特發(fā)性非肝硬化門靜脈高壓癥的關(guān)鍵基因通路篩選與潛在中藥預(yù)測(cè)

劉玥佩 鐘穎 張萍 楊冉瀲 李雷益

[摘要]?目的?采用生物信息學(xué)方法對(duì)特發(fā)性非肝硬化門靜脈高壓癥（idiopathic?non-cirrhotic?portal?hypertension，INCPH）的基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲取疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因和信號(hào)通路，預(yù)測(cè)治療INCPH的潛在中藥。方法?從基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（gene?expression?omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫(kù)下載關(guān)于INCPH的基因芯片數(shù)據(jù)集GSE77627，利用R語(yǔ)言對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化并篩選INCPH的差異基因（differential?genes，DEGs），并利用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)所有DEGs進(jìn)行基因本體（gene?ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto?encyclopedia?of?genes?and?genomes，KEGG）富集分析，并通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)；同時(shí)，利用CytoHubba插件篩選Degree值排名前15的DEGs作為關(guān)鍵基因。隨后將關(guān)鍵基因與醫(yī)學(xué)本體信息檢索平臺(tái)互相映射，以P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選治療INCPH的潛在中藥，并從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選潛在中藥有效成分，導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建中藥相關(guān)網(wǎng)絡(luò)圖，并預(yù)測(cè)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。結(jié)果?共獲得1880個(gè)DEGs，其中表達(dá)上調(diào)的基因有1061個(gè)，表達(dá)下調(diào)的基因有819個(gè)。利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)以及Cytoscape環(huán)境下的cytoHubba插件分析DEGs，篩選Dgree值排名15位的基因作為關(guān)鍵基因，分別是RPS27A、CDC42、EIF4E、MAPK1、PIK3R1、RPS6、RPS9、RPS8、RPL15、RPL27A、RPL24、RPL27、RPL26、RPL12和MAPK14。GO、KEGG分析顯示DEGs主要參與配子生成、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路等信號(hào)通路。結(jié)論?篩選得到干預(yù)INCPH的潛在中藥為人參、丹參、黃芪等，可能成為INCPH治療的潛在分子藥物來(lái)源。

[關(guān)鍵詞]?特發(fā)性非肝硬化性門靜脈高壓癥；生物信息學(xué)；中藥預(yù)測(cè)

[中圖分類號(hào)]?R319????[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]?A ????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2024.02.012

Screening?of?hub?genes?and?pathways?of?idiopathic?non-cirrhotic?portal?hypertension?and?prediction?of?traditional?Chinese?medicine

LIU?Yuepei，?ZONG?Ying，?ZHANG?Ping，?YANG?Ranlian，?LI?Yilei

School?of?Clinical?Medicine，?Chengdu?University?of?Chinese?Medicine，?Chengdu?611137，?Sichuan，?China

[Abstract]?Objective?To?with?analyzing?the?gene?expression?profile?of?idiopathic?non-cirrhotic?portal?hypertension?（INCPH）?by?bioinformatics?methods，?we?may?obtain?its?key?genes?and?signaling?pathways?to?explore?the?molecular?mechanism?of?INCPH?and?predict?the?potential?traditional?Chinese?medicine.?Methods?The?gene?microarray?dataset?GSE77627?on?INCPH?was?downloaded?from?gene?expression?omnibus?（GEO）?database，?the?data?were?normalized?and?screened?for?differential?genes?（DEGs）?of?INCPH?using?R?language，?and?all?DEGs?were?analyzed?for?gene?ontology?（GO）?and?Kyoto?encyclopedia?of?genes?and?genomes?（KEGG）?enrichment?using?Metascape?database，?and?protein-protein?interaction?network?was?constructed?by?STRING?database;?meanwhile?DEGs?with?the?top?15?Degree?values?were?screened?as?key?genes?using?CytoHubba?plugin.?Subsequently，?the?key?genes?were?mapped?to?each?other?with?the?medical?ontology?information?retrieval?platform?（coremine?medical）?to?screen?potential?Chinese?herbal?medicines?for?the?treatment?of?INCPH?with?P<0.05，?and?the?potent?components?that?potential?Chinese?medicines?have?were?screened?from?the?TCMSP?database，?imported?into?Cytoscape?software?to?construct?a?Chinese?medicine?correlation?network?map?and?predict?the?key?targets.?Results?A?total?of?1880?DEGs?were?screened，?including?1061?up-regulated?and?819?down-regulated?genes.?DEGs?were?analyzed?using?the?protein?interaction?database?STRING?and?cytoHubba?in?Cytoscape?software?to?obtain?key?genes，?which?were?RPS27A，?CDC42，?EIF4E，?MAPK1，?PIK3R1，?RPS6，?RPS9，?RPS8，?RPL15，?RPL27A，?RPL24，?RPL27，?RPL26，?RPL12?and?MAPK14.?The?GO?and?KEGG?analysis?mainly?involved?gamete?production?and?AGE-RAGE?signaling?pathway?in?INCPH.?Conclusion?The?potential?traditional?Chinese?medicines?screened?for?INCPH?are?Ginseng?Radix?et?Rhizoma，?Salviae?Miltiorrhizae?Radix?et?Rhizoma，?Scutellariae?Radix，?etc，?which?may?be?a?potential?source?of?molecular?drugs?for?the?treatment?of?INCPH.

