咪達(dá)唑侖調(diào)節(jié)YAP/TAZ信號通路對骨肉瘤細(xì)胞增殖凋亡和侵襲的影響

奧婷婷, 涂夢佳, 張 熙

(湖北省十堰市人民醫(yī)院麻醉科, 湖北 十堰 442099)

骨肉瘤(osteosarcoma,OS)是一種的原發(fā)性骨惡性腫瘤,常見于兒童和青少年。盡管手術(shù)與化療相結(jié)合極大地改善了OS患者的預(yù)后,但轉(zhuǎn)移性或復(fù)發(fā)性O(shè)S的預(yù)后仍然差[1]。因此研究新的治療OS藥物,改善患者預(yù)后具有重要意義。大量研究表明,麻醉藥物可抑制OS發(fā)生發(fā)展,如丙泊酚通過腺苷單磷酸激活蛋白激酶/轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白O1介導(dǎo)的自噬抑制OS細(xì)胞的惡性進(jìn)展[2]。右美托咪定通過與miR-520a-3p-去泛素水解酶1基因相互作用,抑制OS細(xì)胞增殖和粘附,同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡[3]。咪達(dá)唑侖(midazolam,MDZ)廣泛用于術(shù)前鎮(zhèn)靜。研究表明,MDZ可抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移[4]。在OS中,MDZ通過上調(diào)circNOL10表達(dá),誘導(dǎo)OS細(xì)胞凋亡,并抑制其增殖和遷移[5]。但MDZ抑制OS細(xì)胞惡性進(jìn)展涉及其他分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步的研究。研究表明,Yes相關(guān)蛋白(yes-associated protein,YAP)/PDZ結(jié)合基序轉(zhuǎn)錄共激活因子(transcriptional co-activator with PDZ-binding motif,TAZ)信號通路與OS細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡過程,華蟾素注射液和維替泊芬通過下調(diào)YAP/TAZ通路,具有抗OS的作用[6-7]。基于此,本研究以MG63、U20S為研究對象,通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探討MDZ對MG63、U20S細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響及潛在作用機(jī)制,以期為OS的治療提供新的參考。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞來源：人OS細(xì)胞系MG63、U20S、HOS、Saos2及人正常成骨細(xì)胞系hFOB1.19購于購于美國ATCC。SPF級BALB/c裸鼠購自武漢貝賽模式生物科技有限公司(許可證號：SCXK(鄂)2022-0029),6-8周齡,體重20g左右。本研究經(jīng)本院動(dòng)物倫理委員會批準(zhǔn)同意(批號：2022042615-04)。

1.2主要材料、儀器：咪達(dá)唑侖(國藥準(zhǔn)字H20153019)江蘇九旭藥業(yè)有限公司;兔源一抗PCNA(ab15498)、YAP、(ab81183)、TAZ(ab307148)、Ki67、(ab16667)、N-cadherin(ab18203)、E-cadherin(ab18203))、GAPDH(貨號：ab9485)以及HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(貨號：ab6721)美國Abcam公司;Annexin VFITC/PI檢測試劑盒(4101-100T)上海晶風(fēng)生物科技有限公司;細(xì)胞蛋白提取試劑盒(01126B)上海圻明生物科技有限公司;TUNEL凋亡檢測試劑盒(D21014)上海雅吉生物科技有限公司;實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(KMR027230)溫州科淼生物科技有限公司;MTT試劑盒(M1020)北京雅安達(dá)生物技術(shù)有限公司;細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒(AMEKO403)上海聯(lián)碩生物科技有限公司;EdU染色(C10310)廣州市銳博生物科技有限公司;KEEBIO-VE180蛋白電泳儀購于上海嘉鵬科技有限公司;680型全自動(dòng)酶標(biāo)儀購于上海君翼儀器設(shè)備有限公司;7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購于廣州維基科技有限公司;A16K-R離心機(jī)購于湖南安君研儀器有限公司;DM3000-DM3000光學(xué)顯微鏡購于德國Leica。

1.3qRT-PCR法檢測YAP、TAZ的表達(dá)：用Trizol試劑提取細(xì)胞的總RNA。反轉(zhuǎn)錄試劑盒以RNA為模板合成cDNA后,按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒配置反應(yīng)體系。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測YAP、TAZ的表達(dá)。YAP、TAZ的相對表達(dá)量用2-ΔΔCT法計(jì)算。

