參苓白術(shù)散通過Linc01615/miR-491-5p對結(jié)直腸癌細(xì)胞的影響

鐘麗婭 趙建政 毛昀 肖佑

摘要：目的 探索參苓白術(shù)散通過Linc01615/miR-491-5p對結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期和侵襲作用的影響。方法 通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染構(gòu)建分組：空白對照組、參苓白術(shù)散組、參苓白術(shù)散組+siRNA Linc01615、參苓白術(shù)散組+oe Linc01615、參苓白術(shù)散組+miR-491-5p mimics、參苓白術(shù)散組+miR-491-5p抑制劑組、參苓白術(shù)散組+miR-491-5p mimics+oe Linc01615，加入相應(yīng)的血清進(jìn)行干預(yù)。經(jīng)相應(yīng)的血清處理后，Annexin V-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期分布情況，transwell實驗檢測細(xì)胞侵襲情況。結(jié)果 參苓白術(shù)散處理細(xì)胞后，抑制細(xì)胞增殖、侵襲及細(xì)胞周期的G0/G1期并促進(jìn)凋亡，在分別加入siRNA Linc01615和 miR-491-5p mimics后效果更為顯著，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 參苓白術(shù)散可能通過Linc01615/miR-491-5p 抑制LoVo細(xì)胞的侵襲，促進(jìn)凋亡并將細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。

關(guān)鍵詞：參苓白術(shù)散；Linc01615；miR-491-5p；結(jié)直腸癌

中圖分類號：R735.3+7

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1007-2349（2024）01-0079-06

Effect of Shenling Baizhu Powder on Colorectal Cancer Cells via Linc01615/miR-491-5p

ZHONG Li-ya，ZHAO Jian-zheng，MAO Yun，XIAO You

（1. 921 Hospital of Joint Logistic Support Force，Changsha 410000，China;

2. The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Traditional Chinese Medicine，Changsha 410005，China）

【Abstract】Objective： To study the effect of Shenling Baizhu Powder on apoptosis，cell cycle and invasion of colorectal cancer via Linc01615/miR-491-5p. Methods： Groups were constructed by cell transfection and divided blank control group，Shenling Baizhu Powder group，Shenling Baizhu Powder group+siRNA Linc01615，Shenling Baizhu Powder group+oe Linc01615，Shenling Baizhu Powder group+miR-491-5p mimics，Shenling Baizhu Powder group+miR-491-5p inhibitor group，Shenling Baizhu Powder group+miR-491-5p mimics+oe Linc01615. All groups were added to the corresponding serum for intervention. After treatment with the corresponding serum，Annexin V-FITC/PI double staining flow cytometry was used to detect apoptosis and cell cycle distribution，and transwell assay was used to detect cell invasion. Results： Shenling Baishu Powder inhibited cell proliferation，invasion and G0/G1 phase of cell cycle，and promoted apoptosis，and the effect was more significant after the addition of siRNA Linc01615 and miR-491-5p mimics. The difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion： Shenling Baizhu Powder may inhibit the invasion of LoVo cells through Linc01615/miR-491-5p，promote apoptosis and block the cell cycle in G0/G1 phase.

【Key words】Shenling Baizhu Powder; Linc01615; miR-491-5p; Colorectal Cancer

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是一種常見消化系統(tǒng)癌癥，且有越來越多的數(shù)據(jù)顯示，結(jié)直腸癌的發(fā)病趨向年輕化發(fā)展，因此，積極探究結(jié)直腸癌發(fā)生和發(fā)展過程中的異常分子機(jī)制，提高患者生存期顯得至關(guān)重要。參苓白術(shù)散應(yīng)用于CRC治療領(lǐng)域取得了良好的效果，大量的臨床研究顯示參苓白術(shù)散在增強患者食欲，抑制癌細(xì)胞功能，增強機(jī)體免疫力等方面占據(jù)了重要地位。參苓白術(shù)散在腫瘤領(lǐng)域的研究越來越廣泛，臨床應(yīng)用療效頗豐，但在CRC中的實驗研究并不多見。

