miRNA-93-5p通過(guò)調(diào)控FBXW7基因參與宮頸癌進(jìn)展

王 江

(四川省南充市中心醫(yī)院/川北醫(yī)學(xué)院附屬南充市中心醫(yī)院婦科, 四川 南充 637000)

宮頸癌是導(dǎo)致婦女在癌癥相關(guān)疾病中死亡的主要原因[1]。雖然近幾十年來(lái)在宮頸癌的管理取得了技術(shù)進(jìn)展,但宮頸癌的死亡率仍然很高。目前,宮頸癌發(fā)生和發(fā)展的相關(guān)致病機(jī)制尚未完全闡明。探索宮頸癌發(fā)展的分子機(jī)制對(duì)于建立宮頸癌的新治療策略至關(guān)重要。微核糖核酸(miRNAs)可分為致癌miRNAs和抗癌miRNAs[2],惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與腫瘤表達(dá)miRNAs的異常變化有關(guān)[3]。近年來(lái),miRNAs的功能已成為近年來(lái)癌癥靶向治療研究的熱點(diǎn)。miRNA-93-5p已被發(fā)現(xiàn)廣泛參與結(jié)腸癌、胃癌、肝細(xì)胞癌等惡性腫瘤的進(jìn)展,在癌細(xì)胞的的增殖、侵襲和遷移中發(fā)揮重要作用[4-5]。既往研究顯示,miR-93-5p可能是治療宮頸癌的潛在靶點(diǎn)[6]。FBXW7是一種重要的腫瘤抑制因子[7]。miRNAs可使癌癥細(xì)胞中的FBXW7功能失活[8]。研究發(fā)現(xiàn),FBXW7在調(diào)控宮頸癌的侵襲性中發(fā)揮重要作用[9]。然而,關(guān)于miR-93-5p是否可通過(guò)調(diào)控FBXW7影響宮頸癌的進(jìn)展,未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)調(diào)控宮頸癌細(xì)胞miR-93-5p與FBXW7的表達(dá)水平,探究miR-93-5p是否可通過(guò)調(diào)控FBXW7影響宮頸癌細(xì)胞的凋亡、增殖、遷移、侵襲水平,以期為臨床中治療宮頸癌提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器：FBXW7抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)、GAPDH抗體(美國(guó)Affinity生物技術(shù)公司)、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(賽默飛世爾科技公司)、Transwell小室(上?？祵幱邢薰?、結(jié)晶紫染色液(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)、酶標(biāo)儀、Attune CytPix 成像型流式細(xì)胞儀(美國(guó)Thermo Scientific公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)分組：收集20例臨床宮頸癌患者組織,分組為癌旁組織、宮頸癌組織,并檢測(cè)H8、Caski、HeLa、C33A,選擇宮頸癌細(xì)胞C33A。分為對(duì)照組(正常培養(yǎng))、miRNA-93-5p抑制組(轉(zhuǎn)染低表達(dá)miRNA-93-5p),FBXW7激活組(轉(zhuǎn)染高表達(dá)FBXW7)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1RT-qPCR檢測(cè)miRNA-93-5p 、FBXW7 mRNA水平：提取鄰近正常宮頸組織、宮頸癌組織中及H8、Caski、HeLa、C33A細(xì)胞中總RNA量,逆轉(zhuǎn)錄miRNA-93-5p、FBXW7的RNA為cDNA。將miRNA-93-5p、FBXW7的cDNA擴(kuò)增,內(nèi)參為GAPDH。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.3.2轉(zhuǎn)染低表達(dá)miRNA-93-5p 、過(guò)表達(dá)FBXW7：將C33A宮頸癌細(xì)胞接種到6孔板內(nèi),培養(yǎng)至細(xì)胞到80%,參考轉(zhuǎn)染試劑(質(zhì)粒,賽默飛世爾科技公司)說(shuō)明書(shū)逐步操作將miRNA-93-5p、FBXW7分別轉(zhuǎn)染到C33A細(xì)胞中,構(gòu)建出低表達(dá)miRNA-93-5p 細(xì)胞株、過(guò)表達(dá)FBXW7細(xì)胞株。

1.3.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)C33A細(xì)胞的凋亡率：收集各組C33A細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度,離心后去掉上清再加入稀釋的一抗重懸細(xì)胞,冰上避光孵育1h,再加入對(duì)應(yīng)的二抗溶液,冰上避光孵育30min,使用抗體稀釋液洗滌稀釋兩次,離心去除上清液后,加入抗體稀釋液重懸細(xì)胞,最后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。

