CircRTN4調(diào)節(jié)miR-224-5p/MYT1L軸對膠質(zhì)母細胞瘤細胞惡性生物學行為的影響

劉應(yīng)剛, 李維民, 龍 勇, 向城衛(wèi), 張施遠, 陳星宇

(四川省遂寧市中心醫(yī)院, 四川 遂寧 629018)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤仍然是全球最常見的原發(fā)性腦惡性腫瘤,膠質(zhì)母細胞瘤(GM)是膠質(zhì)瘤中惡性程度最高的病理類型,盡管治療方法有所進步,但患者的預后仍然很差。因此,探索GM的發(fā)病機制,尋找新的治療靶點和治療方法意義重大[1]。環(huán)狀RNAs(circRNAs)大部分由外顯子通過頭尾連接產(chǎn)生,在膠質(zhì)瘤的發(fā)展過程中可通過微小RNA(miRNAs)調(diào)節(jié)基因表達[2]。CircRTN4也稱hsa_circ_0001006,在許多癌癥中異位表達,如胃癌、胰腺癌等,但其在GM中研究甚少[3]。生物信息學發(fā)現(xiàn)miR-224-5p分別與CircRTN4、髓磷脂轉(zhuǎn)錄因子1樣(MYT1L)存在結(jié)合位點,沉默MYT1L表達或上調(diào)miR-224-5p顯著降低神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的增殖、遷移和侵襲[4-5]。但CircRTN4能否通過miR-224-5p/MYT1L軸影響GM細胞惡性生物學行為尚未報道。本研究旨在探索CircRTN4對GM細胞惡性生物學行為影響及相關(guān)作用機制的研究。

1 材料與方法

1.1細胞來源和培養(yǎng)：中國科學院提供人GM細胞系U118、U87、U251和LN229以及正常人星形膠質(zhì)細胞細胞系NHA;然后在含有100 U/mL青霉素、10%胎牛血清和100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述細胞,并在37℃下、5% CO2中孵育,當細胞融合達到70-90%時,使用0.25%胰蛋白酶消化并進行傳代。

1.2主要試劑與儀器：RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(賽默飛世爾科技公司);青霉素、鏈霉素(Hyclone);RNAiso Plus試劑(Takara公司);逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(Takara公司);沉默circRTN4 shRNA(sh circRTN4)序列及陰性對照(sh NC)、miR-224-5p抑制劑(miR-224-5p inhibitor)及抑制劑陰性對照(inhibitor NC)、miR-224-5p過表達(miR-224-5p mimics)及過表達陰性對照(mimics NC)(上海基因制藥有限公司);CCK-8試劑(天根生物技術(shù)有限公司);膜聯(lián)蛋白V-FITC凋亡試劑盒(BD Biosciences公司);Transwell室(Millipore公司);增殖蛋白(ki-67)、凋亡蛋白(cleaved Caspase-3)、MYT1L一抗(Abcam公司);轉(zhuǎn)膜儀、凝膠成像分析儀、iMark酶標儀(Bio-Rad公司);FACSVia流式細胞儀(美國BD公司);7300熒光定量PCR儀(美國ABI公司);光學顯微鏡(上海蔡康光學儀器有限公司)。

1.3方 法

1.3.1qRT-PCR檢測GM細胞系及NHA細胞中CircRTN4、miR-224-5p、MYT1L mRNA表達水平：從人GM細胞系U118、U87、U251和LN229細胞及NHA細胞中采用RNAiso Plus試劑提取總RNA,隨后用逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。SYBR Green Master Mix用作熒光指示劑,擴增反應(yīng)在ABI7300系統(tǒng)上進行。以GAPDH和U6作為本研究中的內(nèi)源對照。以2-△△Ct計算CircRTN4、miR-224-5p、MYT1L mRNA相對基因表達。見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.2細胞分組及處理：取對數(shù)生長期的U251進行如下分組處理：空白組、sh NC組、sh circRTN4組、sh circRTN4+inhibitor NC組、sh circRTN4+miR-224-5p inhibitor組;其中空白組不做處理,sh NC組、sh circRTN4組、sh circRTN4+inhibitor NC組、sh circRTN4+miR-224-5p inhibitor組分別使用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染或共轉(zhuǎn)染上述質(zhì)粒和小RNA至U251細胞,轉(zhuǎn)染48h后進行指標分析。

1.3.3CCK-8法檢測細胞增殖：收集細胞并將濃度調(diào)節(jié)至2×103細胞/孔并接種至96孔板中,然后按照上述分組將細胞在培養(yǎng)箱中孵育0、24、48h,向每孔中加入10 μL CCK-8,并在37℃下保持2h。然后使用酶標儀檢測每個孔在450nm處的吸光度(A)值。

1.3.4qRT-PCR檢測各組U251細胞中CircRTN4、miR-224-5p、MYT1L mRNA表達水平：操作步驟同1.3.1。

1.3.5流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡：將各組U251細胞接種在6孔板中,然后在室溫下以1000×g離心3min,收集U251細胞(1×105)用冷PBS沖洗兩次,以1×結(jié)合緩沖液重新懸浮細胞,然后加入5 μL異硫氰酸熒光素標記的膜聯(lián)蛋白V和5 μL PI,于25℃黑暗中孵育20min,最后通過流式細胞儀檢測細胞凋亡,FlowJo v10軟件用于細胞凋亡分析。

