ET-1/eNOS表達(dá)差異在牦牛隱睪發(fā)生中的作用分析

張 穎,袁莉剛,陳國娟,張 芳,楊大鵬

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,蘭州 730070)

內(nèi)皮素-1(endothelin-1, ET-1)是從豬主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中提取并命名,是血管收縮作用最強(qiáng)的內(nèi)源性肽類物質(zhì),具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)[1];ET-1主要通過引起血管平滑肌細(xì)胞增殖,使得血管結(jié)構(gòu)和功能改變,從而刺激血管收縮[2]。睪丸具有產(chǎn)生精子和分泌雄激素的功能[3],睪丸支持細(xì)胞產(chǎn)生ET-1后,通過旁分泌方式作用于間質(zhì)細(xì)胞,促進(jìn)睪酮分泌,并可介導(dǎo)睪丸管周肌樣細(xì)胞(testicular peritubular myoid cells, TPMC)周期性收縮,促進(jìn)精子運(yùn)輸,維持精子細(xì)胞活力及性功能[4-5]。正常情況下,機(jī)體內(nèi)ET-1和NO處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)有利于維持血管的正常舒縮功能;當(dāng)ET-1表達(dá)上調(diào)時(shí),NOS-NO cGMP也上調(diào)以完全或不完全克服ET-1的血管收縮作用[6]。一氧化氮合酶(NOS)是合成NO的關(guān)鍵酶,由于NO活性高且半衰期短,因此關(guān)于NO的研究都集中在NOS;NOS有神經(jīng)元NOS (nNOS)、內(nèi)皮NOS (Endothelial nitric oxide synthase, eNOS) 和誘導(dǎo)型NOS (iNOS)。生理?xiàng)l件下eNOS產(chǎn)生的少量NO,有助于維持生物體正常的生理功能,包括調(diào)控血管緊張度、維持血壓及促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖和抑制血栓形成等[7-8]。研究表明,eNOS作為鈣依賴性一氧化氮合酶在哺乳動(dòng)物組織中廣泛表達(dá),鼠睪丸局部注射NOS抑制劑可導(dǎo)致eNOS合成降低,血管收縮,血流減少,影響生殖功能[9]。

牦牛為世代生活在青藏高原高寒、低氧極端生境的大型哺乳動(dòng)物[10-11],經(jīng)過長(zhǎng)期的自然選擇和自身適應(yīng),形成了能夠適應(yīng)高海拔、低氣壓和缺氧環(huán)境的代償性機(jī)能,獲得了適應(yīng)高原高寒低氧穩(wěn)定遺傳學(xué)特征。ET-1在動(dòng)物血管生成和低氧適應(yīng)中發(fā)揮著重要作用,其可能通過局部激素調(diào)節(jié),影響動(dòng)物睪丸的微循環(huán)[12]。當(dāng) ET-1 水平過高會(huì)引起氧化應(yīng)激反應(yīng),抑制睪酮合成及性功能;當(dāng)ET-1水平不足會(huì)導(dǎo)致睪丸管周肌樣細(xì)胞及生精細(xì)胞功能減退,影響生殖功能[4]。低氧會(huì)刺激機(jī)體產(chǎn)生更多的eNOS和NO,調(diào)節(jié)血壓和氧含量[13-14],當(dāng)睪丸中生成高濃度NO時(shí),則會(huì)抑制間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮,影響精子形成,從而使雄性動(dòng)物生育能力降低[15]。