Linc01615在多種腫瘤中作為促癌基因?qū)δ[瘤細(xì)胞生物學(xué)行為進(jìn)行調(diào)控。然而在CRC中，Linc01615的表達(dá)情況研究尚少。miR-491-5p是一種腫瘤抑制因子，miR-491-5p參與對鼻咽癌、前列腺癌、乳腺癌腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)。課題組在前期已對Linc01615/miR-491-5p調(diào)控軸進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)Linc01615及miR-491-5p 基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，Linc01615在CRC中作為促癌基因發(fā)揮作用，而miR-491-5p作為抑癌基因發(fā)揮作用，Linc0165通過調(diào)節(jié) miR-491-5p 的表達(dá)調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞的生物學(xué)功能。結(jié)合科室臨床觀察及國內(nèi)外同行研究成果發(fā)現(xiàn)參苓白術(shù)散具有抗腫瘤作用，本研究推論參苓白術(shù)散可能通過Linc01615/miR-491-5p 途徑調(diào)控結(jié)直腸癌的生物學(xué)功能，并深入探索參苓白術(shù)散治療CRC的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 SD雄性大鼠28只，SPF級，體重（235±15）g，許可證號：SCXK（湘）2019-0014，購買于長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動物飼養(yǎng)于湖南省中醫(yī)藥研究院。實驗通過湖南省中醫(yī)藥研究院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)（編號：2021-0039）。

1.1.2 藥物 人參（批號20201201），白術(shù)（批號041104），茯苓（批號211001），山藥（批號210401），薏苡仁（批號031201），蓮子肉（批號211202），陳皮（批號211001），白扁豆（批號210330），砂仁（批號112205），桔梗（批號122404），甘草（批號2110101）。由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院新匯藥房提供，質(zhì)量均符合《中國藥典》2020年版標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.3 試劑 人結(jié)直腸癌細(xì)胞系LoVo（GENINK），RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco），胰酶Trypsin-EDTA（0.25%）（Gibco），F(xiàn)BS（Gibco），F(xiàn)-12K（Gibco），Lipofectamine2000（invitrogen），Opti-MEM（Gibco），Transwell小室（Corning），Matrigel基質(zhì)膠（BD），結(jié)晶紫染色液（Biosharp），Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（Beyotime），細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（Beyotime），異氟烷（江蘇恒豐強）。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠含藥血清的制備 參苓白術(shù)散成人臨床使用劑量：人參15 g，白術(shù)15 g，茯苓15 g，山藥15 g，薏苡仁9 g，蓮子肉9 g，陳皮9 g，白扁豆12 g，砂仁6 g，桔梗6 g，甘草9 g。根據(jù)大鼠與人的劑量換算系數(shù)6.3，大鼠給藥劑量10.8 g/kg，熬制參苓白術(shù)散藥液為2 g/mL濃縮液后冰箱內(nèi)保存，每日使用時提前復(fù)溫。將28只大鼠隨機(jī)分為7組，1組為空白組（4只），另6組為給藥組（24只）。待適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，按照上述計算劑量，給藥組每日予參苓白術(shù)散灌胃，空白組予等量生理鹽水，連續(xù)灌胃1周后提取血清。大鼠末次給藥1 h后，異氟烷吸入麻醉后經(jīng)腹主動脈取血，室溫靜置1 h后，3000rpm離心15 min，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 取對數(shù)生長期LoVo細(xì)胞分別用 Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染oe Linc01615、siRNA Linc01615及miR-491-5p mimics、抑制劑以人為地增強或抑制這些RNA 的表達(dá)水平，oe Linc01615 和siRNA Linc01615由賽默飛世爾科技公司提供，miR-491-5pmimics及抑制劑由上海吉凱基因公司提供，轉(zhuǎn)染過程嚴(yán)格按照Lipofectamine 2000試劑說明書進(jìn)行，再用大鼠血清處理轉(zhuǎn)染后的LoVo細(xì)胞溶液24h。轉(zhuǎn)染細(xì)胞分組：A：空白對照組；B：參苓白術(shù)散組；C：參苓白術(shù)散組+siRNA Linc01615；D：參苓白術(shù)散組+oe Linc01615，E：參苓白術(shù)散組+miR-491-5p mimics，F(xiàn)：參苓白術(shù)散組+miR-491-5p抑制劑組，G：參苓白術(shù)散組+miR-491-5p mimics+oe Linc01615。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡和周期改變 在LoVo細(xì)胞中加入 Annexin V-FITC結(jié)合液，碘化丙啶（PI）染色液；室溫下使用鋁箔避光孵育15min，隨后置于冰中；染色結(jié)束后即刻流式細(xì)胞儀檢測凋亡情況。另取LoVo細(xì)胞加入預(yù)冷70%乙醇，4℃保存，固定過夜；樣品中加入PI染色液，充分重懸細(xì)胞，室溫避光孵育30min；流式細(xì)胞儀檢測，分析細(xì)胞周期。