1.3.6Transwell實驗檢測細胞遷移、侵襲：細胞侵入實驗：預先涂覆Matrigel并在4℃預冷卻過夜,然后200 μL U251細胞懸液(細胞重懸于無血清培養(yǎng)基中,1×105細胞/mL)加入到上室中,并600 μL 10% FBS的培養(yǎng)基加入到下室中。在37℃的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,然后移去上室,用4%多聚甲醛固定細胞,并用0.1%結(jié)晶紫溶液染色,PBS沖洗細胞3次后,于光學顯微鏡下隨機選擇五個視野分析細胞侵入。但對于遷移分析,不使用Matrigel,其他步驟同侵入實驗。

1.3.7驗證miR-224-5p分別與CircRTN4、MYT1L的靶向關(guān)系：將含有特定的野生型(WT)或突變型(MUT)miR-224-5p結(jié)合位點的CircRTN4或MYT1L 3’UTR序列克隆到熒光素酶載體中,以構(gòu)建CircRTN4-WT、MYT1L-WT或CircRTN4-MUT、MYT1L-MUT載體。將上述載體與miR-224-5p mimics及mimics NC共轉(zhuǎn)染至U251細胞,48h后收獲細胞,使用雙熒光素酶報告試劑盒測量熒光素酶活性。

1.3.8Western blot檢測cleaved Caspase-3、ki-67、MYT1L蛋白表達水平：將各組U251細胞用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液提取總蛋白,然后高速離心20min(13000 r/min,4℃),離心后收集上清液,BCA蛋白檢測試劑盒進行濃度定量。將蛋白質(zhì)樣品在100℃煮沸并變性5min,將蛋白質(zhì)在10% SDS-PAGE上分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉1h后,隨后加入稀釋的第一抗體(cleaved Caspase-3、ki-67、MYT1L),并將膜在4℃孵育過夜,然后與結(jié)合HRP的第二抗體相互作用2h,軟件分析目的蛋白表達。

1.3.9動物體內(nèi)實驗：將6周齡的BALB/c裸鼠(廈門大學,許可證號：SCXK(閩)2018-0003)隨機分為敲除CircRTN4(sh CircRTN4)組、陰性對照(sh NC)組、空白組,每組10只裸鼠。分別將轉(zhuǎn)染的sh CircRTN4或sh NC U251細胞(3×106細胞)皮下注射到裸鼠中,注射后30d,對裸鼠實施安樂死,并切除腫瘤、稱重。

2 結(jié) 果

2.1GM細胞系及NHA細胞中CircRTN4、miR-224-5p、MYT1L mRNA表達水平：與NHA細胞相比,U118、U87、U251和LN229細胞中CircRTN4、MYT1L mRNA表達增加,miR-224-5p表達下降(P<0.05),且U251細胞中變化最為顯著,故作為后續(xù)研究對象,見表2。

表2 CircRTN4 miR-224-5p MYT1L mRNA表達水平比較

2.2各組U251細胞增殖變化：sh circRTN4組24h、48h A450值低于空白組、sh NC組(P<0.05);sh circRTN4+miR-224-5p inhibitor組24h、48h A450值高于sh circRTN4+inhibitor NC組(P<0.05),見表3。

表3 各組U251細胞A450值的比較

2.3各組U251細胞CircRTN4、miR-224-5p、MYT1L mRNA表達變化：sh circRTN4組CircRTN4、MYT1L mRNA表達低于空白組、sh NC組,但miR-224-5p表達增加(P<0.05);sh circRTN4+miR-224-5p inhibitor組MYT1L mRNA表達高于sh circRTN4+inhibitor NC組,但miR-224-5p表達下降(P<0.05),CircRTN4表達無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組U251細胞CircRTN4 miR-224-5p MYT1L mRNA表達水平比較

2.4各組U251細胞凋亡變化：sh circRTN4組凋亡率高于空白組、sh NC組(P<0.05);sh circRTN4+miR-224-5p inhibitor組凋亡率低于sh circRTN4+inhibitor NC組(P<0.05),見圖1、表5。

圖1 流式細胞儀檢測細胞凋亡

表5 各組U251細胞凋亡率的比較

2.5各組U251細胞遷移、侵襲變化：sh circRTN4組遷移、侵襲數(shù)低于空白組、sh NC組(P<0.05);sh circRTN4+miR-224-5p inhibitor組遷移、侵襲數(shù)高于sh circRTN4+inhibitor NC組(P<0.05),見圖2、表6。

圖2 觀察細胞遷移、侵襲變化

表6 各組U251細胞遷移侵襲數(shù)的比較

2.6驗證miR-224-5p分別與CircRTN4、MYT1L的靶向關(guān)系：數(shù)據(jù)庫顯示miR-224-5p分別與CircRTN4、MYT1L存在結(jié)合位點。如圖3、4。miR-224-5p mimics+CircRTN4-WT組熒光素酶活性低于mimics NC+CircRTN4-WT組(P<0.05),見表7。miR-224-5p mimics+MYT1L-WT組熒光素酶活性低于mimics NC+MYT1L-WT組(P<0.05),見表8。

