美極梅奇酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵對(duì)藍(lán)莓酒品質(zhì)的影響

湯楚琦,顧秋亞,周劍麗,黎帥近一,李炫辰,丁合霞,楊國(guó)華,余曉斌*

1(江南大學(xué),工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無錫,214122) 2(貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院,貴州 貴陽,550025)3(貴州省輕工業(yè)科學(xué)研究所,貴州 貴陽,550007)

藍(lán)莓富含花青素、多酚等生物活性成分,具有抗氧化、抗癌等健康益處[1-2],可增強(qiáng)免疫系統(tǒng),并能夠預(yù)防心血管疾病等。由于藍(lán)莓鮮果不易貯存,經(jīng)常被加工成果汁及藍(lán)莓酒[3]。藍(lán)莓酒生產(chǎn)中的酒精發(fā)酵通常是由釀酒酵母進(jìn)行的,然而由于對(duì)具有特定特征的藍(lán)莓酒的需求不斷增加,對(duì)其他酵母菌和非釀酒酵母的研究越來越多[4]。藍(lán)莓酒的顏色會(huì)受到酵母在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的乙烯基酚類代謝物的影響,并可能與單體花青素反應(yīng),形成高度穩(wěn)定的吡喃花青素,乙烯基酚吡喃花青素化合物也表現(xiàn)出極大的顏色穩(wěn)定性[5-6]。

美極梅奇酵母(Metschnikowiapulcherrima)是一種具有優(yōu)良釀造特性的非釀酒酵母,具有較強(qiáng)的產(chǎn)酯酶及產(chǎn)β-葡萄糖苷酶等的能力[7],有助于風(fēng)味物質(zhì)的釋放,豐富果酒香氣。已有研究表明,與釀酒酵母混合發(fā)酵時(shí),還能降低發(fā)酵果酒中的乙醇含量[8],影響揮發(fā)酸的產(chǎn)生量[9],從而用于低度酒的發(fā)酵生產(chǎn)。同時(shí)美極梅奇酵母在酒精發(fā)酵前期,還表現(xiàn)出天然的抗菌作用,能夠控制腐敗微生物的生長(zhǎng),提高果酒品質(zhì)。非釀酒酵母在釀酒過程中能起到積極的作用,并提升果酒花香和果香等感官特性,然而,大多非釀酒酵母無法單獨(dú)完成酒精發(fā)酵,需要釀酒酵母的協(xié)同作用[10-11],因此,通過研究美極梅奇酵母與釀酒酵母協(xié)同發(fā)酵對(duì)藍(lán)莓酒的影響,有助于提升藍(lán)莓酒的風(fēng)味品質(zhì)。

本研究以藍(lán)莓汁為原料,選用一株商業(yè)釀酒酵母K1與一株美極梅奇酵母進(jìn)行了小型藍(lán)莓酒發(fā)酵試驗(yàn),分別在不同的發(fā)酵條件下,探究美極梅奇酵母的參與對(duì)藍(lán)莓酒色澤、生物活性成分、抗氧化能力及揮發(fā)性成分等的影響。本研究對(duì)美極梅奇酵母的菌種選擇提供新思路,為混菌發(fā)酵在藍(lán)莓酒生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考,有助于獲得高品質(zhì)藍(lán)莓酒。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

藍(lán)莓濃縮汁,貴州茅臺(tái)(集團(tuán))生態(tài)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司;美極梅奇酵母,篩選于藍(lán)莓果皮表面,現(xiàn)保藏于實(shí)驗(yàn)室菌種保藏庫;釀酒酵母K1,法國(guó)拉曼集團(tuán);酵母粉,蛋白胨,無水葡萄糖,瓊脂,無水乙醇,甲酸,甲醇(HPLC),國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;YPD培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20,蛋白胨20,酵母浸粉10,115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

超高速冷凍離心機(jī)、Trace1310-ISQ L氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,賽默飛世爾科技有限公司;SPX-250B-Z恒溫培養(yǎng)箱,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;UltraScan Pro 1166 高精度分光測(cè)色儀,美國(guó)Hunterlab公司;ΜV-1600 紫外可見光分光光度計(jì),上海精密科學(xué)儀器有限公司;