1.3.4平板克隆檢測(cè)C33A宮頸癌細(xì)胞增殖能力：將C33A宮頸癌細(xì)胞接種到6孔板中,干預(yù)結(jié)束后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至克隆團(tuán)數(shù)大于50個(gè)后,使用PBS清洗反復(fù)清洗,加入甲醛溶液將細(xì)胞固定,加入Giemsa溶液浸染克隆團(tuán),最后使用PBS清洗后,拍照分析。

1.3.5細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)C33A宮頸癌細(xì)胞遷移能力：將C33A宮頸癌細(xì)胞接種到6孔板,培養(yǎng)細(xì)胞至85%左右,使用滅菌后的槍頭在各孔正中央垂直劃一條直線使用無(wú)血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),分別在0h和24h時(shí)將各孔用PBS清洗后在顯微鏡下拍照觀察,使用ImageJ軟件測(cè)量遷移距離。

1.3.6Trallswell檢測(cè)C33A細(xì)胞侵襲能力：將200 μL無(wú)血清培養(yǎng)基加入(5×104個(gè)細(xì)胞)Transwell室上腔中的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),下腔中的細(xì)胞加入完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)24h,使用4%的多聚甲醛細(xì)胞固定10min,去除固定液,加入結(jié)晶紫染色25min,使用PBS清洗3次后直接在倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.3.7Western blotting 檢測(cè)C33A細(xì)胞中FBXW7蛋白表達(dá)水平：收集各組C33A細(xì)胞并提取總蛋白,將各組蛋白濃度使用BCA試劑盒檢測(cè)盒,配置合適的體系,高溫將蛋白變性處理,置于-20℃?zhèn)溆?。提前配置合適濃度的凝膠塊,將樣品加入對(duì)應(yīng)的孔道中電泳一定時(shí)間,結(jié)束后將凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉,孵育一抗FBXW7(1∶1000),對(duì)應(yīng)的二抗,每個(gè)步驟的間隙將條帶浸入PBST溶液中清洗30min,使用發(fā)光液進(jìn)行曝光,最后使用ImageJ軟件分析。

2 結(jié) 果

2.1miRNA-93-5p、FBXW7在宮頸癌組織、細(xì)胞中的表達(dá)：與癌旁組織相比,宮頸癌組織中miRNA-93-5p mRNA水平顯著增加、FBXW7 mRNA水平顯著減少(圖1A-B,F=173.65,P<0.001)。與H8相比,Caski(F=8.65,P<0.05)、HeLa(F=9.21,P<0.05)、C33A(F=82.41,P<0.01)細(xì)胞中miRNA-93-5p mRNA水平增加、FBXW7 mRNA水平減少(圖1C-D)。

圖1 miRNA-93-5p、FBXW7在宮頸癌組織、細(xì)胞中的mRNA水平

2.2抑制miRNA-93-5p對(duì)宮頸癌細(xì)胞凋亡、增殖、遷移、侵襲的影響：與對(duì)照組相比,miRNA-93-5p抑制組miRNA-93-5p mRNA水平顯著降低(圖2A,F=164.82,P<0.001),C33A宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率增加(圖2B,F=192.01,P<0.001),C33A細(xì)胞的克隆能力下降(圖2C,F=74.02,P<0.01),C33A細(xì)胞遷移距離減少(圖2D,F=82.75,P<0.01),C33A細(xì)胞侵襲能力下降(圖2E,F=67.25,P<0.01)。

圖2 C33A細(xì)胞中的miRNA-93-5p mRNA水平及細(xì)胞的凋亡、增殖、遷移、侵襲能力

A.RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞中miRNA-93-5p mRNA水平;B.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;C.平板克隆檢測(cè)細(xì)胞增殖能力;D.劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力;E.Trallswell檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力;與對(duì)照組比較,**P<0.01、***P<0.001。

圖4 C33A細(xì)胞中的FBXW7 mRNA水平及細(xì)胞的凋亡、增殖、遷移、侵襲能力

A.Western blotting檢測(cè)細(xì)胞中FBXW7蛋白水平;B.RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞中FBXW7 mRNA水平。與對(duì)照組比較,**P<0.01。

2.3miRNA-93-5p調(diào)控宮頸癌細(xì)胞中FBXW7的表達(dá)：與對(duì)照組相比,miRNA-93-5p抑制組FBXW7蛋白(F=65.81,P<0.01)、mRNA(F=69.24,P<0.01)水平顯著增加(圖3A-B)。

