外周血中miR-34b表達(dá)水平對(duì)Ⅲb～Ⅳ期NSCLC患者靶向治療效果及預(yù)后的評(píng)估價(jià)值分析

張亞鵬, 任玉川, 劉 昭, 呂曉燕, 李永利

(1.山西省陽(yáng)泉市第一人民醫(yī)院腫瘤血液內(nèi)科, 山西 陽(yáng)泉 045000 2.山西省腫瘤醫(yī)院呼吸一病區(qū), 山西 太原 030013)

流行病學(xué)調(diào)查顯示,全球2018年肺癌新增病例209萬(wàn)及死亡病例176萬(wàn),至2035年全球肺癌相關(guān)死亡病例近300萬(wàn)[1]。80%～85%的肺癌為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC),其多發(fā)于中老年人群,患者早期通常無(wú)特異性癥狀,多數(shù)患者確診時(shí)病情已進(jìn)展至晚期,錯(cuò)失最佳手術(shù)時(shí)機(jī),預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)較高[2]。臨床常采用姑息性放化療、分子靶向治療等手段治療晚期NSCLC,其中分子靶向治療在NSCLC患者治療中已表現(xiàn)出較佳的療效,相比于放化療,其具有針對(duì)性強(qiáng)、患者耐受性好、毒性反應(yīng)輕等優(yōu)勢(shì)[3]。NSCLC患者預(yù)后與靶向治療效果存在聯(lián)系,準(zhǔn)確評(píng)估靶向治療效果對(duì)優(yōu)化治療方案及促進(jìn)轉(zhuǎn)歸具有重要的價(jià)值?，F(xiàn)階段臨床常采用CT或MRI復(fù)查評(píng)估NSCLC患者治療效果,同時(shí)血清腫瘤標(biāo)志物也可用于輔助評(píng)估治療效果[4]。臨床報(bào)道發(fā)現(xiàn),NSCLC患者癌組織中微小RNA-34b(microRNA-34b,miR-34b)呈低表達(dá),其表達(dá)上調(diào)能抑制NSCLC A549細(xì)胞增殖及侵襲[5]。目前臨床關(guān)于miR-34b與NSCLC患者靶向治療療效和預(yù)后關(guān)系的研究報(bào)道較少?；诖?本研究檢測(cè)Ⅲb～Ⅳ期NSCLC患者外周血miR-34b表達(dá)水平,探尋其在靶向治療效果及預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值,旨在為NSCLC治療提供新參考。

1 資料與方法

1.1臨床資料：選取2020年1月至2022年1月于我院接受靶向治療的104例NSCLC患者作為研究對(duì)象,其中男性68例,女性36例;年齡42～76歲,平均年齡(61.08±7.33)歲;鱗癌29例,腺癌75例;臨床分期：Ⅲb期63例,Ⅳ期41例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①滿足NSCLC診斷標(biāo)準(zhǔn)：臨床表現(xiàn)：早期癥狀不明顯,病情進(jìn)展后伴有氣促、發(fā)熱、痰中帶血、刺激性干咳、胸痛;體格檢查：多數(shù)患者相關(guān)陽(yáng)性體征不明顯,存在不明原因且久治難愈的肺外征象,如非游走性關(guān)節(jié)疼痛、皮肌炎、杵狀指(趾)等,體檢顯示伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移可能的表現(xiàn),如皮下結(jié)節(jié)淋巴結(jié)腫大、肝腫大伴有結(jié)節(jié)等;影像學(xué)檢查提示伴有腫瘤,多位于肺野周邊,影像學(xué)表現(xiàn)為孤立性結(jié)節(jié)或占位且邊界不清;②組織病理學(xué)確診：蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)顯示鱗狀細(xì)胞癌形態(tài)不明確,呈實(shí)體形態(tài)的低分化癌,若p40彌漫陽(yáng)性,甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1陰性,推薦診斷為NSCLC,傾向鱗狀細(xì)胞癌;HE顯示腺癌形態(tài)不明確,呈實(shí)體形態(tài)的低分化癌,若甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1或/和黏液染色陽(yáng)性,p40陰性,推薦診斷為NSCLC,傾向腺癌;③臨床分期為Ⅲb～Ⅳ期;④均行靶向治療;⑤預(yù)計(jì)生存期>3個(gè)月者;⑥思維正常,具備基本表達(dá)及溝通能力;⑦近期未行其他相關(guān)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①對(duì)靶向治療不耐受者;②繼發(fā)性肺癌或小細(xì)胞肺癌者;③免疫系統(tǒng)疾病、活動(dòng)性肺感染、血液系統(tǒng)疾病及其他惡性腫瘤者;④缺乏完整的臨床及隨訪資料者;⑤精神疾病,認(rèn)知及視聽(tīng)功能損傷者;⑥腦、心、腎等臟器損傷嚴(yán)重者。醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)本研究。

