運(yùn)用復(fù)發(fā)型膽總管結(jié)石患者膽道細(xì)菌建立豚鼠膽石癥模型

卞昊宇, 韓 冉, 段學(xué)光, 姚玉璞, 呂福琪, 魏驕陽, 張立平

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院, 北京 100078 2.北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院, 北京 100029)

膽總管結(jié)石(common bile duct stones,CBDS)作為膽石癥中的一類,多易合并急性化膿性膽管炎等急腹癥威脅人們的生命健康。目前對于CBDS的治療通常采用經(jīng)內(nèi)鏡逆行胰膽管造影術(shù)(endoscopic retrograde cholangiopancreatography,ERCP)、內(nèi)鏡下膽道括約肌切開術(shù)(endoscopic biliary sphincterotomy,EST)等,但術(shù)后存在著較高的復(fù)發(fā)率,有研究發(fā)現(xiàn)ERCP術(shù)后CBDS的復(fù)發(fā)率為16.53%,復(fù)發(fā)的中位時間為10.25個月[1]。其中EST等術(shù)式會導(dǎo)致Oddi括約肌(sphincter of Oddi,SO)功能的部分喪失,使十二指腸細(xì)菌逆行進(jìn)入患者的膽道系統(tǒng),成為CBDS復(fù)發(fā)的危險因素之一?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),除內(nèi)鏡操作導(dǎo)致膽道中出現(xiàn)細(xì)菌外,在本應(yīng)為無菌的膽道環(huán)境中也出現(xiàn)了由十二指腸移位而來的細(xì)菌,并且在膽石癥患者的結(jié)石中發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌成分,這些均證明膽道微生物在膽石癥的形成中發(fā)揮了重要作用[2]。目前基于膽道細(xì)菌感染所建立的膽石癥動物模型,多采用大腸桿菌或假單胞菌屬的單一菌種進(jìn)行造模,造模后動物死亡率高,成石周期長,操作難度較高,且不符合臨床中此類病人出現(xiàn)腸膽反流后的膽道微生物組成。故本研究擬使用膽道插管注射復(fù)發(fā)型CBDS患者膽道細(xì)菌的方式建立豚鼠膽石癥模型,旨在探索并建立膽石癥動物模型造模新方式,為今后開展探究ERCP術(shù)后CBDS復(fù)發(fā)及膽石癥形成機(jī)制的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究提供可靠的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材 料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物：普通級Dunkin Hartley豚鼠(北京市昌揚(yáng)西山養(yǎng)殖場提供,機(jī)構(gòu)許可證號：SCXK(京)2021-0008)35只,200～300g,雌雄不限。在實(shí)驗(yàn)室用標(biāo)準(zhǔn)豚鼠飼料喂養(yǎng)(由中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所提供),適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,開展ERCP術(shù)后復(fù)發(fā)型CBDS動物模型建立。實(shí)驗(yàn)操作均通過中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所動物倫理審查委員會批準(zhǔn)(2023C002、2023C003)。

1.1.2膽道細(xì)菌來源：所有膽道細(xì)菌均來自于復(fù)發(fā)型CBDS患者膽總管內(nèi)膽汁,患者膽汁通過十二指腸鏡收集。在十二指腸鏡進(jìn)鏡到位后,使用20mL無菌生理鹽水沖洗活檢孔道及鏡頭先端,然后應(yīng)用弓刀切開Oddi括約肌并插管,在注射造影劑前使用無菌注射器抽取膽總管內(nèi)膽汁5mL后即刻分裝于無菌凍存管中,用于以后的細(xì)菌高通量測序分析及細(xì)菌復(fù)蘇培養(yǎng)。本研究通過北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院倫理委員會倫理審查,倫理審查批件號：JDF-IRB-2020031502。

1.1.3主要試劑與儀器：LB肉湯干粉(批號：20230710,規(guī)格：每瓶250g,有效期至2026年7月,生產(chǎn)單位：青島海博生物技術(shù)有限公司)。瓊脂粉(批號：20230225,規(guī)格：每瓶250g,有效期至2026年2月,生產(chǎn)單位：青島海博生物技術(shù)有限公司)。 ED-530XT型十二指腸鏡(FUJINON富士)、WSW-Thermo-1300-Ⅱ-A2型生物安全柜(賽默飛世爾蘇州儀器有限公司)、MJ-01型霉菌培養(yǎng)箱(黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司)、Pannoramic 250FLASH型病理切片掃描儀(匈牙利3DHISTECH公司)、生物信息分析軟件(美吉生物云)。