1.2.4 Transwell法檢測細(xì)胞的侵襲情況 提前拿出Matrigel膠融化，變?yōu)橐簯B(tài)使用；加入到transwell小室底膜的上室面，培養(yǎng)箱中靜置2h成膠；取細(xì)胞懸液加入到小室中，再在下層小室中加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基；結(jié)晶紫染色20min，洗去結(jié)晶紫，棉簽輕緩擦拭小室內(nèi)側(cè)；顯微鏡拍照并記錄，取3個視野。計算侵襲過基底膜的LoVo細(xì)胞數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)由SPSS 26統(tǒng)計分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較若符合正態(tài)分布且方差齊時用方差分析，兩兩比較用LSD檢驗，方差不齊時用Dunnett’s T3檢驗；反之用非參數(shù)檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LoVo細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變 參苓白術(shù)散處理細(xì)胞后（圖1B），細(xì)胞數(shù)目減少，抑制了細(xì)胞生長；在分別加入siRNA Linc01615和 miR-491-5p mimics后抑制效果更為顯著（圖1C、圖1E），說明參苓白術(shù)散可以促進(jìn)LoVo細(xì)胞的死亡，抑制linc01615和過表達(dá)miR-491-5p會加重細(xì)胞死亡進(jìn)程。詳見圖1。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測LoVo細(xì)胞的凋亡和周期改變 空白對照組、參苓白術(shù)散組、參苓白術(shù)散組+siRNA Linc01615、參苓白術(shù)散組+miR-491-5p mimics的凋亡率分別為1.2%、10.74%、11.54%、11.67%，參苓白術(shù)散組中LoVo細(xì)胞的凋亡率增加，且在分別加入siRNA Linc01615和miR-491-5p mimics后凋亡率增加更顯著。而在參苓白術(shù)散組+miR-491-5p mimics+oe Linc01615組的凋亡率為1.73%，過表達(dá)的Linc01615可部分逆轉(zhuǎn)miR-491-5p mimics對LoVo細(xì)胞的促凋亡作用。詳見圖2、3。

空白組G1期細(xì)胞占比為54.14%，參苓白術(shù)散處理細(xì)胞后，G1期細(xì)胞占比增加至57.48%，抑制了細(xì)胞周期的G0/G1期；分別加入siRNA Linc01615和 miR-491-5p mimics后G1期細(xì)胞占比上升到63.40%、65.84%，抑制效果更佳顯著。詳見圖4、5。