1.2方 法

1.2.1靶向治療方案：所有患者均基因檢測(cè)顯示：外顯子21突變或外顯子19缺失突變,予以患者吉非替尼靶向治療：口服鹽酸吉非替尼(HJ20171297,Kagamiishi Plant,Nipro Pharma Corporation),250mg/次,1次/d,30d為1個(gè)周期,治療4個(gè)周期。

1.2.2外周血中miR-34b表達(dá)水平檢測(cè)：采集患者入院后次日清晨空腹靜脈血3mL,離心處理(轉(zhuǎn)速3500 r/min、半徑10 cm、時(shí)間10min)后取上清液,存于-80 ℃待測(cè)。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)外周血中miR-34b：以RNeasy Mini Kit總RNA提取試劑盒提取血清中游離總RNA,以純度良好的RNA樣本為模板,逆轉(zhuǎn)錄后行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系20μL：cDNA 4.0μL,上下游引物各1μL,ddH2O 4.0μL,2×SYBR Premix10μL。選擇U6作為內(nèi)參照,上游引物序列為5'-CTC GCTTCGGCAGCACA-3' ;下游引物序列為5' -AACGCTTCA GAATTTGCGT-3'。miR-34b上游引物序列為5'-GCGGTCAATCACTAACTCC-3';下游引物序列為5'-CGTGCAGGGTCCGAGGT-3'。反應(yīng)條件：95℃ 30s,95℃ 5s,60℃ 30s,經(jīng)過(guò)40個(gè)循環(huán),獲得CT值。以2-△△CT表示 miR-34b的相對(duì)表達(dá)量,其中△CT=miR-34b平均Ct值-U6平均Ct值。

1.3靶向治療效果判定：治療4個(gè)周期后,結(jié)合實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估療效,其中完全緩解：病灶消失,無(wú)新病灶出現(xiàn),腫瘤標(biāo)記物降至正常,并至少維持4周;部分緩解：病灶長(zhǎng)徑總和低于基線≥30%,至少維持4周;疾病穩(wěn)定：病灶長(zhǎng)徑總和縮小<30%或增大>20%;疾病進(jìn)展：病灶長(zhǎng)徑總和增加>20%或出現(xiàn)新病灶。治療有效為部分緩解及完全緩解之和,治療無(wú)效為疾病穩(wěn)定及疾病進(jìn)展之和。

1.4預(yù)后評(píng)估：靶向治療結(jié)束后進(jìn)行1年隨訪,每3個(gè)月隨訪1次,終點(diǎn)事件為患者全因死亡,統(tǒng)計(jì)患者生存情況。

2 結(jié) 果

2.1Ⅲb～Ⅳ期NSCLC患者靶向治療效果及預(yù)后情況：104例Ⅲb～Ⅳ期NSCLC患者,經(jīng)靶向治療后,完全緩解17例、部分緩解23例、病情穩(wěn)定36例,疾病進(jìn)展28例。隨訪1年,104例Ⅲb～Ⅳ期NSCLC患者,未出現(xiàn)失訪者,其中生存患者32例,死亡患者72例。