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

藍(lán)莓濃縮汁以1∶4的體積比加水稀釋,分裝于三角瓶中,65 ℃滅菌15 min。將美極梅奇酵母Mp、釀酒酵母K1分別接種于YPD液體培養(yǎng)基中,30 ℃活化培養(yǎng)24 h,再重復(fù)活化1次,培養(yǎng)至指數(shù)期。將活化好的菌株6 000 r/min離心5 min后收集菌體,經(jīng)0.9%的生理鹽水洗滌2次后接入三角瓶中。美極梅奇酵母的接種量為107CFU/mL,釀酒酵母的接種量為106CFU/mL,接種方式分別為順序接種與同時(shí)接種,順序接種即先接種非釀酒酵母,48 h后再接種釀酒酵母。稀釋后的藍(lán)莓果汁為空白對(duì)照組(用CK表示)。以美極梅奇酵母和釀酒酵母單獨(dú)發(fā)酵為對(duì)照 (其中Sq-Mix表示美極梅奇酵母與釀酒酵母順序混合發(fā)酵,Mix表示美極梅奇酵母與釀酒酵母同時(shí)混合發(fā)酵,Sc、Mp分別表示釀酒酵母、美極梅奇酵母單獨(dú)發(fā)酵),于20 ℃條件下靜置發(fā)酵,通過每天測(cè)定CO2質(zhì)量損失監(jiān)測(cè)發(fā)酵進(jìn)程,若連續(xù)2 d的質(zhì)量變化<0.2 g,則認(rèn)為發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵結(jié)束后將酒樣10 000 r/min離心10 min,上清液用于后續(xù)分析,每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次?？偺呛途凭雀鶕?jù)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測(cè)定。

1.3.2 色差分析

使用高精度分光測(cè)色儀對(duì)藍(lán)莓果汁及果酒的各顏色指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定,設(shè)置透射模式,讀數(shù)以色度值L*、a*值和b*值表示,L*代表亮度,越大代表樣品越亮;a*值代表綠紅顏色的飽和度,負(fù)值越小表示越綠,正值越大表示越紅;b*值代表藍(lán)黃顏色的飽和度,負(fù)值越小表示越藍(lán),正值越大表示越黃。根據(jù)公式(1)計(jì)算樣品的總色差值ΔE,ΔE數(shù)值越大,說明色差越大。

(1)

1.3.3 總花青素及總酚的測(cè)定

總花青素的測(cè)定參考王行等[12],采用pH示差法?？偡拥臏y(cè)定使用福林酚顯色法[13]。在96孔板中依次吸取50 μL稀釋到適當(dāng)濃度的待測(cè)液,100 μL Folin-Ciocalteu試劑(稀釋10倍),隨后在30 s至8 min內(nèi)加入100 μL 87.56 g/L Na2CO3溶液,混合均勻后放置1 h,于750 nm下測(cè)定吸光值。以1 mL藍(lán)莓酒樣中所含沒食子酸毫克數(shù)來表示所含總酚的量。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

1.3.4 體外抗氧化能力測(cè)定

1.3.4.1 ABTS陽離子自由基清除率的測(cè)定

將88.0 μL K2S2O8(140 mmol/L)溶液和5.0 mL ABTS溶液(7 mmol/L)混合后反應(yīng)24 h,生成ABTS陽離子自由基,并用無水乙醇稀釋至其在734 nm處的吸光值為0.70±0.02。取0.5 mL樣品于離心管中,加入4.5 mL ABTS陽離子自由基稀釋液,搖勻后在30 ℃下水浴反應(yīng)6 min,避光,在734 nm處測(cè)定吸光度。藍(lán)莓果酒樣品的測(cè)定值為A1。將無水乙醇代替樣品測(cè)定值為A0。

根據(jù)公式(2)計(jì)算ABTS陽離子自由基清除率:

(2)

1.3.4.2 DPPH自由基清除率的測(cè)定

取2 mL待測(cè)的藍(lán)莓酒樣品,加入2 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液,搖勻后靜置20 min。使用無水乙醇調(diào)零后,在517 nm處測(cè)定吸光度。樣品組A1,對(duì)照組A2為樣品與無水乙醇1∶1(體積比)混合液的吸光度,空白組A0為DPPH溶液與無水乙醇混合液的吸光度。