2.4過(guò)表達(dá)FBXW7對(duì)宮頸癌細(xì)胞凋亡、增殖、遷移、侵襲的影響：與對(duì)照組相比,FBXW7激活組FBXW7 mRNA水平顯著增加(圖4A,F=72.11,P<0.01),C33A細(xì)胞凋亡率增加(圖4B,F=187.31,P<0.001),克隆能力下降(圖4C,F=172.60,P<0.001),遷移距離減少(圖4D,F=80.25,P<0.01),侵襲能力下降(圖4E,F=65.72,P<0.01)。

3 討 論

宮頸癌是一種子宮頸上皮性惡性腫瘤,是最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一[10]。人乳頭瘤病毒(HPV)感染是宮頸癌發(fā)作的主要原因[11]。研究顯示,HPV感染后致癌性相關(guān)的基因組改變是癌癥進(jìn)展的關(guān)鍵步驟。因此,對(duì)致癌基因以及抑癌基因的研究尤為重要。據(jù)統(tǒng)計(jì),全球每年約有50萬(wàn)患者患有宮頸癌,這些病例大多數(shù)發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家,且每年約有27萬(wàn)人死于宮頸癌。早期宮頸癌患者經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化治療后,5年生存率為80～90%。然而,伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者的5年生存率低于50%[12]。因此,深入研究宮頸癌的可能有效治療策略至關(guān)重要。

隨著對(duì)各種腫瘤中miRNAs的深入研究,發(fā)現(xiàn)miRNAs的表達(dá)譜可以作為多種腫瘤的重要分子生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。目前,所有關(guān)于miRNAs的研究都集中在篩選腫瘤組織和正常組織(或癌旁組織)之間具有差異表達(dá)的miRNAs的表達(dá)譜上。研究學(xué)者們認(rèn)為,下調(diào)的miRNAs的功能與抑制基因相似,表現(xiàn)出抗癌作用,上調(diào)的miRNAs的功能與致癌基因相似,顯示出致癌作用。近年來(lái),miRNAs的功能已成為癌癥靶向治療的研究熱點(diǎn)。miRNA-93-5p在多種癌組織中高表達(dá),具有致癌作用,且在癌細(xì)胞的的增殖、侵襲和遷移中發(fā)揮重要作用。值得關(guān)注的是,已有研究顯示,miR-93-5p可能是治療宮頸癌的潛在靶點(diǎn)。FBXW7是一種重要的腫瘤抑制因子。miRNAs可使癌癥細(xì)胞中的FBXW7功能失活。既往研究顯示,FBXW7在調(diào)控宮頸癌的侵襲性中發(fā)揮重要作用。然而,關(guān)于miR-93-5p是否可通過(guò)調(diào)控FBXW7影響宮頸癌的進(jìn)展,未見(jiàn)報(bào)道。本研究初步在宮頸癌組織及癌旁組織中檢測(cè)發(fā)現(xiàn),宮頸癌組織中miR-93-5p mRNA水平顯著增加,FBXW7 mRNA水平顯著減少。通過(guò)選擇不同的宮頸癌細(xì)胞系進(jìn)行檢測(cè),也得出同樣的結(jié)果,其中C33A宮頸癌細(xì)胞中二者變化最為顯著,因此我們選擇該細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)研究。為了驗(yàn)證miR-93-5p是否可通過(guò)調(diào)控FBXW7 影響宮頸癌的生物學(xué)行為,我們將miR-93-5p低表達(dá)后發(fā)現(xiàn),宮頸癌細(xì)胞中FBXW7的低水平改善,且宮頸癌細(xì)胞的凋亡率增加,增殖、遷移、侵襲能力下降。進(jìn)一步高表達(dá)FBXW7也得出同樣的結(jié)果。

綜上所述,宮頸癌組織中miR-93-5p高表達(dá),FBXW7低表達(dá),低表達(dá)miR-93-5p可上調(diào)FBXW7水平,阻礙宮頸癌的發(fā)病進(jìn)展,將宮頸癌細(xì)胞中FBXW7高表達(dá),結(jié)果與低表達(dá)miR-93-5p對(duì)宮頸癌細(xì)胞的影響保持一致。本研究初步初步闡明miRNA-93-5p可通過(guò)調(diào)控FBXW7基因影響宮頸癌細(xì)胞的凋亡、增殖、遷移、侵襲水平,將為臨床中宮頸癌的治療提供新思路。