隱睪癥是陰囊內(nèi)沒有睪丸或僅一側(cè)有睪丸,有單雙側(cè)、生理性和病理性之分[16]。雙側(cè)或單側(cè)隱睪時(shí),導(dǎo)致睪丸處于非正常狀態(tài)(如:高溫、缺血、缺氧等),對(duì)生精功能產(chǎn)生不良影響[17]。ETs-NOS 的上調(diào)或失衡與缺氧誘導(dǎo)的損傷有關(guān),在缺氧情況下,eNOS可在短期內(nèi)產(chǎn)生對(duì)組織缺氧信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)很重要的 NO[18],NO 被超氧化物消耗后形成高反應(yīng)性的氧化物,從而損傷血管內(nèi)皮并損害其功能[8]。本研究通過H.E染色、Masson’s三色染色、免疫組織化學(xué)染色、雙重免疫熒光染色、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等技術(shù)分析牦牛睪丸組織中ET-1及eNOS的分布特點(diǎn),旨在探究ET-1及eNOS在牦牛睪丸中的功能,為正常睪丸生理特征理解和隱睪癥治療靶點(diǎn)探索提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 樣品采自青海省西寧市大通回族自治縣青海鑫興源屠宰場(chǎng),選取健康和病理性成年(4歲)雄性牦牛,采用睪丸摘除手術(shù)收集樣本(共20對(duì)),分為3組:正常組(10對(duì))、單側(cè)下降組(單側(cè)隱睪下降至陰囊的睪丸,6對(duì))及隱睪組(位于腹股溝部的單側(cè)隱睪及雙側(cè)隱睪,4對(duì)),用4%的多聚甲醛溶液固定形態(tài)學(xué)組織樣本,制作睪丸實(shí)質(zhì)組織切片。

1.1.2 主要藥品試劑及儀器 Masson’s(S0071,臺(tái)山市化工有限公司),蘇木精-伊紅、ET-1抗體(bs-0954R,北京博奧森生物技術(shù)有限公司),eNOS抗體(AF0096,江蘇親科生物研究中心有限公司),免疫組化試劑盒(SP-0023,北京博奧森生物技術(shù)有限公司),DAB顯色試劑盒(ZLI-9018,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),熒光素Alexa Fluor 488標(biāo)記鏈霉親和素(ab150077)及Alexa Fluor 647標(biāo)記鏈霉親和素(ab150079),DAPI染色液(D-9106);抗熒光淬滅封片液(C02-04003)。

Epon 812包埋機(jī),NIKON ECLIPSE 80i顯微攝像系統(tǒng),LKB 8800型超薄切片機(jī)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 組織學(xué)樣本制備 正常睪丸及隱睪樣品在4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定,流水沖洗24 h,放入50%軟化液軟化48 h后梯度酒精脫水,石蠟包埋后制作切片(片厚4 μm),用于蘇木素-伊紅(H.E)常規(guī)染色、Masson’s三色染色、Gomori’s染色、ET-1及eNOS免疫組織化學(xué)染色。

1.2.2 H.E染色 切片經(jīng)梯度酒精脫蠟,Mayer蘇木精染色后流水返藍(lán),酒精脫水,醇溶伊紅染色10 s,放置于二甲苯內(nèi)20 min,中性樹膠封片。

1.2.3 Masson’s三色染色 切片常規(guī)脫蠟至水,Bouin液37 ℃溫箱煤染2 h,流水沖洗,天青石藍(lán)染色3 min,Mayer蘇木精染色4 min,鹽酸乙醇分化液分化后麗春紅-品紅染色15 min,磷鉬酸處理10 min直接滴入苯胺藍(lán)染色液5 min,弱酸處理3 min,梯度酒精脫水,中性樹膠封片。

1.2.4 Gomori’s染色 切片常規(guī)脫蠟至水,高錳酸鉀氧化5 min,草酸漂白2 min,硫酸鐵銨煤染5 min,Gordon-Sweets銀氨3 min,核固紅染色液復(fù)染15 min,梯度酒精脫水,封片。

1.2.5 免疫組織化學(xué)染色 切片常規(guī)脫蠟;高壓法進(jìn)行抗原修復(fù),冷卻至室溫,PBS振洗;滴加3% H2O2,37 ℃孵育15 min;滴加山羊血清白蛋白,孵育15 min;滴加ET-1和eNOS 抗體(稀釋度均為1∶300),37 ℃孵育2 h,PBS振洗;依次滴加試劑B(二抗)、試劑C(辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液)、DAB顯色液顯色,常規(guī)脫水透明、封片。陰性對(duì)照用PBS代替一抗染色。

1.2.6 雙重免疫熒光染色 切片常規(guī)脫蠟,操作步驟均與免疫組織化學(xué)相同,將試劑B替換為熒光素Alexa Fluor 488標(biāo)記鏈霉親和素(稀釋度1∶800)孵育40 min,PBS振洗3次,每次5 min;熒光素Alexa Fluor 647標(biāo)記鏈霉親和素(稀釋度1∶800)孵育40 min;DAPI染色液孵育10 min后PBS振洗,封片,觀察拍照。

