北京伊諾凱試劑有限公司,純度為分析純。

1.1.2 菌種

嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus),山東威昂生物科技有限公司;枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis),北海強(qiáng)興生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

1.1.3.1 種子液培養(yǎng)基

采用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)芽孢桿菌;采用MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)乳桿菌[7]。

1.1.3.2 固體培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基是將種子液培養(yǎng)基中添加30 g/L的瓊脂制備而成。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米淀粉糖渣與麩皮質(zhì)量比1∶1,50%含水量,250 mL三角瓶裝料量20 g,起始pH值為7,115 ℃滅菌15 min[8]。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1800紫外可見分光光度計,博訊(上海)有限公司;高效液相色譜儀,美國安捷倫有限公司;凱氏定氮儀,山東海能儀器有限公司;味覺分析儀,日本INSENT公司;Heracles II電子鼻,法國Alpha MOS S.A.有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 固態(tài)發(fā)酵的條件優(yōu)化

雙菌接種比例的優(yōu)化:乳桿菌接種量5%,再按照乳桿菌與枯草芽孢桿菌的接種比例為5∶0、5∶1、5∶2、5∶3、5∶4(體積比,下同)接種,在37 ℃發(fā)酵48 h后,測定發(fā)酵物中的乳桿菌活菌數(shù)、pH、殘?zhí)橇俊?/p>

單因素發(fā)酵優(yōu)化試驗:種子液接種量、含水量、起始pH和裝料量進(jìn)行單因素發(fā)酵試驗,以最高的乳桿菌菌落數(shù)為確定因素的最適范圍。

為進(jìn)一步提高乳桿菌活菌數(shù),對前期單因素優(yōu)化試驗中確定的種子液接種量、起始pH和含水量為影響顯著影響因素因素,進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(表1)。

表1 乳桿菌發(fā)酵單因素試驗因素與水平Table 1 Lactobacillus acidophilus fermentation single factor test factors and levels

乳桿菌發(fā)酵工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗:基于單因素試驗結(jié)果,以乳桿菌菌落數(shù)(Y)為響應(yīng)值,利用Box-Behnken進(jìn)行工藝優(yōu)化設(shè)計。根據(jù)響應(yīng)面法建立的數(shù)學(xué)模型,分析預(yù)測乳桿菌最佳發(fā)酵工藝條件,對優(yōu)化的工藝進(jìn)行驗證,對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行評價。

1.3.2 乳桿菌計數(shù)方法

無菌條件下將樣品稀釋100倍,200 r/min搖床上振蕩15 min,后逐級稀釋至10-6,取100 μL稀釋后菌液加入平板中,倒雙層MRS固體培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)48 h,根據(jù)菌落數(shù)計乳桿菌數(shù)[9]。

1.3.3 葡萄糖測定方法:

葡萄糖測定參照SBA法[10]。

1.3.4 氨基酸、植酸、總酚、DPPH自由基清除率測定方法

將樣品冷凍干燥后采用高效液相色譜法測定氨基酸含量[11]、雙吡啶法測定植酸含量[12]、福林酚法測定總酚含量[13]、分光光度法測定DPPH自由基清除率[14]、凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量[15]。

1.3.5 電子鼻測定方法:

樣品經(jīng)冷凍干燥后采用Heracles Ⅱ電子鼻[16]進(jìn)行分析測定。

1.3.6 電子舌測定方法:

樣品經(jīng)冷凍干燥后采用味覺分析儀[17]分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌與乳桿菌雙菌試驗

曹磊[6]對糖渣的固態(tài)發(fā)酵研究,發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌不能直接利用糖渣中的粗蛋白,外源添加2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的蛋白胨可以促進(jìn)乳桿菌的增殖。因此,氮源可能是限制乳桿菌在糖渣中增殖的主要因素。然而,外部添加氮源的方法不僅會增加成本并且增加了染菌的風(fēng)險。ZHANG等[8]利用枯草芽孢桿菌MA139的固態(tài)發(fā)酵提高路氏乳桿菌G8-5的活力,多菌制劑的最高乳酸菌數(shù)目為9.01×109CFU/g,最大芽孢桿菌數(shù)目為1.03×1010CFU/g。研究認(rèn)為枯草芽孢桿菌分泌蛋白酶并水解粗蛋白,為乳桿菌提供氮源,同時因枯草芽孢桿菌生長消耗了氧氣,為乳桿菌增殖營造了厭氧環(huán)境。

基于上述已有研究結(jié)果,本研究嘗試在糖渣中按不同比例同時接入乳桿菌和枯草芽孢桿菌。結(jié)果(圖1)表明,隨著枯草芽孢桿菌比例的增加,葡萄糖消耗量先增加后減少,終pH先下降后上升。乳桿菌活菌數(shù)在兩菌比例為5∶2時最高,為1.50×109CFU/g,比未添加枯草芽孢桿菌(5∶0)時高2.86倍,同時,終pH也因為乳桿菌的生長而降低。隨著枯草芽孢桿菌比例的繼續(xù)增加,導(dǎo)致乳桿菌活菌數(shù)下降,表明二者之間的競爭加劇,枯草芽孢桿菌成為優(yōu)勢菌株,這不利于葡萄糖利用率的增加。以上現(xiàn)象說明,適量添加枯草芽孢桿菌可以促進(jìn)乳桿菌的生長,提高葡萄糖利用率。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗優(yōu)化提高乳桿菌數(shù)