1.2方 法

1.2.1膽道細(xì)菌DNA擴(kuò)增、文庫構(gòu)建及測序：膽道膽汁樣本采集后立即凍存于無菌凍存管內(nèi),保存于-80℃冰箱中?；蚪M DNA 提取、文庫構(gòu)建和測序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.2.2膽道細(xì)菌的復(fù)蘇及培養(yǎng)：將LB肉湯干粉與蒸餾水按比例配置成LB肉湯液態(tài)培養(yǎng)基后,于高壓滅菌鍋(121℃,15min)中滅菌備用,待液態(tài)培養(yǎng)基冷卻后,取無菌LB液態(tài)培養(yǎng)基5mL至無菌試管中。將存放于-80℃冰箱內(nèi)的膽汁樣本取出,使用一次性無菌微生物接種環(huán)接種50μL膽汁樣本于5mL LB液態(tài)培養(yǎng)基的試管中,確保接種環(huán)蘸取的膽汁充分溶解于試管中。所有操作均在生物安全柜中進(jìn)行。菌液接種完畢將其放置于恒溫霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將成功復(fù)蘇的膽道菌液900μL與450μL無菌60%甘油溶液混合后,留置于無菌凍存管中,凍存于-80℃冰箱中保存菌群,以待動物模型造模前制備菌液時使用。

1.2.3固態(tài)培養(yǎng)基的制備與菌落計數(shù)：將LB肉湯干粉、瓊脂粉與蒸餾水按比例充分混合后,置于高壓滅菌鍋(121℃,15min)中加熱滅菌,滅菌后待培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時,將溶液均勻倒于無菌培養(yǎng)皿中,等待其冷卻,以制備LB肉湯固態(tài)培養(yǎng)基。制作平板操作均在生物安全柜中進(jìn)行。固態(tài)培養(yǎng)基制備完畢后,使用移液槍將稀釋為10-2、10-4、10-6、10-8、10-10的菌液吸取100μL分別接種在5個平板上,涂布棒涂抹均勻后將平板倒轉(zhuǎn),放置于恒溫霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。直至長出菌落后計數(shù),同時使用超微量分光光度計檢測對應(yīng)菌液吸光度并記錄數(shù)值,結(jié)合平板菌落數(shù)對應(yīng)的菌液吸光度以判斷菌液中菌落濃度。(以上操作均在北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院檢驗(yàn)科微生物實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行)

1.2.4動物實(shí)驗(yàn)分批及處理：本次實(shí)驗(yàn)分兩個階段進(jìn)行,第一階段實(shí)驗(yàn)為膽道插管、注射復(fù)發(fā)型CBDS患者菌液后,觀察動物模型長期存活率及第6、8、9周時動物膽道結(jié)石形成情況,使用的細(xì)菌從成功復(fù)蘇的6名復(fù)發(fā)型CBDS患者的膽汁樣本隨機(jī)選擇,編號為20號,膽道細(xì)菌復(fù)蘇成功后繼續(xù)培養(yǎng)12h,結(jié)合平板菌落生長情況及吸光度,本階段造模注射菌液濃度為1.5×108cfu/mL。本階段實(shí)驗(yàn),實(shí)際建立CBDS豚鼠模型20只,實(shí)驗(yàn)周期9周。第二階段實(shí)驗(yàn)在第一次實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上增大菌液注射濃度,于造模結(jié)束后第2天起每日通過取材兩只動物模型,觀察膽道系統(tǒng)成石情況,使用的菌液來自于剩余的5名復(fù)發(fā)型CBDS患者膽汁樣本中隨機(jī)選擇的膽汁樣本,編號為17號,膽道細(xì)菌復(fù)蘇成功后繼續(xù)培養(yǎng)24h,結(jié)合平板菌落生長情況及吸光度,造模注射菌液濃度為3.5×108cfu/mL。本階段實(shí)驗(yàn),實(shí)際建立CBDS豚鼠模型14只,1只豚鼠于適應(yīng)性飼養(yǎng)期間死亡,實(shí)驗(yàn)周期11d。