根據(jù)公式(3)計(jì)算DPPH自由基清除率:

(3)

1.3.4.3 羥自由基清除能力的測(cè)定

參照王燕新等[14]的方法,按順序分別加入2 mL的硫酸亞鐵(6 mmol/L)、水楊酸(6 mmol/L)、藍(lán)莓酒待測(cè)樣品及,再加入過氧化氫溶液(6 mmol/L),在37 ℃下水浴反應(yīng)1 h,在510 nm處測(cè)定其吸光度為A1, 用純水代替樣品且不加過氧化氫溶液,測(cè)得底物的吸光度為A2;測(cè)定純水的吸光值為空白對(duì)照A0。

根據(jù)公式(4)計(jì)算羥自由基清除率:

(4)

1.3.5 揮發(fā)性成分的測(cè)定

參照嚴(yán)紅光等[15]的方法,采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)藍(lán)莓酒香氣成分進(jìn)行檢測(cè)。樣品處理:分別取藍(lán)莓果汁及發(fā)酵后的樣品8 mL 置于15 mL頂空瓶中,加入5 μL的2-辛醇內(nèi)標(biāo)溶液,使終質(zhì)量濃度為100 mg/L。揮發(fā)性化合物的半定量以各組分相對(duì)于內(nèi)標(biāo)物2-辛醇的含量計(jì)算。GC條件:毛細(xì)管柱為DB-WAX UI (30 m×0.25 mm,0.25 μm),載氣為氦氣,流速為1.2 mL/min。溫度由50 ℃在2 min后以3 ℃/min升至145 ℃,在230 ℃保持10 min。MS條件:EI源,離子源溫度為260 ℃,MS傳輸線溫度為230 ℃,掃描質(zhì)量范圍為33m/z至450m/z。電壓70 eV。

1.4 數(shù)據(jù)處理

在本實(shí)驗(yàn)中,所有指標(biāo)測(cè)定均重復(fù)3次。柱狀圖、折線圖及聚類熱圖使用Origin 2021分析繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵能力研究

由圖2可知,美極梅奇酵母單獨(dú)發(fā)酵組(Mp)發(fā)酵速度較慢,且在第10天停止發(fā)酵,耗糖量?jī)H49.30 g,釋放了5.20 g CO2,說明其發(fā)酵能力較弱,不能單獨(dú)完成酒精發(fā)酵。釀酒酵母單獨(dú)發(fā)酵組(Sc)的起酵速度最快,在第9天完成發(fā)酵,共釋放16.54 g CO2。與Mix組相比,Sq-Mix組的發(fā)酵速度減慢,延長(zhǎng)了2 d的發(fā)酵時(shí)間,并減少了2.1 g的CO2釋放量,同時(shí)降低了0.3%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇含量。已有研究表明[16-17],順序發(fā)酵試驗(yàn)顯示出較低的發(fā)酵動(dòng)力學(xué),這是由于美極梅奇酵母具有較低的糖醇轉(zhuǎn)化率導(dǎo)致的,Sq-Mix組中美極梅奇酵母的存在使CO2釋放速度較Mix慢少并消耗了部分糖,而釀酒酵母的延遲接種會(huì)促進(jìn)乙醇的進(jìn)一步減少。發(fā)酵結(jié)束后,與Sc組相比,Mp組、Mix組及Sq-Mix組的乙醇含量分別降低了5.17%、0.5%、0.8%(均為體積分?jǐn)?shù)),該結(jié)果表明,在混合接種方式下能夠降低藍(lán)莓酒中的乙醇含量,證實(shí)了美極梅奇酵母在降低乙醇含量方面的作用。

a-發(fā)酵動(dòng)力學(xué)曲線;b-總糖含量的變化;c-酒精含量圖2 不同發(fā)酵組的發(fā)酵能力表征Fig.2 Characterization of fermentation capacity of different fermentation groups