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 通過GenBank查找牛源ET-1序列、eNOS序列及β-actin序列,使用Primer 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(引物序列見表1),蘭州天啟基因生物有限公司合成。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA作為模板進(jìn)行RT-PCR檢測(cè),qPCR反應(yīng)總體系為20 μL,其中模板1 μL,2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix 10 μL,上、下游引物各1 μL,ddH2O 7 μL。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性30 s;94 ℃變性5 s,60 ℃退火延伸30 s,循環(huán)40次。根據(jù)Ct值采用2-ΔΔCt分析mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

在NIKON ECLPISE 80i顯微攝像系統(tǒng)中對(duì)切片進(jìn)行拍照,每張切片中隨機(jī)選取6個(gè)不重復(fù)視野(400×),用Image J軟件統(tǒng)計(jì)免疫組織化學(xué)平均光密度值以及計(jì)算間質(zhì)面積/管腔面積比值等進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,多組比較使用單因素方差分析(one-way ANOVA),使用Tukey’s HSD (honestly significant difference) 法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)。以P<0.05 表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001。

表1 引物信息Table 1 Primers information

2 結(jié) 果

2.1 牦牛正常組、單側(cè)下降組及隱睪組睪丸的大體形態(tài)與組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

牦牛睪丸呈長(zhǎng)卵圓形且表面光滑,血管豐富,附睪附著于睪丸表面,單側(cè)下降組睪丸略小,質(zhì)地柔軟,表面血管不如正常組清晰,隱睪組顯著變小,質(zhì)地堅(jiān)實(shí),彈性下降(圖1)。H.E染色顯示,正常組基膜平整,生精小管發(fā)育良好,血管分布于相鄰生精小管間質(zhì)區(qū)域內(nèi),間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量多且細(xì)胞較大,胞質(zhì)豐富,核呈圓形或卵圓形居中,核仁明顯。生精細(xì)胞自基膜向管腔面有序排列為4～7層不等,呈長(zhǎng)梭形狀管周肌樣細(xì)胞分布于生精小管固有膜外周(圖2a-A)。單側(cè)下降組生精小管發(fā)育不良,生精上皮細(xì)胞排列3～4層,生精細(xì)胞數(shù)量較少且部分脫落于管腔之中,精原細(xì)胞有序分布,初級(jí)精母細(xì)胞散在分布,管腔內(nèi)可見精子(圖2a-B)。相較于正常組,生精小管的平均直徑減小(表2),隱睪組基膜增厚內(nèi)陷,管腔面積減小,生精小管皺縮,生精細(xì)胞缺失。間質(zhì)疏松,間質(zhì)細(xì)胞減少,組織結(jié)構(gòu)不清晰(圖2a-C)。

圖1 睪丸樣本圖片F(xiàn)ig.1 Images of testicular samples

2.2 牦牛正常組、單側(cè)下降組及隱睪組睪丸結(jié)締組織膠原纖維和網(wǎng)狀纖維分布特點(diǎn)

Masson’s三色染色結(jié)果顯示,正常組間質(zhì)內(nèi)富含膠原纖維、血管(圖2a-D);單側(cè)下降組間質(zhì)緊密,膠原纖維與血管豐富,間質(zhì)面積與管腔面積之比略高于正常組,無顯著差異(P>0.05,圖2a-E,表2),隱睪組間質(zhì)膠原纖維增生,血管減少且管壁皺縮(圖2a-F)。Gomori’s染色正常組與單側(cè)下降組網(wǎng)狀纖維豐富(圖2a-G,圖2a-H,表2),隱睪組間質(zhì)組織和生精小管固有膜外周的網(wǎng)狀纖維分布明顯多于其他兩組(圖2a-I,表2)。