1.2.5ERCP術(shù)后CBDS復(fù)發(fā)模型建立方法：兩階段實(shí)驗(yàn)均采用膽總管插管、注射CBDS復(fù)發(fā)患者菌液的方式制備ERCP術(shù)后因腸膽反流導(dǎo)致膽道感染,CBDS復(fù)發(fā)動物模型。具體模型制備：動物模型制備前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。術(shù)前8～12h禁食不禁水,腹腔注射3%戊巴比妥納(40mg/kg)麻醉。右上腹正中切開3～5cm,逐層開腹直至暴露豚鼠胃及胃竇部,沿胃竇尋找十二指腸與膽總管連接處,從十二指腸大乳頭對側(cè)壁使用24G留置針穿刺十二指腸腸壁,穿刺進(jìn)入十二指腸大乳頭并將針尖插入膽總管中,確定留置針位于膽總管內(nèi)后,向膽總管內(nèi)注入菌液0.5mL并撤針,逐層縫合手術(shù)切口關(guān)腹,縫合完畢,使用碘伏消毒手術(shù)切口,并使用紗布加壓包扎。術(shù)后所有動物分籠飼養(yǎng),6h后普通飼料喂養(yǎng),自由飲水,每日予維生素C 0.2～0.4g/L加入飲用水中,每日檢查手術(shù)切口恢復(fù)情況并換藥。

1.2.6樣本采集：腹腔注射3%戊巴比妥納(40mg/kg)麻醉,暴露十二指腸大乳頭,24G留置針穿刺十二指腸腸壁,經(jīng)十二指腸大乳頭插管進(jìn)入膽總管后抽取膽汁。剖取肝臟、膽囊、膽總管后,使用4%多聚甲醛溶液沖洗固定,4℃冰箱保存。

1.2.7評價檢測：第一階段實(shí)驗(yàn)主要評價應(yīng)用膽總管插管、注射CBDS復(fù)發(fā)患者菌液的方式制備動物模型術(shù)后動物長期存活率;動物模型6周以后膽汁性狀及膽道系統(tǒng)內(nèi)結(jié)石形成情況;并留取膽汁樣本做細(xì)菌培養(yǎng)。第二階段實(shí)驗(yàn)在一階段實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,加大注射菌液的濃度,留取動物模型的肝臟、膽囊、膽總管組織并制作石蠟切片,HE染色;觀察動物模型膽汁性狀及膽道系統(tǒng)內(nèi)結(jié)石形成情況,以綜合評估本實(shí)驗(yàn)方法建立ERCP術(shù)后CBDS復(fù)發(fā)動物模型的可行性。

2 結(jié) 果

2.1復(fù)發(fā)型CBDS患者膽道細(xì)菌組成分析：本次共采集復(fù)發(fā)型膽總管結(jié)石患者膽汁樣本6例,以屬水平分析物種相對豐度柱形圖展示如圖1。其中第一階段實(shí)驗(yàn)中使用的20號膽道細(xì)菌,在屬水平分類上腸球菌屬(Enterococcus)占97.57%;第二階段使用的17號膽道細(xì)菌,在屬水平分類上前幾位分別為腸桿菌屬(Enterobacteriaceae)44.16%、擬桿菌屬(Bacteroides)29.88%、腸桿菌埃希氏菌屬(Escherichia-Shigella)17.97%、梭菌屬(Fusobacterium)3.50%、腸球菌屬(Enterococcus)2.26%。見圖1。

圖1 復(fù)發(fā)型CBDS患者膽道細(xì)菌組成情況

2.2膽道細(xì)菌功能預(yù)測分析：根據(jù)膽道細(xì)菌組成分析可得知,兩次造模使用的2個膽道細(xì)菌樣本在細(xì)菌組成上具有很大的差異性,在對所有復(fù)發(fā)型CBDS患者膽道細(xì)菌做進(jìn)一步的功能預(yù)測分析后發(fā)現(xiàn),即使膽道細(xì)菌的種類具有顯著差異,但是在能量轉(zhuǎn)換和代謝、輔酶運(yùn)輸和代謝、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、無機(jī)離子運(yùn)輸和代謝等功能上,所有復(fù)發(fā)型CBDS患者的膽道細(xì)菌具有相似性。見圖2。