2.2 顏色參數(shù)分析

不同發(fā)酵組的藍(lán)莓酒顏色的結(jié)果如表1所示。Mp組、Sq-Mix組和Mix的色差值與Sc組相比,分別增加了51.09%、18.78%和10.48%,表明添加美極梅奇酵母發(fā)酵能夠?qū)λ{(lán)莓酒的顏色產(chǎn)生積極作用。其中,Mp組的L*值和a*值相比于Sc組分別增加了0.32和2.07,且數(shù)值最大,表示Mp組在4個(gè)酒樣中最亮、顏色最紅。一方面,在釀酒過程中,美極梅奇酵母的代謝產(chǎn)物(乙烯基苯酚、丙酮酸、羥基肉桂酸和乙醛)能與花青素相互結(jié)合成穩(wěn)定的色素,從而抵抗色素物質(zhì)的降解,阻止果酒褐變[18-19]。另一方面,非釀酒酵母在發(fā)酵期間能產(chǎn)生較高的乳酸,導(dǎo)致酒樣pH值降低[20],增加果酒的紅色色調(diào)[21]。有研究發(fā)現(xiàn),與釀酒酵母相比,非釀酒酵母參與的混合發(fā)酵通?？墒构频念伾珡?qiáng)度增加[22],這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

表1 不同發(fā)酵方式藍(lán)莓酒色度Table 1 Chroma of blueberry wine with different fermentation systems

2.3 生物活性成分分析

果酒的顏色取決于其含有的花青素及其衍生產(chǎn)物含量和它們?cè)诠浦械姆€(wěn)定性,4種不同的發(fā)酵方式在總酚和總花青素成分間的差異如圖3所示。Sc組的總花青素含量及總酚含量分別為(297.80±8.92) mg/L和(4 552.34±30.13) mg/L。而使用美極梅奇酵母單獨(dú)發(fā)酵的Mp組較Sc組的總花青素含量降低了21.64%,總酚含量升高了2.21%。Mp組中總花青素的含量顯著低于Sc組,僅為(233.34±7.57) mg/L,總花青素的損失可能是由于該株美極梅奇酵母的細(xì)胞壁能夠吸附藍(lán)莓中的單體花青素,并隨著發(fā)酵結(jié)束后的離心過程而沉降,從而降低了藍(lán)莓酒中的總花青素。而在發(fā)酵過程中,非釀酒酵母較釀酒酵母能產(chǎn)生更多的β-葡萄糖苷酶,該酶能促進(jìn)酚類化合物的釋放[19,23],提高總酚含量。

圖3 不同發(fā)酵方式藍(lán)莓酒的生物活性成分Fig.3 Phytochemical composition in blueberry wine with different fermentation methods

2.4 抗氧化能力分析

由圖4可知,藍(lán)莓果汁及藍(lán)莓酒都表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力,有研究表明,花青素、總酚等含量與自由基的清除能力有關(guān)[24]。由圖4-a中可以看出,Sc組對(duì)ABTS陽離子自由基的清除能力最高,較藍(lán)莓果汁提高了10.64%,而相比于Mp組無顯著差異。同時(shí),混合發(fā)酵組Sp-Mix組及Mix組對(duì)ABTS陽離子自由基的清除能力相比于單獨(dú)發(fā)酵組,降低了約4.80%。

DPPH被廣泛應(yīng)用于測(cè)定自由基的清除能力。如圖4-b所示,Sp-Mix組對(duì)DPPH的自由基清除率最低,為50.27%,與Mix組相比,降低了14.22%,表明同時(shí)接種混合發(fā)酵對(duì)藍(lán)莓酒的DPPH自由基清除能力影響較大。而Sc組對(duì)DPPH自由基的清除能力最高,為60.72%。從對(duì)羥自由基清除能力來說,如圖4-c所示,Mix組最好,為56.72%,但與Sq-Mix組合Sc組無顯著差異。

綜上所述,利用該株美極梅奇酵母單獨(dú)發(fā)酵藍(lán)莓酒時(shí),在ABTS陽離子自由基、DPPH自由基及羥自由基清除能力方面均不如釀酒酵母K1單獨(dú)發(fā)酵,而利用混合發(fā)酵方式能夠提高DPPH及羥自由基清除能力。