2.2不同靶向治療效果NSCLC患者外周血miR-34b表達(dá)水平比較：104例Ⅲb～Ⅳ期NSCLC患者根據(jù)靶向治療效果分為有效組(完全緩解+部分緩解)40例及無(wú)效組(病情穩(wěn)定+疾病進(jìn)展)64例。有效組外周血miR-34b表達(dá)水平為(2.25±0.49),高于無(wú)效組的(1.68±0.32)(t=7.182,P<0.05)。

2.3外周血miR-34b表達(dá)水平對(duì)Ⅲb～Ⅳ期NSCLC患者靶向治療效果的評(píng)估價(jià)值：ROC曲線顯示,外周血miR-34b表達(dá)水平評(píng)估Ⅲb～Ⅳ期NSCLC患者靶向治療效果的AUC為0.856(P<0.05),截?cái)嘀禐?.94。見(jiàn)圖1、表1。

表1 外周血miR-34b表達(dá)水平對(duì)Ⅲb～Ⅳ期NSCLC患者靶向治療效果的評(píng)估價(jià)值

圖1 外周血miR-34b表達(dá)水平評(píng)估Ⅲb～Ⅳ期NSCLC患者靶向治療效果的ROC曲線

2.4不同預(yù)后Ⅲb～Ⅳ期NSCLC患者外周血miR-34b表達(dá)水平比較：104例Ⅲb～Ⅳ期NSCLC患者根據(jù)預(yù)后分為存活組(n=32)及死亡組(n=72)。存活組外周血miR-34b表達(dá)水平為(2.48±0.36),高于死亡組的(1.64±0.29)(t=12.634,P<0.05)。

2.5外周血miR-34b表達(dá)水平對(duì)Ⅲb～Ⅳ期NSCLC患者預(yù)后的評(píng)估價(jià)值：ROC曲線顯示,外周血miR-34b表達(dá)水平評(píng)估Ⅲb～Ⅳ期NSCLC患者預(yù)后的AUC為0.916(P<0.05),截?cái)嘀禐?.16。見(jiàn)圖2、表2。

表2 外周血miR-34b表達(dá)水平對(duì)Ⅲb～Ⅳ期NSCLC患者預(yù)后的評(píng)估價(jià)值

圖2 外周血miR-34b表達(dá)水平評(píng)估Ⅲb～Ⅳ期NSCLC患者預(yù)后的ROC曲線

2.6不同外周血miR-34b表達(dá)水平Ⅲb～Ⅳ期NSCLC患者的生存曲線分析：結(jié)合2.5中Ⅲb～Ⅳ期NSCLC患者外周血miR-34b=2.16為不良預(yù)后的臨界值,104例Ⅲb～Ⅳ期NSCLC患者中,miR-34b>2.16患者34例,其中1年死亡9例;miR-34b≤2.16患者70例,其中1年死亡63例。Log-rank檢驗(yàn)顯示,miR-34b>2.16組和miR-34b≤2.16組患者生存率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=27.767,P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 不同外周血miR-34b表達(dá)水平Ⅲb～Ⅳ期NSCLC患者的生存曲線

3 討 論

對(duì)于錯(cuò)過(guò)最佳手術(shù)時(shí)機(jī)、已不可切除的Ⅲb～Ⅳ期NSCLC患者或是自身基礎(chǔ)疾病導(dǎo)致無(wú)法耐受手術(shù)的患者,分子靶向治療可為患者臨床癥狀和生存率的改善帶來(lái)新的希望和方向。研究指出,接受分子靶向治療可使40%～50%晚期NSCLC患者獲益,能延長(zhǎng)生存期,對(duì)于提高患者生命質(zhì)量具有積極作用[6]。但由于患者存在個(gè)體差異性,不同患者接受分子靶向治療的效果不一,準(zhǔn)確預(yù)測(cè)Ⅲb～Ⅳ期NSCLC患者治療療效和預(yù)后對(duì)于盡早調(diào)整治療方案和延長(zhǎng)患者生存期具有重要作用[7]。

