桔梗提取物木犀草素聯(lián)合磺胺嘧啶銀治療淺Ⅱ度燙傷作用研究

鄒正渝 胡龍嬌 許洲松 于倩 趙常亮

【摘 要】目的 探討桔梗成分木犀草素與磺胺嘧啶銀聯(lián)合治療淺Ⅱ度燙傷的協(xié)同作用，為優(yōu)化治療方案提供新的理論基礎(chǔ)。方法 構(gòu)建SD大鼠淺Ⅱ度燙傷模型，依據(jù)給藥情況分為五組：A組為模型組，B組為磺胺嘧啶銀組，C組為木犀草素組，D組為磺胺嘧啶銀和木犀草素聯(lián)用組，N組為正常對(duì)照組。根據(jù)給藥第4天和第7天的創(chuàng)面愈合率評(píng)價(jià)不同給藥組的療效。通過測量大鼠燙傷區(qū)域傷口直徑，采用蘇木精-伊紅（HE）染色觀察創(chuàng)面皮膚組織的病理變化，采用Western blot檢測大鼠創(chuàng)面皮膚組織血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）和Ⅰ型膠原蛋白（Coll-Ⅰ）表達(dá)，采用ELISA檢測大鼠的腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素10（IL-10）水平。結(jié)果 B組、C組第7天燙傷創(chuàng)面愈合率均高于A組（P<0.05）；D組第7天燙傷創(chuàng)面愈合率均高于A組、B組、C組（P<0.05）。D組皮膚層完整，角質(zhì)層、表皮和真皮結(jié)構(gòu)正常，皮膚毛囊及附屬結(jié)構(gòu)基本完整，恢復(fù)程度優(yōu)于B組和C組。B組、C組VEGF、Coll-Ⅰ水平高于A組，MMP-2水平低于A組（P<0.05）；B組和C組VEGF、Coll-Ⅰ、MMP-2水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；D組VEGF、Coll-Ⅰ水平均高于A組、B組、C組，MMP-2水平均低于A組、B組、C組（P<0.05）。B組、C組TNF-α水平均低于A組（P<0.05）；B組、C組TNF-α水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；A組、B組、C組IL-10水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；D組TNF-α水平均低于A組、B組、C組，IL-10水平均高于A組、B組、C組（P<0.05）。結(jié)論 磺胺嘧啶銀聯(lián)合木犀草素治療淺Ⅱ度燙傷的效果優(yōu)于單獨(dú)用藥，其潛在機(jī)制之一可能是通過下調(diào)MMP-2表達(dá)，上調(diào)VEGF、Coll-Ⅰ和IL-10表達(dá)，抑制TNF-α等因子的表達(dá)，以減輕組織炎癥，改善燙傷創(chuàng)面皮膚組織環(huán)境，促進(jìn)愈合。

【關(guān)鍵詞】木犀草素；磺胺嘧啶銀；淺Ⅱ度燙傷；創(chuàng)面愈合

中圖分類號(hào)：R285 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1004-4949（2023）24-0114-05

基金項(xiàng)目：九龍坡區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：2021-02-011-Y）

Study on the Effect of Luteolin Extracted from Platycodon Grandiflorum Combined with Silver Sulfadiazine in the Treatment of Superficial Degree Ⅱ Scalds

ZOU Zheng-yu1，2， HU Long-jiao3， XU Zhou-song1， YU Qian4， ZHAO Chang-liang5

（1.Medical Laboratory of Chongqing Jiulongpo Peoples Hospital， Chongqing 400050， China； 2.Jiulongpo District Yangjiaping Street Community Health Service Center， Chongqing 400050， China； 3.Pharmacy department of Chongqing Jiulongpo Peoples Hospital， Chongqing 400050， China；4.Institute of Life Sciences， Chongqing Medical University， Chongqing 400021， China；5.Rehabilitation Medicine Department of Chongqing Jiulongpo Peoples Hospital， Chongqing 400050， China）