2.5 香氣成分分析

揮發(fā)性香氣成分與藍(lán)莓酒的品質(zhì)密切相關(guān)。通過不同發(fā)酵方式發(fā)酵后的藍(lán)莓酒香氣成分如表2所示。共檢測(cè)出45種香氣物質(zhì),分別為22種酯類物質(zhì)、19種除乙醇外的醇類物質(zhì)、2種酸類物質(zhì)、1種醛類物質(zhì)和1種酮類物質(zhì)。酯類物質(zhì)能夠?yàn)樗{(lán)莓酒貢獻(xiàn)果香香氣。經(jīng)美極梅奇酵母單獨(dú)發(fā)酵的Mp組中,總酯的相對(duì)含量最高,達(dá)362.95 mg/L,與Sc組相比,提高了134.63%,并能夠顯著提高異戊酸乙酯、乙酸乙酯和乙酸異戊酯的含量,分別為藍(lán)莓酒增添水果香和香蕉香味等。同時(shí),Mix組相比于Sc組,產(chǎn)生了較高含量十六烷酸乙酯,達(dá)28.50 mg/L,能夠?yàn)樗{(lán)莓酒帶來果香及奶油香氣,豐富藍(lán)莓酒的香氣成分。Mix組與Sc組中的苯乙醇含量較高,分別為51.81 mg/L和53.02 mg/L,分別占其總醇含量的16.54%和24.09%,可為藍(lán)莓酒增添蜂蜜、玫瑰等香氣。因此,美極梅奇酵母的參與能夠顯著改變藍(lán)莓酒的香氣成分組成,增加藍(lán)莓酒香氣的豐富性及愉悅性。

a-ABTS陽離子自由基清除率;b-DPPH自由基清除率;c-羥自由基清除率圖4 不同發(fā)酵方式藍(lán)莓酒的抗氧化能力Fig.4 Antioxidant capacity in blueberry wine with different fermentation methods

如圖5所示,為研究不同發(fā)酵方式下藍(lán)莓酒中主要香氣成分間的差異,利用Origin軟件對(duì)5個(gè)樣品中的香氣成分進(jìn)行熱圖聚類分析。由美極梅奇酵母單獨(dú)發(fā)酵后主要產(chǎn)生了異戊醇、異戊酸乙酯、乙酸乙酯等物質(zhì),這些香氣成分主要表現(xiàn)為花香與果香,使藍(lán)莓酒香氣更加豐富。而利用商業(yè)釀酒酵母單獨(dú)發(fā)酵及混合發(fā)酵能夠顯著增加苯乙醇的含量,能夠?yàn)樗{(lán)莓酒帶來丁香花、蜂蜜及玫瑰香氣。在同時(shí)接種發(fā)酵方式下,辛酸乙酯的含量相比于其他組最高,為藍(lán)莓酒增添濃郁的果香。綜上,美極梅奇酵母的參與能夠改變藍(lán)莓酒的香氣成分組成,且在混合發(fā)酵時(shí)也能夠增加更多的果香香氣。

表2 不同發(fā)酵組藍(lán)莓酒香氣成分Table 2 Aroma components of blueberry wine from different fermentation groups

圖5 不同發(fā)酵組藍(lán)莓酒香氣成分聚類分析熱圖Fig.5 Clustering analysis heat map of aroma components of blueberry wine in different fermentation group

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過比較美極梅奇酵母及商業(yè)釀酒酵母以不同接種方式發(fā)酵對(duì)藍(lán)莓酒的顏色參數(shù)、香氣成分、抗氧化活性等的影響,發(fā)現(xiàn)美極梅奇酵母單獨(dú)發(fā)酵、順序接種混合發(fā)酵及同時(shí)接種混合發(fā)酵與釀酒酵母單獨(dú)發(fā)酵相比,使藍(lán)莓酒中的乙醇含量分別降低了5.17%、0.8%、0.5%(均為體積分?jǐn)?shù))。美極梅奇酵母的參與增強(qiáng)了藍(lán)莓酒的顏色強(qiáng)度,并增加了2.21%的總酚含量,同時(shí),提高了134.63%的總酯含量,其中顯著提高了異戊酸乙酯、乙酸乙酯和乙酸異戊酯的含量,使藍(lán)莓酒的果香及花香香氣更加濃郁。綜上,美極梅奇酵母在改善藍(lán)莓酒品質(zhì)方面具有較好的應(yīng)用潛力,為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)藍(lán)莓酒提供新思路。