[Key?words]?Idiopathic?non-cirrhotic?portal?hypertension;?Bioinformatics?（INCPH）;?Prediction?of?traditional?Chinese?medicine

特發(fā)性非肝硬化性門靜脈高壓癥（idiopathic?non-cirrhotic?portal?hypertension，INCPH）是一種病因尚未清晰闡明的，由非肝硬化因素所致的肝內(nèi)中小門靜脈阻塞所引起的血管性肝病[1]。Baveno?VI共識(shí)會(huì)議指出，特發(fā)性門靜脈高壓（idiopathic?portal?hypertension，IPH）、非肝硬化門靜脈纖維化（non-?cirrhotic?portal?fibrosis）和INCPH提示的臨床疾病相同[2]。其組織學(xué)特征[3]涉及多種非特異性改變，包括正竇擴(kuò)張、靜脈硬化、門脈纖維化和結(jié)節(jié)性再生性增生。

INCPH在全球范圍內(nèi)分布，并且在亞洲較為普遍。在過(guò)去的幾十年中，INCPH在日本和印度等已得到廣泛認(rèn)可，約占PH病例的30%～40%[4]。與之不同的是，在北美和歐洲，INCPH被認(rèn)為是一種罕見(jiàn)疾病，其僅占PH病例的3%～5%左右[5]。然而，由于對(duì)該疾病的識(shí)別經(jīng)常不足，其發(fā)病率可能被低估。

迄今為止，INCPH的病理生理機(jī)制在很大程度上仍不為人知，現(xiàn)存相關(guān)文獻(xiàn)仍然較少，多種病理學(xué)實(shí)體高度依賴于組織學(xué)特征。因此，明確INCPH進(jìn)展中準(zhǔn)確可靠的基因和重要生物途徑，對(duì)于提高對(duì)INCPH的認(rèn)識(shí)以期更好地服務(wù)于臨床具有重要意義。

本研究基于基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（gene?expression?omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)INCPH的基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，篩選與INCPH相關(guān)的差異基因，并對(duì)其進(jìn)行基因本體（gene?ontology，GO）富集功能與京都基因與基因組百科全書（Kyoto?encyclopedia?of?genes?and?genomes，KEGG）信號(hào)通路分析，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，確定關(guān)鍵基因，預(yù)測(cè)潛在治療中藥，以期為INCPH的臨床診斷和治療以及后續(xù)的相關(guān)研究提供參考。

1??資料與方法

1.1??數(shù)據(jù)提取

查找GEO（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo），下載編號(hào)為GSE77627的基因表達(dá)數(shù)據(jù)集。GSE77627數(shù)據(jù)集包含18例INCPH患者和14例正常人肝組織的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)集平臺(tái)為GPL14951。

1.2??數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理

采用R4.2.1環(huán)境下的GEOquery[6]軟件包獲取GPL14951的平臺(tái)信息，并將探針名轉(zhuǎn)換為基因名，當(dāng)一個(gè)基因?qū)?yīng)多個(gè)探針時(shí)取其平均值。針對(duì)數(shù)據(jù)預(yù)處理結(jié)果，利用R語(yǔ)言繪制箱線圖和主成分分析圖。

1.3??差異表達(dá)基因（differentially?expressed?genes，DEGs）的篩選

以P<0.05且log2（fold?change）的絕對(duì)值>2[7]為篩選條件，使用limma包研究INCPH患者和正常人肝組織樣本之間的DEGs。同時(shí)，利用pheatmap和ggplot2軟件包分別繪制熱圖和火山圖。

1.4??關(guān)鍵基因的功能注釋

將上述DEGs導(dǎo)入Metascape[8]數(shù)（https：//metascape.?org）據(jù)庫(kù)對(duì)上調(diào)、下調(diào)的差異基因進(jìn)行GO生物功能分析與京都基因與KEGG通路富集分析。

1.5??蛋白-蛋白互作（protein-protein?interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)分析與關(guān)鍵基因篩選