1.4MTT法檢測MG63、U20S細(xì)胞增殖活性：將MG63、U20S接種到96孔板中常規(guī)培養(yǎng)(1×104/孔)24h,設(shè)6個(gè)復(fù)孔。加入含0、12.5、25、50、100、200 μmoL/L MDZ[5]的培養(yǎng)液24h后加入MTT溶液(20μL/孔),檢測490nm波長處檢測各孔的吸光度,計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(%)和半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將MG63、U20S細(xì)胞接種到6孔板中(1.2×106個(gè)),將細(xì)胞分為control組、MDZ組、pcDNA3.1組、pcDNA3.1-YAP/TAZ組,利用轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染48h。qRT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染效率。除control組外,其余各組用含有100 μmoL/L MDZ的培養(yǎng)基培養(yǎng)干預(yù)24h。

1.6細(xì)胞增殖檢測：將轉(zhuǎn)染成功的各組MG63、U20S細(xì)胞接種于96孔板中(1×104個(gè)/mL),細(xì)胞貼壁后加入5-乙炔基-2'-脫氧尿苷(EdU)稀釋溶液(100 μL/孔),孵育2h,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌,經(jīng)固定、通透后,先后加入1×Apollo、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色液,熒光顯微鏡下觀察并拍照,計(jì)算Edu陽性細(xì)胞率。

1.7細(xì)胞凋亡檢驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染成功的各組MG63、U20S細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)24h。加入5 μL的膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)染液,遮光染色15min,上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.8細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：Transwell小室用Matrigel覆蓋后,上室加入MG63、U20S細(xì)胞懸液(200 μL),下室加RPMI1640培養(yǎng)基(600 μL),常規(guī)培養(yǎng)24h。下室細(xì)胞經(jīng)固定,結(jié)晶紫染色(20min)、PBS沖洗后,鏡下觀察侵襲數(shù)。

1.9蛋白表達(dá)檢測：Western blot檢測蛋白表達(dá),利用蛋白提取試劑盒得到MG63、U20S細(xì)胞的總蛋白,經(jīng)定量、電泳分離、轉(zhuǎn)聚偏氟乙烯(PVDF)膜后加入按照1∶1500稀釋的一抗PCNA、Bax、N-cadherin、E-cadherin、YAP、TAZ、GAPDH在4℃孵育過夜,按照1∶1000稀釋HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育90min,以GAPDH為內(nèi)參,分析各蛋白表達(dá)。

1.10體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：于BALB/c裸鼠右側(cè)背部皮下注射MG63細(xì)胞懸液,1周后,隨機(jī)將裸鼠分成對照組、MDZ組,每組6只。MDZ組腹腔注射5mg/kg MDZ,對照組腹腔注射等量生理鹽水,2d/1次,干預(yù)4周。處死小鼠并分離腫瘤,測量腫瘤質(zhì)量與體積。

1.11免疫組化法檢測Ki-67、YAP、TAZ蛋白表達(dá)：將裸鼠瘤組織,固定于4%多聚甲醛中,石蠟包埋,切片、封閉和透化后,使用按照1∶1000稀釋的抗Ki-67、YAP、TAZ抗體孵育過夜,在室溫下與HRP標(biāo)記的二抗(1∶1000)孵育1h,DAB溶液孵育3～15min,使用光學(xué)顯微鏡拍攝圖像,黃色細(xì)胞被視為陽性細(xì)胞。使用Imagepro Plus 6.0分析陽性細(xì)胞率。

1.12TUNEL染色檢測凋亡：將1.3.9中腫瘤切片用3 %雙氧水處理10min,PBS洗滌3次。嚴(yán)格按照TUNEL試劑盒進(jìn)行加反應(yīng)液。二氨基聯(lián)苯胺染色后,切片用梯度醇脫水,用二甲苯透明,用中性膠密封。在顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡的變化。并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié) 果

2.1YAP、TAZ在不同細(xì)胞中的表達(dá)：與hFOB1.19細(xì)胞比較,MG63、U20S、HOS、Saos2中YAP、TAZ mRNA及蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05),YAP、TAZ mRNA及蛋白表達(dá)水平在HOS、Saos2較高,MG63、U20S中較低,后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇MG63、U20S細(xì)胞。見圖1、表2。