圖2 復(fù)發(fā)型CBDS患者膽道細(xì)菌功能預(yù)測分析

2.3動物模型存活率及結(jié)石產(chǎn)生情況：在第一階段實(shí)驗(yàn)中,6周后豚鼠存活7只,存活率為35%,造模后1周內(nèi)為死亡高峰,共有11只豚鼠死亡,2只于造模后第2周死亡。對死亡豚鼠進(jìn)行解剖發(fā)現(xiàn),1周內(nèi)未皺縮排空的豚鼠膽道系統(tǒng)中存在少量黃色泥沙樣物質(zhì)。在第6、8、9周分批取材時發(fā)現(xiàn)所有豚鼠膽道系統(tǒng)內(nèi)膽汁均澄清,未見明顯絮狀物或泥沙樣結(jié)石。在第二階段實(shí)驗(yàn)中,造模后第2天起每日隨機(jī)選取豚鼠2只進(jìn)行取材發(fā)現(xiàn),所有豚鼠膽道系統(tǒng)中均可見散在黑色或黃色沉渣,伴或不伴膿液。通過術(shù)后第2天起至所有豚鼠死亡時止的取材過程中發(fā)現(xiàn),在增大菌液濃度后,膽道系統(tǒng)結(jié)石形成進(jìn)程加快,直至第4天時可形成完整的巨大結(jié)石,見圖3。

圖3 造模后第2天至第4天結(jié)石形成過程

2.4膽總管膽汁細(xì)菌培養(yǎng)：第一階段實(shí)驗(yàn)最終存活的7只豚鼠中,其中4只膽總管抽取的膽汁細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果呈陽性3只呈陰性。7只豚鼠在取材過程中膽總管、膽囊內(nèi)膽汁澄清,并未見泥沙樣結(jié)石產(chǎn)生。

2.5肝臟、膽囊及膽總管組織結(jié)構(gòu)及形態(tài)：第二階段實(shí)驗(yàn)予高濃度菌液插管注射后,可見肝臟組織內(nèi)膽小管周圍出現(xiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤。膽囊及膽總管粘膜上皮柱狀細(xì)胞排列整齊,組織內(nèi)未見明顯炎癥反應(yīng),見圖4、圖5。

圖4 肝臟組織HE染色(×20)

圖5 膽囊及膽總管組織HE染色(×10)

3 討 論

基于細(xì)菌通過腸膽反流進(jìn)入膽道系統(tǒng)并導(dǎo)致結(jié)石產(chǎn)生的觀點(diǎn)[3],早在上個世紀(jì)60年代,日本學(xué)者M(jìn)aki就提出了著名的膽紅素鈣結(jié)石成因的假說[4],認(rèn)為膽汁中細(xì)菌所分泌的β-Gase打破了膽紅素鈣沉淀生成和溶解的平衡狀態(tài),最終導(dǎo)致了膽色素結(jié)石的產(chǎn)生。在對于膽道細(xì)菌與CBDS復(fù)發(fā)及膽石癥形成之間關(guān)聯(lián)的進(jìn)一步研究中發(fā)現(xiàn),膽道細(xì)菌不僅會導(dǎo)致色素結(jié)石的產(chǎn)生,同時也會導(dǎo)致膽固醇類結(jié)石及混合型結(jié)石的產(chǎn)生[5],并且復(fù)發(fā)型CBDS患者膽道細(xì)菌的種類較非復(fù)發(fā)型患者存在明顯差異[6],當(dāng)患者出現(xiàn)了SO功能的紊亂,不僅增加了膽道中機(jī)會致病菌的種類,膽道細(xì)菌的組成較無結(jié)石的患者也出現(xiàn)了明顯的變化[7-8]。以上研究均證實(shí)膽道細(xì)菌在CBDS的復(fù)發(fā)及膽石癥的產(chǎn)生中發(fā)揮了重要的作用,因此探究膽道細(xì)菌與CBDS復(fù)發(fā)及膽石癥間的關(guān)聯(lián),是目前臨床及實(shí)驗(yàn)研究的重點(diǎn),而建立合適的動物模型,是開展各項(xiàng)研究的基礎(chǔ)。