【Abstract】Objective To investigate the synergistic effect of luteolin extracted from platycodon grandiflorum and silver sulfadiazine in the treatment of superficial degree Ⅱ scalds， providing new theoretical basis for optimizing the treatment plan. Methods SD rat model of superficial degree Ⅱ scald was constructed and divided into five groups according to the administration ： group A was the model group， group B was the sulfadiazine silver group， group C was the luteolin group， group D was the sulfadiazine silver and luteolin combination group， and group N was the normal control group. The efficacy of different administration groups was evaluated according to the wound healing rate on the 4th and 7th day of administration. The wound diameter in the scalded area of rats was measured. The pathological changes of wound skin tissue were observed by hematoxylineosin （HE） staining. The expressions of vascular endothelial growth factor （VEGF）， matrix metalloproteinase 2 （MMP-2） and type I collagen （Coll-Ⅰ） in wound skin tissue of rats were detected by Western blot. The levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-10 （IL-10） in rats were detected by ELISA. Results The healing rate of scald wounds in group B and group C was higher than that in group A on the 7th day （P<0.05）. The healing rate of scald wounds in group D was higher than that in group A， group B and group C on the 7th day （P<0.05）. The skin layer of group D was intact， the structure of stratum corneum， epidermis and dermis was normal， and the skin hair follicles and accessory structures were basically intact， the degree of recovery was better than that of group B and group C. The levels of VEGF and Coll-Ⅰ in group B and group C were higher than those in group A， and the level of MMP-2 was lower than that in group A （P<0.05）. There was no significant difference in the levels of VEGF， Coll-Ⅰ and MMP-2 between group B and group C （P>0.05）. The levels of VEGF and Coll-Ⅰ in group D were higher than those in group A， group B and group C， and the levels of MMP-2 were lower than those in group A， group B and group C （P<0.05）. The levels of TNF-αin group B and group C were lower than those in group A （P<0.05）. There was no significant difference in the level of TNF-αbetween group B and group C （P>0.05）. There was no significant difference in IL-10 level among group A， group B and group C （P>0.05）. The level of TNF-α in group D was lower than that in group A， group B and group C， and the level of IL-10 was higher than that in group A， group B and group C （P<0.05）. Conclusion The effect of silver sulfadiazine combined with luteolin in the treatment of superficial degree Ⅱ scalds is better than that of single drug. One of the potential mechanisms may be to down-regulate the expression of MMP-2， up-regulate the expression of VEGF， Coll-I and IL-10， and inhibit the expression of TNF-α and other factors， so as to reduce tissue inflammation， improve the skin tissue environment of scald wounds and promote healing.

【Key words】Luteolin； Sliver sulfadiazine； Superficial degree Ⅱ scald； Wound healing

桔梗是桔?？浦参锝酃５母稍锔性碥?、黃酮類、甾醇類、脂肪酸等多種化合物，具有鎮(zhèn)咳、抗炎、降血糖、降血壓等作用[1]。木犀草素（luteolin）廣泛存在于桔梗等藥用植物中，具有抗氧化、抗炎、抗菌等生物活性，常被用來制作藥物以預(yù)防和治療疾病[2]?；前粪奏ゃy（sliver sulfadiazine）屬于磺胺類抗菌藥物，是臨床燒燙傷的常用外用藥物之一[3]。有研究發(fā)現(xiàn)[4]，桔梗提取物木犀草素是桔梗促進(jìn)皮膚燙傷大鼠創(chuàng)面愈合的有效成分，可減少炎癥因子釋放，促進(jìn)血管生成。本研究旨在通過聯(lián)合使用木犀草素和磺胺嘧啶銀干預(yù)大鼠淺Ⅱ度燙傷模型的愈合過程，以期尋找一種更為有效的燙傷綜合治療方案，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和藥品 選取20只成年雄性清潔級(jí)SD大鼠，體重220～250 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供[許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004]。大鼠飼養(yǎng)和建模過程在重慶威斯騰生物醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司進(jìn)行，分籠飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度23 ℃～25 ℃，自由飲水進(jìn)食，動(dòng)物進(jìn)入動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。木犀草素購自北京索萊寶科技有限公司，磺胺嘧啶銀購自美國MedChemExpress公司。

1.2 試劑 多聚甲醛和水合氯醛購自生工生物工程（上海）股份有限公司；脫毛膏購自廣州露韓秀生物技術(shù)有限公司；蘇木素-伊紅染液（hematoxylin-eosin，HE）購自碧云天；中性樹脂購自國藥集團(tuán)；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細(xì)胞介素10（interleukin-10，IL-10）ELISA試劑盒購自達(dá)科為；血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）兔抗體購自HUABIO公司；基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metallopeptidase-2，MMP-2）兔抗體和Ⅰ型膠原蛋白（collagen type Ⅰ，Coll-Ⅰ）兔抗體購自美國Affinity公司；GAPDH兔抗體購自華安公司；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG購自碧云天。