以“medium?confidence>0.9”為篩選條件，利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org）進(jìn)行PPI分析。利用Cytoscape軟件（Version?3.7.1）進(jìn)行可視化分析，并繪制PPI圖。同時(shí)利用CytoHubba插件篩選出Degree值排名前15的DEGs作為關(guān)鍵基因。

1.6??潛在干預(yù)中藥預(yù)測(cè)

將上述15個(gè)關(guān)鍵基因與Coremine?Medical數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.coremine.com）相互映射[9]，以P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選得出具有潛在干預(yù)作用的中藥。結(jié)合臨床常用藥篩選出現(xiàn)次數(shù)排名前3的中藥進(jìn)行預(yù)測(cè)，從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//tcmsp-e.com）中以O(shè)B≥30%，DL≥0.18為條件篩選這3味中藥的有效成分、作用靶點(diǎn)，并使用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//?www.uniprot.org）對(duì)靶點(diǎn)名稱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。通過(guò)Cytoscape構(gòu)建“中藥-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，并分別使用CytoHubba插件中的MCC、degree、EPC算法篩選出排列前25的靶點(diǎn)，并最終得到其交集靶點(diǎn)進(jìn)行可視化處理。

2??結(jié)果

2.1??芯片數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化和預(yù)處理結(jié)果

經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)規(guī)范化后得到的箱式圖可見(jiàn)各樣本對(duì)齊較好，符合預(yù)期要求。PCA圖可以明顯觀察到INCPH患者與正常人肝組織的兩組樣本分離顯著，樣本歸一化程度較好，見(jiàn)圖1。

2.2??DEGs篩選結(jié)果

依據(jù)log2FC的絕對(duì)值>2的篩選條件對(duì)GSE77627數(shù)據(jù)集的基因數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，共得到1880個(gè)DEGs。其中，呈現(xiàn)上調(diào)狀態(tài)的基因?yàn)?061個(gè)，呈現(xiàn)上調(diào)狀態(tài)的為819個(gè)，DEGs火山圖見(jiàn)圖1C。

2.3??上述DEGs的GO生物功能分析和KEGG富集分析

使用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇P<0.05，可以得到上述DEGs的GO生物功能分析與KEGG富集分析主要參與的信號(hào)通路。GO分析結(jié)果顯示，呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)的基因主要參與配子生成、細(xì)胞連接組織等生物功能；呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)的基因主要參與單羧酸代謝過(guò)程的生物功能。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)的基因主要富集在造血細(xì)胞譜系、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路等信號(hào)通路；呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)的基因則主要富集在癌癥中的蛋白聚糖、不飽和脂肪酸的生物合成等信號(hào)通路。

2.4??DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵基因篩選

利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)導(dǎo)入Cytoscape繪制PPI網(wǎng)絡(luò)分析圖見(jiàn)圖2；利用CytoHubba提供的Degree值算法，篩選網(wǎng)絡(luò)圖中互作程度較高的前15個(gè)差異基因作為關(guān)鍵基因，見(jiàn)圖3。關(guān)鍵上調(diào)基因分別為RPS27A、CDC42、EIF4E；下調(diào)基因分別為MAPK1、PIK3R1、RPS6、RPS9、RPS8、RPL15、RPL27A、RPL24、RPL27、RPL26、RPL12、MAPK14（P均<0.01），見(jiàn)表1。

2.5??潛在治療中藥的預(yù)測(cè)

上述15個(gè)關(guān)鍵基因與Coremine?Medical數(shù)據(jù)庫(kù)相互映射，結(jié)合臨床常用藥物篩選出現(xiàn)次數(shù)排名前3中藥，即人參、（膜莢）黃芪、丹參。通過(guò)TCMSP?數(shù)據(jù)庫(kù)、Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理后，將篩選過(guò)后的清潔數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件，并繪制“中藥-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖4。使用CytoHubba插件分別按照MCC、degree、EPC算法篩選出排列前25的靶點(diǎn)，取交集共得到16個(gè)靶點(diǎn)。靶點(diǎn)間的不同顏色代表了值的大小，顏色越深則值越大，相關(guān)性越強(qiáng)。結(jié)果顯示，上述3味中藥的活性成分主要參與調(diào)控PTGS2、PTGS1、ADRB2、SCN5A等基因，可能成為治療INCPH的潛在中藥，見(jiàn)圖5。