2.2.1 響應(yīng)面試驗優(yōu)化試驗

固定條件為發(fā)酵37 ℃、雙菌種子液比例為5∶2、發(fā)酵時間為48 h、250 mL三角瓶裝料量為20 g。以種子液接種量(A)、培養(yǎng)基含水量(B)、初始pH(C)為響應(yīng)因子,以乳桿菌菌落數(shù)(Y)為響應(yīng)值,根據(jù)Box-Behnken設(shè)計3因素3水平優(yōu)化試驗,試驗設(shè)計見表2,響應(yīng)面二次模型方差分析見表3。

a-pH;b-葡萄糖含量;c-乳酸菌數(shù)圖1 枯草芽孢桿菌與乳桿菌接種比例對發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of Bacillus subtilis to Lactobacillus inoculation ratio on fermentation注:比例為嗜酸乳桿菌:枯草芽孢桿菌種子液體積比。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

根據(jù)Design Expert分析軟件進(jìn)行回歸分析,得到乳桿菌活菌數(shù)對接種量、培養(yǎng)基含水量、初始pH的二次回歸模型方程:

Y=4.99+0.268 3A-0.048 7B+0.125C-0.11AB-0.207 5AC+0.292 5BC-0.468 8A2-0.328 7B2-0.116 2C2

2.2.2 響應(yīng)面試驗驗證的試驗

根據(jù)響應(yīng)面法建立的數(shù)學(xué)模型,分析預(yù)測出乳桿菌發(fā)酵工藝的最佳條件為:雙菌種子液體積比為5∶2,乳桿菌與枯草芽孢桿菌接種量為7.8%,含水量為72%,初始pH為7.26,乳桿菌預(yù)測值為5.05×109CFU/g。

根據(jù)優(yōu)化后的工藝條件,在相同的實驗條件下,對單菌和雙菌發(fā)酵進(jìn)行了測定,以獲取乳桿菌的生長曲線,包括菌落數(shù)、pH值和殘?zhí)?。實驗結(jié)果如圖2所示。

結(jié)果表明,在經(jīng)過枯草芽孢桿菌協(xié)同發(fā)酵后,乳桿菌活菌數(shù)明顯增加。相較于單一乳桿菌的發(fā)酵,雙菌發(fā)酵的乳桿菌活菌數(shù)增加了2.42倍,達(dá)到了5.05×109CFU/g。驗證與模型預(yù)測值相符,說明響應(yīng)面法優(yōu)化乳桿菌發(fā)酵工藝是可行的,枯草芽孢桿菌和乳桿菌在發(fā)酵中具有協(xié)同作用。同時,發(fā)酵后的pH明顯下降,這表明乳桿菌代謝活動增強(qiáng),導(dǎo)致有機(jī)酸的累積。另外,葡萄糖消耗量也顯著提高,表明協(xié)同發(fā)酵的代謝效率更高。

2.3 發(fā)酵產(chǎn)物組分分析

2.3.1 發(fā)酵產(chǎn)物功能性與抗?fàn)I養(yǎng)因子等物質(zhì)的分析

總酚在飼料中起到抗氧化、保護(hù)營養(yǎng)成分、提高穩(wěn)定性和延長保存期的作用[18]。表4結(jié)果表明發(fā)酵可以顯著增加總酚含量,其中雙菌發(fā)酵的含量高于單菌發(fā)酵;植酸是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子,抑制動物腸道對礦物質(zhì)的吸收,對動物生長和健康有負(fù)面影響[19],發(fā)酵過程中微生物分泌的植酸酶分解了植酸,使其含量顯著降低;飼料清除DPPH自由基的能力越強(qiáng),其抗氧化能力越強(qiáng),發(fā)酵后的產(chǎn)物更有助于動物腸道健康[20]。發(fā)酵后,粗蛋白質(zhì)、水解氨基酸和游離氨基酸的含量會增加。這種現(xiàn)象一方面是由于總體干重的減少,另一方面則是因為乳桿菌和枯草芽孢桿菌分泌的相關(guān)酶作用的結(jié)果。綜合來看,雙菌發(fā)酵比單菌發(fā)酵的效果更好,二者與未發(fā)酵的糖渣相比,營養(yǎng)物質(zhì)增加、功能性增強(qiáng)和抗?fàn)I養(yǎng)因子減少。

a-乳酸菌數(shù);b-pH;c-葡萄糖含量圖2 單乳桿菌、雙菌協(xié)同發(fā)酵效果對比Fig.2 Comparison of synergistic fermentation effects of Lactobacillus monosis and Lactobacillus monobacterium