圖1 不同細(xì)胞中YAP、TAZ蛋白表達(dá)

2.2MDZ對MG63、U20S細(xì)胞增殖活性的影響：與 0μmoL/L比較,MG63、U20S細(xì)胞增殖抑制率在0、12.5、25、50、100、200 μmoL/L MDZ干預(yù)下以劑量依賴性的方式顯著增加(P<0.05),MG63、U20S的IC50分別為104.71、102.09 μmoL/L,本研究選取100 μmoL/L MDZ進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見表3。

2.3MDZ對MG63、U20S細(xì)胞中YAP、TAZ表達(dá)的影響：與control組比較,MDZ組MG63、U20S細(xì)胞中YAP、TAZ mRNA水平顯著降低(P<0.05);與pcDNA3.1組比較,pcDNA3.1-YAP/TAZ組MG63、U20S細(xì)胞中YAP、TAZ mRNA水平顯著升高(P<0.05),pcDNA3.1-YAP/TAZ轉(zhuǎn)染成功。見表4。

2.4MDZ對MG63、U20S增殖能力的影響：與control組比較,MDZ組MG63、U20S細(xì)胞Edu陽性率顯著降低(P<0.05);與pcDNA3.1組比較,pcDNA3.1-YAP/TAZ組MG63、U20S細(xì)胞Edu陽性率顯著升高(P<0.05)。見圖2、圖3和表5。

圖2 Edu實(shí)驗(yàn)檢測MG63細(xì)胞增殖(×100)

圖3 Edu實(shí)驗(yàn)檢測U20S細(xì)胞增殖(×100)

2.5MDZ對MG63、U20S細(xì)胞凋亡的影響：與control組比較,MDZ組MG63、U20S細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05);與pcDNA3.1組比較,pcDNA3.1-YAP/TAZ組MG63、U20S細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖4和表6。

圖4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

2.6MDZ對MG63、U20S細(xì)胞侵襲的影響：與control組比較,MDZ組MG63、U20S細(xì)胞侵襲數(shù)顯著降低(P<0.05);與pcDNA3.1組比較,pcDNA3.1-YAP/TAZ組MG63、U20S細(xì)胞侵襲數(shù)顯著升高(P<0.05)。見圖5和表7。

圖5 各組細(xì)胞侵襲情況比較(×100)

2.7MDZ對PCNA、Bax、N-cadherin、E-cadherin、YAP、TAZ蛋白表達(dá)的影響：與control組比較,MDZ組MG63、U20S細(xì)胞PCNA、N-cadherin、YAP、TAZ表達(dá)顯著降低,Bax、E-cadherin表達(dá)顯著升高(P<0.05);與pcDNA3.1組比較,pcDNA3.1-YAP/TAZ組MG63、U20S細(xì)胞PCNA、N-cadherin、YAP、TAZ表達(dá)顯著升高,Bax、E-cadherin表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見圖6、表8、表9。

圖6 各組細(xì)胞中PCNA、Bax、N-cadherin、E-cadherin、YAP、TAZ蛋白表達(dá)比較

2.8MDZ對裸鼠移植瘤生長的影響：體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明,與對照組比較,MDZ組小鼠移植瘤質(zhì)量與體積明顯下降,移植瘤細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05);MDZ組移植瘤中,Ki-67、YAP、TAZ蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),見圖7～9和表10。

圖7 各組移植瘤組織生長情況(n=6)

圖8 免疫組化檢測移植瘤組織中Ki-67、YAP、TAZ蛋白表達(dá)(×100)

圖9 TUNEL染色檢測各組移植瘤細(xì)胞凋亡(×200)

表1 引物序列

表2 YAP TAZ在不同細(xì)胞中的表達(dá)

表3 不同濃度的MDZ對MG63 U20S細(xì)胞的增殖抑制率

表4 各組MG63 U20S細(xì)胞中YAP TAZ表達(dá)比較

表5 各組MG63 U20S細(xì)胞Edu陽性率比較

表6 各組MG63 U20S細(xì)胞凋亡率比較

表7 各組MG63 U20S細(xì)胞侵襲數(shù)比較

表8 各組MG63細(xì)胞蛋白表達(dá)比較

表9 各組U20S細(xì)胞蛋白表達(dá)比較

表10 各組裸鼠移植瘤生長和Ki-67 YAP TAZ蛋白表達(dá)比較

3 討 論

OS是一種起源于間充質(zhì)組織的惡性腫瘤,具有易轉(zhuǎn)移、預(yù)后差和短期死亡率高的特點(diǎn)。由于其發(fā)展迅速和早期轉(zhuǎn)移,患者的5年生存率不理想?；熉?lián)合手術(shù)治療仍然是骨肉瘤的主要治療方法,然而,藥物引起的副作用和手術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)會降低患者的生活質(zhì)量并降低患者的生存率。因此,尋找安全有效的治療藥物是當(dāng)前研究的重點(diǎn)。