2.3 Tranwell實驗檢測LoVo細(xì)胞的侵襲 與空白組對比，參苓白術(shù)散處理細(xì)胞后，侵襲細(xì)胞數(shù)減少（P<0.05）；與參苓白術(shù)散組相比，分別加入siRNA Linc01615和 miR-491-5p mimics后細(xì)胞數(shù)明顯減少，抑制效果更佳顯著（P<0.05），而過表達(dá)的Linc01615可阻滯過表達(dá)miR-491-5p 對LoVo細(xì)胞侵襲功能的抑制。詳見圖6、7，表1。

3 討論

目前，CRC以手術(shù)方式為主要治療手段，術(shù)前術(shù)后的放療、化學(xué)治療等為輔助手段。但化療藥物帶來的諸如骨髓抑制、胃腸反應(yīng)等毒副作用仍深深困擾著患者。中醫(yī)藥治療在促進(jìn)術(shù)后患者康復(fù)、增強體質(zhì)、減少腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)、減輕放化療的副作用方面有著獨特的優(yōu)勢。結(jié)直腸癌患者久病體虛，加上化療等外來之邪耗傷正氣，脾胃不足，所以本虛標(biāo)實為主要病機(jī)特點，健脾扶正、清熱利濕抑瘤為主要治療原則，治療上多以脾為本。參苓白術(shù)散具有健脾補氣，滲濕止瀉的療效，此治療功效也與CRC的中醫(yī)病機(jī)相符。且有實驗證明，參苓白術(shù)散能增強人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116對奧沙利鉑的敏感性，并促進(jìn)人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116凋亡，抑制細(xì)胞增殖，改變細(xì)胞周期。

LncRNA在腫瘤進(jìn)展中的作用已被廣泛研究，探尋 lncRNA 在腫瘤進(jìn)展中的功能，對于腫瘤的早期診斷、靶向治療及預(yù)后評估尤為有意義。最近的一項研究驗證了臨床和細(xì)胞樣本中Linc01615在結(jié)直腸癌的高表達(dá)，Linc01615過表達(dá)的患者往往預(yù)后不良，這也與我們前期的研究結(jié)論相一致。隨著基因表達(dá)譜研究的不斷挖掘，許多生理過程和病理的結(jié)果，包括腫瘤等疾病都被發(fā)現(xiàn)與miRNA的調(diào)控高度相關(guān)。在CRC中，Lu等發(fā)現(xiàn)miR-491-5p的表達(dá)在CRC組織和細(xì)胞系中明顯下調(diào)，且miR-491-5p表達(dá)水平與患者TNM分期和總生存期差有關(guān)。

前期研究發(fā)現(xiàn)Linc01615和miR-491-5p在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)差異，這一結(jié)果符合之前的文獻(xiàn)報道，且探索出二者的互作具有調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)功能，為進(jìn)一步替該信號通路提供有效的抑制藥物，結(jié)合我科臨床經(jīng)驗及對直腸癌裸鼠模型的預(yù)實驗，我們選取了參苓白術(shù)散進(jìn)行干預(yù)，探索參苓白術(shù)散治療CRC的分子生物學(xué)機(jī)制。

綜上所述，本研究顯示經(jīng)參苓白術(shù)散干預(yù)后，LoVo細(xì)胞的增殖被抑制、凋亡增加，細(xì)胞的G0/G1周期被阻滯，其次參苓白術(shù)散減弱LoVo細(xì)胞的侵襲能力，抑制Linc01615或過表達(dá)miR-491-5p均可促進(jìn)參苓白術(shù)散對LoVo細(xì)胞的調(diào)控作用，且過表達(dá)Linc01615可部分逆轉(zhuǎn)miR-491-5p模擬劑對參苓白術(shù)散處理后的LoVo細(xì)胞的調(diào)控功能。此次的研究結(jié)果至少可以一定程度上闡明調(diào)控Linc01615/miR-491-5p信號軸可能是參苓白術(shù)散在CRC中發(fā)揮抗腫瘤活性的重要途徑之一。

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（收稿日期：2023-08-25）