目前膽石癥動物模型大多選用兔、豚鼠及小鼠。造模方式以致石飼料喂養(yǎng)法、注射藥物法、細(xì)菌植入法及人結(jié)石植入法等為主,結(jié)石形成的時間為1～8周不等[9]。致石飼料及注射藥物法作為常見的造模方式,是從改變膽汁成分的角度產(chǎn)生結(jié)石。膽道細(xì)菌植入法產(chǎn)生結(jié)石,是基于十二指腸部位的細(xì)菌隨著腸膽反流定植于膽道系統(tǒng),引發(fā)膽管長期的慢性炎癥,進(jìn)而導(dǎo)致結(jié)石產(chǎn)生及復(fù)發(fā)的理論[10-11],但是此類造模方式常需要聯(lián)合膽總管不完全梗阻以保證細(xì)菌注射后能停留在動物的膽道系統(tǒng)中,因而存在操作難度大,死亡率高等缺點(diǎn),故實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用相對較少。在細(xì)菌植入法中常使用大腸桿菌,但使用大腸桿菌單一菌種造模,與臨床中膽石癥患者膽道細(xì)菌的組成不相符[5],無法解釋為何復(fù)發(fā)型CBDS患者膽汁中的厚壁菌門等亦可成為優(yōu)勢菌種,所以此類造模方式,無法合理的闡釋膽道微生物群與CBDS復(fù)發(fā)及膽石癥之間的關(guān)系。因此,此類造模方式有待改進(jìn)。

基于以上考慮,本實(shí)驗(yàn)嘗試采用復(fù)發(fā)型CBDS患者膽道細(xì)菌作為膽道插管后注射的菌液來源。首先是基于CBDS患者的首選治療方式為ERCP術(shù),該術(shù)式相較于傳統(tǒng)手術(shù)方式,獲取患者膽汁更為簡易,且內(nèi)鏡下操作具有創(chuàng)傷小、恢復(fù)快等優(yōu)點(diǎn),術(shù)中獲取的膽汁樣本中的細(xì)菌均由十二指腸部位移位進(jìn)入膽道系統(tǒng)。其次,根據(jù)膽道細(xì)菌組成來看,雖然腸桿菌屬在膽道細(xì)菌的組成中占有絕大部分,但膽汁主要由膽鹽、膽色素、膽固醇、卵磷脂、鉀、鈉、鈣等組成,并不符合腸桿菌屬細(xì)菌生存所需要的相關(guān)生存物質(zhì)。最后,考慮到當(dāng)大腸桿菌進(jìn)入并定植于動物的膽道系統(tǒng)后,需要適應(yīng)膽道環(huán)境才能成功定植于膽道系統(tǒng),相較于已經(jīng)適應(yīng)膽道環(huán)境的復(fù)發(fā)型CBDS患者膽道中的細(xì)菌,使用這類細(xì)菌并合理的控制菌液濃度進(jìn)行造模,可以更好的模擬臨床CBDS復(fù)發(fā)節(jié)點(diǎn)時的膽道微生物群,模擬結(jié)石復(fù)發(fā)及產(chǎn)生的過程。同時結(jié)合第一階段動物模型膽道細(xì)菌的培養(yǎng)結(jié)果,存在于患者膽道中的細(xì)菌能更好的適應(yīng)膽道環(huán)境,因此可以縮短模型的建立周期并提高成功率。雖然兩次實(shí)驗(yàn)使用的細(xì)菌種類存在差異,但本研究在對多名復(fù)發(fā)型CBDS患者的膽道菌群進(jìn)行功能預(yù)測分析后發(fā)現(xiàn),復(fù)發(fā)型CBDS患者膽道中的優(yōu)勢菌種即便存在差異,但從功能預(yù)測的結(jié)果上看,不同種類的細(xì)菌,在相同的生存環(huán)境中,遵循生物進(jìn)化理論,細(xì)菌的功能表現(xiàn)出了一定的相似性。

綜上所述,通過膽道插管,膽道內(nèi)注射適當(dāng)濃度復(fù)發(fā)型CBDS患者膽道細(xì)菌菌液的方式制備膽石癥動物模型,相較于既往使用膽道插管注射大腸桿菌聯(lián)合膽道不完全梗阻的方式,成模周期短,模型成功率高,操作難度更小,動物死亡率更低,更貼合臨床ERCP術(shù)后CBDS復(fù)發(fā)及膽結(jié)石產(chǎn)生時患者膽道的微生物組成。此類造模方式的嘗試,可為更多探究膽道細(xì)菌與CBDS復(fù)發(fā)及膽石癥間關(guān)聯(lián)實(shí)驗(yàn)的開展提供基礎(chǔ)。