圖3 miR-224-5p與CircRTN4的結(jié)合位點

圖4 miR-224-5p與MYT1L的結(jié)合位點

表7 CircRTN4靶向調(diào)節(jié)

表8 miR-224-5p靶向調(diào)節(jié)

2.7各組U251細胞cleaved Caspase-3、ki-67、MYT1L蛋白的表達水平：sh circRTN4組ki-67、MYT1L表達低于空白組、sh NC組,但cleaved Caspase-3表達增加(P<0.05);sh circRTN4+miR-224-5p inhibitor組ki-67、MYT1L表達高于sh circRTN4+inhibitor NC組,但cleaved Caspase-3表達下降(P<0.05)。見圖5、表9。

圖5 細胞中cleaved Caspase-3、ki-67、MYT1L蛋白表達(Western blot圖)

表9 各組細胞中cleaved Caspase-3 ki-67 MYT1L表達的比較

2.8干擾circRTN4對移植瘤裸鼠的影響：干擾circRTN4較對照組、sh NC組腫瘤質(zhì)量顯著降低(P<0.05),見表10。

表10 干擾circRTN4對移植瘤裸鼠腫瘤質(zhì)量的比較

3 討 論

GM是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性侵襲性腫瘤之一,但神經(jīng)膠質(zhì)瘤的確切病因仍不清楚,近年來靶向治療可預防惡性腫瘤并提高患者存活率[6]。因此確定GM治療的潛在分子靶點勢在必行。

近來年的研究表明,circRNAs的異常表達與包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤在內(nèi)的人類惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[7]。研究發(fā)現(xiàn)小鼠腦中,circRTN4在表達隨著原代神經(jīng)元的分化而增加,參與調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)育[8]。先前研究顯示[3],circRTN4被確定為胰腺癌腦轉(zhuǎn)移的潛在治療靶點和生物標志物?；诖?本研究推測circRTN4在GM中上調(diào),參與GM發(fā)展。在多種GM細胞系研究中,circRTN4均顯著上調(diào),與多種其他腫瘤研究趨勢相吻合,尤其是U251細胞變化最為顯著。當沉默circRTN4處理U251細胞后,細胞遷移、侵襲數(shù)、24h、48h A450值顯著降低,細胞凋亡顯著增加,提示沉默circRTN4可抑制U251細胞增殖、侵襲及遷移,促進其凋亡。Western blot結(jié)果顯示ki-67蛋白表達降低,cleaved Caspase-3表達增加,進一步表明沉默circRTN4可抑制U251細胞惡性行為學發(fā)展。

CircRNA可以通過miRNA反應(yīng)元件吸附miRNA,間接調(diào)節(jié)基因表達,而miRNA是一種調(diào)節(jié)mRNA翻譯的非編碼小RNA轉(zhuǎn)錄物,參與調(diào)節(jié)細胞增殖、細胞凋亡、胚胎發(fā)育等多種生物學過程以及腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[9]。研究發(fā)現(xiàn)miR-224-5p可抑制甲狀腺乳頭狀癌、黑色素瘤包括GM在內(nèi)的腫瘤發(fā)展[10-12]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-224-5p在多種GM細胞系表達下調(diào),通過生物信息學分析預測了circRTN4與miR-224-5p的結(jié)合位點。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灐RT-PCR證實circRTN4能吸附miR-224-5p并負調(diào)控其表達,提示circRTN4可能通過上調(diào)miR-224-5p發(fā)揮抑制U251細胞惡性行為學發(fā)展的作用。同時文章還發(fā)現(xiàn)MYT1L是circRTN4-miR-224-5p的下游靶點,在GM細胞系中上調(diào),與先前研究相吻合[13]。沉默circRTN4表達增加miR-224-5p的表達,但減少MYT1L的表達,且MYT1L被鑒定為miR-224-5p的靶標并負調(diào)控其表達,提示circRTN4可能通過上調(diào)miR-224-5p/MYT1L軸抑制GM細胞惡性生物學行為發(fā)展。為進一步驗證實驗結(jié)論,以miR-224-5p inhibitor進行回復驗證,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-224-5p inhibitor逆轉(zhuǎn)了沉默CircRTN4對U251細胞惡性生物學行為的抑制作用,提示沉默CircRTN4抑制U251細胞惡性生物學行為發(fā)展,可能與上調(diào)miR-224-5p/MYT1L軸有關(guān)。最后文章進行了動物體內(nèi)實驗研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默CircRTN4可抑制裸鼠移植瘤生長,表明CircRTN4可能成為治療GM細胞的靶點。

綜上所述,沉默CircRTN4調(diào)節(jié)miR-224-5p/MYT1L軸抑制U251細胞惡性生物學行為,CircRTN4有望成為治療GM的靶點和生物標志物,但由于實驗僅是初步研究,結(jié)論仍需進一步驗證。