2.3 ET-1和eNOS免疫組織化學(xué)分布特征及檢測(cè)結(jié)果對(duì)比分析

ET-1在正常組表達(dá)于各級(jí)生精細(xì)胞,強(qiáng)表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞 (圖2a-J);單側(cè)下降組生精上皮表達(dá)明顯,間質(zhì)細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)(圖2a-K);隱睪組上皮未見明顯表達(dá),主要表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞(圖2a-L)。eNOS正常組中表達(dá)于生精小管和間質(zhì)細(xì)胞(圖2a-M);單側(cè)下降組中,eNOS強(qiáng)表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞(圖2a-N);隱睪組中,eNOS在生精小管中未見明顯表達(dá),弱表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞(圖2a-O)。

免疫組織化學(xué)光密度統(tǒng)計(jì)表明,ET-1在正常組與單側(cè)下降組差異顯著(P<0.05),單側(cè)下降組和隱睪組無明顯差異(P>0.05),正常組與隱睪組差異極顯著(P<0.01,圖2b);與正常組相比較,eNOS在單側(cè)下降組極顯著升高(P<0.001),隱睪組差異顯著(P<0.05,圖2c)。

(圖2續(xù) Continued)

2.4 雙重免疫熒光染色及光密度分析

綠色熒光標(biāo)記eNOS, 紅色熒光標(biāo)記ET-1。ET-1在正常組上皮表達(dá)明顯,主要在間質(zhì)細(xì)胞中呈強(qiáng)陽性表達(dá),ET-1在單側(cè)下降組及隱睪組間質(zhì)細(xì)胞中呈強(qiáng)陽性表達(dá)(圖3a)。免疫熒光化學(xué)光密度分析結(jié)果表明(圖3b,c),相較于正常組,ET-1在單側(cè)下降組和隱睪組下降,存在極顯著差異(P<0.001),eNOS在單側(cè)下降組較正常組極顯著升高(P<0.001);在隱睪組較正常組顯著升高(P<0.05)。

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果分析

ET-1和eNOS在睪丸和隱睪中均有表達(dá),ET-1在正常組中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于單側(cè)下降組及隱睪組(P<0.01,圖 2d),在單側(cè)下降組中eNOS的相對(duì)表達(dá)量比正常組顯著升高(P<0.05,圖2e)。

3 討 論

睪丸是雄性哺乳動(dòng)物的重要生殖器官,具有產(chǎn)生精子和性激素的作用,并激發(fā)和維持雄性性征。睪丸組織結(jié)構(gòu)發(fā)生改變與其功能異常密切相關(guān),隱睪時(shí)睪丸在腹腔中處于非正常狀態(tài)(如高溫、缺血等),出現(xiàn)睪丸纖維化、生精細(xì)胞凋亡等情況,會(huì)引起睪丸鈣化等病理性改變[17];研究顯示,牛睪丸間質(zhì)結(jié)締組織增加會(huì)影響精子質(zhì)量[18-20]。前期研究表明,牦牛隱睪組織有纖維化趨勢(shì),實(shí)質(zhì)出現(xiàn)鈣化現(xiàn)象,生精小管基膜變厚,血管減少,提示細(xì)胞間物質(zhì)交換能力受阻,組織局部嚴(yán)重缺氧、缺血,最終導(dǎo)致營養(yǎng)不良性鈣化[21-22]。本試驗(yàn)中,與正常組相比較,單側(cè)下降組生精上皮細(xì)胞層數(shù)少且發(fā)育不全、排列紊亂,生精小管直徑減小,間質(zhì)面積與管腔面積的比值極顯著增大;與正常組相比較,隱睪組的平均間質(zhì)面積明顯增多,膠原和網(wǎng)狀纖維含量增加。朱保平等[23-24]的研究表明,單側(cè)隱睪會(huì)引起對(duì)側(cè)睪丸的生精損害。本試驗(yàn)中,與正常組相比較,單側(cè)下降組生精細(xì)胞減少且部分脫落于管腔之中,間質(zhì)結(jié)締組織及血管的發(fā)育不良,提示在牦牛單側(cè)下降的睪丸中精子生成受到影響;隱睪組則基膜增厚內(nèi)陷,生精小管皺縮,間質(zhì)細(xì)胞減少,生精小管數(shù)量及管徑的相應(yīng)變化,間質(zhì)細(xì)胞的局部分泌調(diào)節(jié)受到影響,最終導(dǎo)致精子發(fā)生阻滯。