表4 功能性與抗?fàn)I養(yǎng)因子分析表Table 4 Table of functional and anti-nutritional factor analysis

2.3.2 電子鼻風(fēng)味特征性分析

使用Heracles Ⅱ電子鼻,對糖渣、乳桿菌的單菌發(fā)酵物以及雙菌的發(fā)酵物進(jìn)行了風(fēng)味性物質(zhì)分析(圖3)。每個保留時間對應(yīng)著相應(yīng)的化合物和相關(guān)風(fēng)味。如表5所示,在保留時間為18.18、24.71 min的潛在可能性組成中,主要成分為二甲硫醚,該物質(zhì)具有不愉快氣味和毒性,另一成分乙硫醇則具有刺激性蒜臭味和微毒性。經(jīng)過發(fā)酵后,這些氣味顯著減少。在保留時間為52.48、62.70、66.74 min的潛在可能性組成中,主要成分為環(huán)己醇、辛酮、庚酸甲酯等具有芳香氣味的物質(zhì)。發(fā)酵后,這類物質(zhì)的含量明顯增加。而在保留時間為36.24 min的潛在可能性組成中,主要成分為丁二醇,該物質(zhì)只在混菌發(fā)酵中存在,具有類水果味和奶油味。此外,在保留時間為64.13 min的潛在主要成分中,單菌發(fā)酵新增正葵烷等芳香類物質(zhì),而混菌發(fā)酵則主要新增2-乙基-3-甲基吡嗪,該物質(zhì)具有強(qiáng)烈的堅果香味。

綜上所述,經(jīng)過發(fā)酵后,3種糖渣的氣味出現(xiàn)了明顯的差異。未發(fā)酵的糖渣多為酸臭味等不愉快氣味,乳桿菌的單菌發(fā)酵物減少了臭味,同時增加了醇和脂類的香味。乳桿菌和枯草芽孢桿菌雙菌的發(fā)酵物則在減少臭味的基礎(chǔ)上,增加了強(qiáng)烈的類堅果香味。單菌發(fā)酵和雙菌協(xié)同發(fā)酵都可以改善糖渣的風(fēng)味,但雙菌協(xié)同發(fā)酵的香味更為濃烈。

圖3 電子鼻風(fēng)味雷達(dá)圖Fig.3 Electronic nose flavor radar

表5 風(fēng)味物質(zhì)成分表

2.3.3 電子舌味道分析

電子舌能感知液體環(huán)境中的不同味感,將待測樣品的化學(xué)信號轉(zhuǎn)化為電信號,電信號通過信號采集單元和模式識別系統(tǒng)轉(zhuǎn)化為電勢差,其輸出值為電子舌評分[21]。由表6可知,發(fā)酵減少了苦味,增加了澀味、苦味回味和澀味回味,分析原因為發(fā)酵降解了苦味物質(zhì),而又增加了可導(dǎo)致澀味的多酚類物質(zhì),使得味道變化;又由于發(fā)酵后鮮味氨基酸含量的增加,鮮味也有顯著增加,發(fā)酵消耗了部分培養(yǎng)基中的糖導(dǎo)致甜味減少,而分泌的乳酸等酸性物質(zhì)導(dǎo)致酸味也顯著增加。王玉[22]對21日齡斷奶仔豬進(jìn)行添加風(fēng)味劑的研究中,發(fā)現(xiàn)聯(lián)合添加鮮味劑和復(fù)合有機(jī)酸具有提高采食量的作用。發(fā)酵使糖渣味道更偏向于鮮味和酸味,與研究中風(fēng)味劑相似。

表6 電子舌味道分析表 單位:分

3 結(jié)論

單乳桿菌發(fā)酵玉米淀粉糖渣,乳桿菌活菌數(shù)為5.24×108CFU/g。采用枯草芽孢桿菌與乳桿菌協(xié)同發(fā)酵,乳桿菌活菌數(shù)提升到1.50×109CFU/g,是單菌發(fā)酵的2.86倍。并通過工藝優(yōu)化,將乳桿菌活菌數(shù)提高至5.05×109CFU/g,比相同條件下單菌發(fā)酵的活菌數(shù)高出2.42倍。

對糖渣、單菌發(fā)酵和雙菌發(fā)酵的產(chǎn)物進(jìn)行分析,結(jié)果表明,發(fā)酵可降低植酸含量、增加總酚含量、提升抗氧化能力,同時蛋白質(zhì)和氨基酸含量也有所增加。在氣味方面,發(fā)酵可減少異味,增加醇和酯類香氣,雙菌發(fā)酵還兼具濃烈的類堅果香味。此外,口味上也有所改善,減少了苦味,增加了酸味和鮮味,雙菌發(fā)酵的效果優(yōu)于單菌發(fā)酵。

本研究方法可用于糖渣的資源化利用,提升糖渣的價值,在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用還需進(jìn)一步研究。