1.3 建模方法 建模前12 h禁食，腹腔注射7%水合氯醛（5 ml/kg），待充分麻醉后，使用脫毛膏脫去背部待燙傷區(qū)域被毛，將直徑15 mm、重量0.5 kg的金屬板塊置于水浴鍋中加熱至65 ℃，將其均勻地放在大鼠背部脫毛區(qū)域3 s，造成約10%的燙傷創(chuàng)面以構(gòu)建淺Ⅱ度燙傷模型。大鼠背部兩側(cè)均進(jìn)行建模。

1.4 給藥方法 根據(jù)給藥處理將燙傷大鼠模型分為五組：A組為模型組，B組為磺胺嘧啶銀組，C組為木犀草素組，D組為磺胺嘧啶銀和木犀草素聯(lián)用組，N組為正常對(duì)照組，每組3只大鼠，另5只大鼠備用。每天上午9點(diǎn)和下午3點(diǎn)給藥。在給藥之前，用生理鹽水清洗傷口以去除殘余物質(zhì)，然后將相應(yīng)的軟膏按照說明書要求涂抹在傷口上，厚度約為1.5 mm[3]，D組每次先涂抹磺胺嘧啶銀待藥物充分吸收后再涂抹木犀草素，A組不做任何給藥，N組不予任何處理。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1創(chuàng)面愈合率 分別在給藥后第4天和第7天測量燙傷創(chuàng)面區(qū)域的直徑，計(jì)算創(chuàng)面面積和創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率=（原始創(chuàng)面面積-觀察創(chuàng)面面積）/原始創(chuàng)面面積×100%。創(chuàng)面面積越小說明創(chuàng)面愈合越快。

1.5.2組織檢測 在給藥后第8天，取兩側(cè)燙傷區(qū)域的皮膚，一側(cè)皮膚使用4%多聚甲醛固定，4 ℃冰箱保存，用于HE染色，另一側(cè)皮膚于-80 ℃冰箱保存，用于蛋白質(zhì)印跡法（Western blot，WB）檢測。HE染色評(píng)估燙傷區(qū)域表皮組織，WB檢測燙傷創(chuàng)面皮膚組織的MMP-2、Coll-Ⅰ和VEGF的表達(dá)。

1.5.3血清檢測 在給藥后第8天，進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血，收集血清，置于-20 ℃冰箱保存，采用ELISA方法檢測TNF-α、IL-10水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析本研究數(shù)據(jù)，正態(tài)分布的計(jì)量資料以（x-±s）表示，進(jìn)行方差分析，兩組組間比較采用SNK法；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以[M（P25，P75）]表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)；以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 五組燙傷創(chuàng)面愈合率比較 四組第4天燙傷創(chuàng)面愈合率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；B組、C組第7天燙傷創(chuàng)愈合率均高于A組（P<0.05）；D組第7天燙傷創(chuàng)面愈合率均高于A組、B組、C組（P<0.05），見表1。

2.2 五組創(chuàng)面皮膚組織的病理變化 A組表皮結(jié)構(gòu)破壞，組織水腫壞死，炎性細(xì)胞增多；B組、C組表皮修復(fù)良好，其中B組部分上皮再生修復(fù)，有散在炎性滲出，上皮下有瘢痕增生；C組上皮部分缺失，瘢痕樣增生明顯，表面有部分炎性滲出；D組皮膚層完整，角質(zhì)層、表皮和真皮結(jié)構(gòu)正常，皮膚毛囊及附屬結(jié)構(gòu)基本完整，恢復(fù)程度優(yōu)于B組和C組；N組皮膚表皮完整，角質(zhì)層、表皮和真皮結(jié)構(gòu)正常，皮膚毛囊及附屬結(jié)構(gòu)完整，見圖1。

2.3 五組VEGF、MMP-2、Coll-Ⅰ蛋白表達(dá)水平比較 B組和C組VEGF、Coll-Ⅰ水平高于A組，MMP-2水平低于A組（P<0.05）；B組和C組VEGF、Coll-Ⅰ、MMP-2水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；D組VEGF、Coll-Ⅰ水平均高于A組、B組、C組，MMP-2水平均低于A組、B組、C組（P<0.05），見圖2、表2。

2.4 五組血清TNF-α、IL-10水平比較 B組、C組TNF-α水平均低于A組（P<0.05）；A組、B組、C組IL-10水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；D組TNF-α水平均低于A組、B組、C組，IL-10水平均高于A組、B組、C組（P<0.05），見表3。