麻醉劑在腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中起至關(guān)重要的作用。研究發(fā)現(xiàn),七氟醚可抑制OS細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力,同時(shí)降低MG63細(xì)胞對順鉑的敏感性[8]。布比卡因治療提高了OS細(xì)胞的凋亡率,減弱了侵襲和遷移能力,腫瘤異種移植實(shí)驗(yàn)中,布比卡因顯著抑制裸鼠OS細(xì)胞生長[9]。鹽酸羅哌卡因通過下調(diào)Livin基因,降低了OS細(xì)胞對多柔比星的耐藥性,具有抗OS的作用[10]。MDZ是一種苯二氮卓類藥物,具有起效快,作用短的特點(diǎn),此外,還具有顯著的催眠、抗焦慮和鎮(zhèn)靜特性。除了用作麻醉劑外,MDZ還可能具有預(yù)防或抑制腫瘤發(fā)展的能力。Kang等[4]研究結(jié)果顯示,于裸鼠腹腔內(nèi)注射MDZ可減少肝細(xì)胞癌腫瘤的發(fā)展,并提高肝細(xì)胞癌抗程序性死亡配體1(PD-1)免疫治療的效率。MDZ通過調(diào)節(jié)miR-194-5p/hook微管栓系蛋白3(HOOK3)軸來增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌耐藥細(xì)胞中的順鉑敏感性,MDZ抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖和遷移,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,MDZ可作為臨床實(shí)踐中非小細(xì)胞肺癌治療的輔助藥物[11]。MDZ在體內(nèi)抑制胰腺導(dǎo)管腺癌小鼠腫瘤大小,通過下調(diào)細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制胰腺導(dǎo)管腺癌增殖,并在體外誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。本研究發(fā)現(xiàn),MDZ顯著降低MG63、U20S細(xì)胞的Edu陽性細(xì)胞率、侵襲數(shù)、移植瘤質(zhì)量和體積、同時(shí)降低增殖、侵襲相關(guān)蛋白(Ki-67、PCNA、N-cadherin)表達(dá)水平,升高細(xì)胞凋亡率和凋亡蛋白Bax表達(dá)。提示,MDZ可抑制MG63、U20S細(xì)胞增殖和侵襲,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,具有抗OS的作用。

Hippo通路調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移,對多數(shù)腫瘤發(fā)生中起關(guān)鍵作用。YAP和TAZ是Hippo通路是Hippo途徑的下游效應(yīng)因子,在肝癌、乳腺癌、肺癌等許多類型的腫瘤中經(jīng)常觀察到Y(jié)AP/TAZ的表達(dá)升高,YAP/TAZ激活不僅使化療、放療或免疫治療產(chǎn)生耐藥性,也可與TEAD家族共激活劑結(jié)合,促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、侵襲性遷移和轉(zhuǎn)移[13]。研究發(fā)現(xiàn),YAP/TAZ在OS組織和細(xì)胞中高表達(dá),YAP/TAZ被認(rèn)為是骨肉瘤的新型預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[14]。本研究發(fā)現(xiàn),MDZ可顯著降低體內(nèi)體外YAP、TAZ mRNA及蛋白表達(dá),過表達(dá)YAP/TAZ可逆轉(zhuǎn)MDZ對MG63、U20S細(xì)胞惡性行為的抑制作用,提示,MDZ可能通過抑制YAP/TAZ信號通路,抑制MG63、U20S增殖和侵襲,促進(jìn)凋亡。

綜上所述,MDZ可能通過抑制YAP/TAZ信號通路,抑制OS細(xì)胞增殖和侵襲,促進(jìn)凋亡。MDZ可作為治療OS的潛在藥物。后續(xù)將繼續(xù)研究MDZ對OS的作用及其他作用分子機(jī)制。