本研究中Ⅲb～Ⅳ期NSCLC患者經(jīng)分子靶向治療后,治療有效率為38.46%,61.54%患者治療無(wú)效,與韓文梅等[8]報(bào)道的Ⅲb～Ⅳ期NSCLC患者靶向治療有效率37.14%相近。進(jìn)一步的研究顯示,有效組外周血中miR-34b表達(dá)水平高于無(wú)效組,表明miR-34b可能參與NSCLC的發(fā)生有關(guān),檢測(cè)Ⅲb～Ⅳ期NSCLC患者外周血miR-34b表達(dá)水平可能有助于輔助評(píng)估靶向治療的效果。miR-34是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)與肺癌預(yù)后具有重要聯(lián)系的一種miRNA分子,異常表達(dá)的miR-34水平可影響對(duì)腫瘤生物學(xué)行為的調(diào)控作用,進(jìn)而影響其發(fā)生和發(fā)展[9]。有報(bào)道顯示,miR-34b在前列腺癌患者血漿中呈較低表達(dá),其水平與前列腺癌的病理分級(jí)、TNM分期等臨床病理特征有關(guān)[10]。本研究發(fā)現(xiàn),外周血miR-34b表達(dá)水平評(píng)估Ⅲb～Ⅳ期NSCLC患者靶向治療效果的AUC為0.856,證明了外周血miR-34b表達(dá)水平對(duì)Ⅲb～Ⅳ期NSCLC患者靶向治療效果具有一定的評(píng)估價(jià)值。

miR-34b已被研究指出具有抑癌作用,其在NSCLC患者外周血中的異常低表達(dá)水平可能通過(guò)與下游基因p53和MDM2形成反饋回路來(lái)調(diào)控細(xì)胞周期,抑制其促凋亡功能,進(jìn)而促進(jìn)癌癥進(jìn)展,導(dǎo)致其對(duì)靶向治療藥物反應(yīng)降低,影響其治療效果并進(jìn)一步影響患者生存和預(yù)后情況[11]。本研究對(duì)104例行靶向治療的Ⅲb～Ⅳ期NSCLC患者隨訪1年,結(jié)果顯示,32例(30.77%)患者存活,72例(69.23%)患者死亡。本研究還發(fā)現(xiàn),存活組外周血中miR-34b表達(dá)水平高于死亡組,說(shuō)明miR-34b低表達(dá)還可能與晚期NSCLC患者的不良預(yù)后有關(guān)。miR-34b抑癌機(jī)制的發(fā)揮具有多重性和復(fù)雜性,除上述影響機(jī)制外,miR-34b還可抑制腫瘤干細(xì)胞的功能,低水平的miR-34b可通過(guò)直接作用于Sox等多潛能性相關(guān)基因抑制腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移;此外,下調(diào)miR-34b還可能通過(guò)激活肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子-肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF-Met)通路抑制p53磷酸化和轉(zhuǎn)錄活性,進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移,其表達(dá)水平與肺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)[12]。本研究發(fā)現(xiàn),miR-34b>2.16組和miR-34b≤2.16組患者生存率比較存在明顯差異,提示外周血中miR-34b表達(dá)與患者的生存率有關(guān)。外周血miR-34b異常低表達(dá)提示晚期NSCLC患者體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移較強(qiáng),具有更高的轉(zhuǎn)移和死亡風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述,外周血miR-34b表達(dá)水平與Ⅲb～Ⅳ期NSCLC患者靶向治療效果及預(yù)后有關(guān),檢測(cè)外周血miR-34b表達(dá)水平有助于評(píng)估靶向治療效果及預(yù)后。