3 討論

淺Ⅱ度燙傷常見于開水、熱湯、熱油造成的燙傷，以及持續(xù)時(shí)間比較短的火焰燒傷等，主要表現(xiàn)為真皮損傷，局部紅腫疼痛，創(chuàng)面滲液較多，有大小不等的水皰，如不及時(shí)處理或處理不佳，會(huì)加重皮膚損傷程度，不僅減慢愈合時(shí)間，還可能會(huì)留下瘢痕，對(duì)患者的身體和心理產(chǎn)生一定的影響[5，6]。磺胺嘧啶銀是治療燙傷的一種常用的外用藥物，其藥效也在研究中得以證實(shí)[3]，但容易造成皮膚局部刺激性、皮疹、皮炎、不良反應(yīng)較多，甚至?xí)?dǎo)致創(chuàng)面組織脫水干燥，對(duì)燙傷后疼痛無緩解功效[7，8]。木犀草素是一種天然的黃酮類化合物，存在于桔梗、金銀花等多種中藥中，具有抗炎、抗氧化、抗過敏、抗腫瘤等多種藥理活性，通過抑制氧化自由基成為抗皮膚衰老和炎癥的調(diào)節(jié)劑[9-11]。研究發(fā)現(xiàn)[4]，木犀草素是促進(jìn)皮膚燙傷大鼠創(chuàng)面愈合的有效成分。也有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[12]，木犀草素對(duì)兔耳增生性瘢痕抑制作用，局部涂抹木犀草素可以改善小鼠干燥性皮膚瘙癢，均顯示了木犀草素對(duì)于創(chuàng)面愈合的有益作用。為解決磺胺嘧啶銀的諸多不良反應(yīng)，本研究通過磺胺嘧啶銀與木犀草素聯(lián)合應(yīng)用，通過檢測創(chuàng)傷修復(fù)相關(guān)分泌因子以及炎癥相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵因子的表達(dá)情況，尋找潛在的機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，D組第7天燙傷創(chuàng)面愈合率均高于A組、B組、C組（P<0.05）；D組VEGF、Coll-Ⅰ、IL-10水平均高于A組、B組、C組，MMP-2、TNF-α水平均低于A組、B組、C組（P<0.05），提示磺胺嘧啶銀和木犀草素聯(lián)合治療淺Ⅱ度燙傷的效果優(yōu)于單獨(dú)用藥，可加快創(chuàng)面皮膚的結(jié)痂和愈合。分析磺胺嘧啶銀聯(lián)合木犀草素的作用機(jī)制可能是通過上調(diào)VEGF促進(jìn)周圍血管形成，下調(diào)MMP-2表達(dá)，上調(diào)Coll-Ⅰ表達(dá)，抑制透明質(zhì)酸酶和膠原酶的活性，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)更加穩(wěn)定，角質(zhì)形成細(xì)胞從傷口邊緣遷移，形成完整的細(xì)胞片[13]，從而緩解由磺胺嘧啶銀造成的創(chuàng)面組織脫水干燥、皮炎、皮疹等不良反應(yīng)，增加角質(zhì)形成細(xì)胞的傷口愈合能力；另一方面，通過上調(diào)IL-10表達(dá)，上調(diào)轉(zhuǎn)錄活化因子6（signal transduction and activator of transcription 6，STAT6）和抑制轉(zhuǎn)錄激活子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）[14]，從而抑制單核巨噬細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)，進(jìn)一步抑制LPS和IFN-γ導(dǎo)致的TNF-α等因子分泌，實(shí)現(xiàn)對(duì)核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）、激活蛋白1（activator protein，AP-1）等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，從而調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路，提升抗炎活性，促進(jìn)傷口愈合[15]。

綜上所述，磺胺嘧啶銀和木犀草素聯(lián)合用藥可促進(jìn)淺Ⅱ度燙傷的創(chuàng)面皮膚愈合，提高臨床有效率，可作為潛在的臨床上治療淺Ⅱ度燙傷的治療方案之一。下一步，研究團(tuán)隊(duì)將對(duì)淺Ⅱ度臨床燙傷患者進(jìn)行磺胺嘧啶銀和木犀草素聯(lián)合用藥的臨床試驗(yàn)和進(jìn)一步的機(jī)制探討，以進(jìn)行臨床有效性和安全性的評(píng)估，為未來的研究提供更多的理論基礎(chǔ)。

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編輯 扶田