表2 牦牛正常組、單側(cè)下降組與隱睪組生精小管特征指數(shù)比較Table 2 The comparison results of the seminiferous tubule characteristic indexes in normal testicles, unilateral descent testicles and cryptorchidism groups of yak

a.正常組、單側(cè)下降組和隱睪組睪丸組織中的雙重免疫熒光染色:A-C. ET-1標(biāo)記的睪丸間質(zhì)細(xì)胞,呈紅色陽性亮點(diǎn);D-F. eNOS標(biāo)記的睪丸間質(zhì)細(xì)胞,呈綠色陽性亮點(diǎn);J-L. 熒光雙標(biāo)合成圖。Ley. 間質(zhì)細(xì)胞;CV. 微血管。b.正常組、單側(cè)下降組和隱睪組睪丸組織中的ET-1平均熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)。c.正常組、單側(cè)下降組和隱睪組睪丸組織中的eNOS平均熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì) a.Immunofluorescence double staining in normal testicles, unilateral descent testicles and cryptorchidism tissue:A-C.The testis leydig cell labeled with ET-1 showed a red positive bright spot; D-F. The testis leydig cell labeled with eNOS showed a green positive bright spot; J-L. Double-labeled synthetic diagram. Ley. Leydig cell;CV.Capillary vascular. b.The statistical results of the average fluorescence intensity of ET-1 in normal testicles, unilateral descent testicles, cryptorchidism of yak. c.The statistical results of the average fluorescence intensity of eNOS in normal testicles, unilateral descent testicles, cryptorchidism of yak圖3 睪丸組織的雙重免疫熒光染色和平均熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)Fig.3 Double immunofluorescence staining and average fluorescence intensity statistics of testicular tissue

牦牛睪丸內(nèi)有大量動(dòng)靜脈枝,為睪丸提供豐富的血液供應(yīng)以及輸送營養(yǎng)物質(zhì)和激素轉(zhuǎn)運(yùn)等,是睪丸發(fā)揮正常生理功能的必要條件。睪丸間質(zhì)細(xì)胞分布于生精小管間的結(jié)締組織內(nèi),具有合成與分泌睪酮的作用[25-26]。ET-1是目前已知最強(qiáng)的內(nèi)源性血管收縮因子[1,27]。當(dāng)睪丸ET-1水平正常時(shí),促進(jìn)睪酮分泌、管周肌樣細(xì)胞的周期性收縮和精子運(yùn)輸,維持精子活力及正常性功能;當(dāng)ET-1水平過高,會(huì)激發(fā)ROS、NOS等的產(chǎn)生,抑制睪酮合成及性功能,誘發(fā)睪丸功能減退;當(dāng)ET-1水平不足時(shí),直接導(dǎo)致睪丸管周肌樣細(xì)胞及生精細(xì)胞功能減退,反饋性抑制下丘腦-垂體-性腺[4]。本試驗(yàn)中,ET-1在牦牛正常組中生精細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞染色呈強(qiáng)陽性表達(dá);與文獻(xiàn)在其他動(dòng)物中的研究相一致,分析其在睪酮分泌時(shí)發(fā)揮作用;在單側(cè)下降組中表達(dá)于生精細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞,但是ET-1表達(dá)量顯著低于正常組,提示睪酮的合成與分泌減少,引起雄激素水平降低,影響精子形成以及睪丸的發(fā)育;隱睪組僅表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞,但與單側(cè)下降組表達(dá)量無明顯差異,因隱睪組織發(fā)育不良,推測(cè)ET-1表達(dá)量減少主要由間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量及血管明顯減少引起。

研究表明,eNOS介導(dǎo)間質(zhì)細(xì)胞因NO引起的睪丸損傷修復(fù)或補(bǔ)償機(jī)制[28]。eNOS定位于人睪丸精母細(xì)胞、支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞膜[29];正常人精子頭部和體部存在eNOS有利于催化合成生理水平的NO,進(jìn)而對(duì)維持精子活動(dòng)起著重要作用[30]。本研究中,eNOS主要定位于正常組精原細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和支持細(xì)胞,提示eNOS參與正常睪丸生精上皮、精子細(xì)胞的發(fā)育。低氧會(huì)刺激機(jī)體產(chǎn)生更多的eNOS和NO以調(diào)節(jié)血壓和氧含量,而當(dāng)睪丸中生成高濃度NO時(shí),則會(huì)抑制間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮,影響精子的生成[31]。研究表明,eNOS基因在生精上皮表達(dá)增強(qiáng)與隱睪生精細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系[32-33]。本研究中,eNOS在成年牦牛單側(cè)下降組及隱睪組生精上皮表達(dá)較弱與精子生成密切相關(guān),隱睪組間質(zhì)細(xì)胞eNOS弱表達(dá)與NO產(chǎn)生及氧含量調(diào)節(jié)的關(guān)系值得進(jìn)一步研究。研究表明,大鼠單側(cè)下降睪丸的生精功能受到抑制,且抗氧化能力下降[23]。研究發(fā)現(xiàn),小鼠單側(cè)下降睪丸存在雄激素代償性生理作用[34];早期研究表明,牦牛隱睪VEGF及其受體可能通過拮抗雙側(cè)睪丸生精抑制作用,維持單側(cè)下降睪丸的生精功能[21]。本研究中,eNOS在單側(cè)下降組表達(dá)強(qiáng)度高于正常組和隱睪組,可能引起單側(cè)下降睪丸中NO 含量升高,血管舒張,以調(diào)節(jié)低氧引起的精子生成減少,對(duì)維持生殖機(jī)能有重要意義。

機(jī)體內(nèi) ET-1 和 NO 處于動(dòng)態(tài)平衡有利于維持血管的正常收縮和舒張功能,對(duì)維持內(nèi)皮功能和血管重塑十分重要[35-37]。ET-1具有血管收縮作用,ET-1的過度增加可損傷內(nèi)皮細(xì)胞[18]。eNOS通過催化氧化L-精氨酸生成的NO具有舒張血管的作用[38]。ET-1在成年大鼠睪丸中主要定位于間質(zhì)細(xì)胞,對(duì)間質(zhì)細(xì)胞的分泌有促進(jìn)作用[39]。eNOS在成人睪丸精子發(fā)生的各個(gè)階段都定位于間質(zhì)細(xì)胞,提示eNOS會(huì)通過調(diào)節(jié)間質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)或抑制睪酮分泌[31,40]。本研究中,雙重免疫熒光染色結(jié)果及光密度分析顯示,ET-1和 eNOS 共定位于牦牛正常睪丸間質(zhì)細(xì)胞及周圍間質(zhì),提示在正常組中ET-1 和 eNOS共同作用,且間質(zhì)細(xì)胞可能調(diào)節(jié)ET-1與eNOS的動(dòng)態(tài)平衡;在單側(cè)下降組間質(zhì)細(xì)胞ET-1和eNOS的表達(dá)失衡,ET-1顯著降低,eNOS顯著升高,應(yīng)主要與調(diào)節(jié)高原低氧環(huán)境中睪丸血管舒張,雄激素代償性生理作用密切相關(guān)。在隱睪組間質(zhì)細(xì)胞ET-1和eNOS的表達(dá)失衡,ET-1顯著降低,eNOS顯著升高,結(jié)合成年隱睪組織損傷嚴(yán)重,應(yīng)是間質(zhì)細(xì)胞及血管分布異常引起。

4 結(jié) 論

高原低氧環(huán)境下,牦牛隱睪基膜增厚內(nèi)陷,生精小管皺縮,生精細(xì)胞缺失,間質(zhì)細(xì)胞減少,局部分泌調(diào)節(jié)受到抑制,最終導(dǎo)致精子發(fā)生阻滯。ET-1和eNOS共同作用于間質(zhì)細(xì)胞,參與維持低氧環(huán)境中牦牛睪丸微循環(huán)穩(wěn)態(tài),在單側(cè)下降組和隱睪組間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)失衡,ET-1顯著降低,eNOS顯著升高,結(jié)合成年隱睪組織損傷嚴(yán)重,應(yīng)是間質(zhì)細(xì)胞及血管分布異常引起。