3??討論

INCPH的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，目前尚不清楚。內(nèi)臟血流增加和門靜脈?。ㄓ衫^發(fā)于自身免疫性損傷、內(nèi)皮損傷或高凝狀態(tài)的血栓形成或閉塞引起）可作為致病因素[10]。目前，對(duì)于INCPH的研究在不斷深入，但仍然缺乏對(duì)于該疾病生理病理的實(shí)體認(rèn)識(shí)，且臨床可用的治療方法十分有限。本研究通過(guò)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)提取芯片GSE77627的數(shù)據(jù)信息，通過(guò)R語(yǔ)言環(huán)境篩選DEGs，共識(shí)別INCPH患者與正常人肝組織的1880個(gè)差異表達(dá)基因，其中包括上調(diào)基因1061個(gè)，下調(diào)基因819個(gè)。

GO、KEGG富集分析結(jié)果證明，DEGs主要參與配子生成、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路等生物學(xué)過(guò)程。研究已經(jīng)證實(shí)，遺傳性危險(xiǎn)因素與INCPH存在明顯的相關(guān)性[11]。配子生成素結(jié)合蛋白2（gametopoietin-binding?protein?2，GGNBP2）是配子生成素的結(jié)合蛋白，在哺乳動(dòng)物配子發(fā)生等生殖相關(guān)過(guò)程發(fā)揮重要作用。研究表明，GGNBP2可以通過(guò)影響SOX9陽(yáng)性Sertoli細(xì)胞的形態(tài)和功能在精子發(fā)生中起關(guān)鍵作用[12]。此外，門靜脈血管系統(tǒng)異常往往與纖維化的增加有關(guān)[13]。70%的患者會(huì)出現(xiàn)閉塞性門靜脈病變，這被認(rèn)為是INCPH的標(biāo)志，特點(diǎn)是門靜脈分支壁纖維化和不規(guī)則增厚[14]。AGE-RAGE信號(hào)通路可級(jí)聯(lián)激活與纖維化相關(guān)的生長(zhǎng)因子，促進(jìn)組織纖維化的發(fā)展，并影響RAGE的表達(dá)增加[15]。

研究表明，INCPH的發(fā)病機(jī)制與諸多免疫性疾病相關(guān)，包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡[16]、常見(jiàn)變異型免疫缺陷癥[17]等，這些數(shù)據(jù)均表明免疫紊亂與INCPH的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。CDC42是Rho?GTPases（Rho?GTP酶）家族的成員，CDC42分子在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和廣泛的組織特異性功能中起著關(guān)鍵作用[18]。研究表明，CDC42失調(diào)可能會(huì)阻礙B細(xì)胞發(fā)育和親和力成熟的多個(gè)階段，導(dǎo)致異常的生發(fā)中心反應(yīng)和免疫缺陷，以及自身免疫和淋巴細(xì)胞增生[19]。由此推測(cè)，CDC42的失調(diào)可以誘導(dǎo)免疫失調(diào)，引發(fā)INCPH。

INCPH患者的治療主要集中在根據(jù)肝硬化指南預(yù)防和管理門靜脈高壓并發(fā)癥方面[20]，目前暫無(wú)特效的治療方法。中醫(yī)藥傳承千年，具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。本研究基于上述15個(gè)關(guān)鍵基因，使用Coremine?Medical數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)合臨床常用藥物篩選出現(xiàn)頻次排名前3中藥，即人參、黃芪、丹參。陸雄等[21]發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B能夠降低ET-1誘導(dǎo)的門脈高壓。王皎皎等[22]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，人參皂苷Rg3能夠通過(guò)激活PI3K-Akt/PKB信號(hào)通路，抑制VEGF和ICAM-1蛋白的表達(dá)，降低門脈高壓。秦合偉等[23]則發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷能夠通過(guò)靶向調(diào)控VLDLR等抑制血管炎性反應(yīng)，減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。以上眾多研究和報(bào)告證明了本研究預(yù)測(cè)的結(jié)果中藥在INCPH的干預(yù)中可能發(fā)揮確切的有效作用。

迄今為止，INCPH的病理生理機(jī)制仍未完全闡明，目前對(duì)其的研究更多集中在臨床病例研究，較少?gòu)姆肿咏嵌忍骄縄NCPH的生理病理機(jī)制；且研究探析了中藥治療的可能性，有一定的創(chuàng)新性和研究?jī)r(jià)值。研究對(duì)INPCH的所有DEGs進(jìn)行GO、KEGG富集分析，結(jié)果證明其主要參與配子生成、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路等生物學(xué)過(guò)程。通過(guò)15個(gè)關(guān)鍵基因與Coremine?Medical數(shù)據(jù)庫(kù)的相互映射預(yù)測(cè)出的頻次排名前3位的有效中藥，即人參、黃芪、丹參主要通過(guò)調(diào)節(jié)PTGS2、PTGS1、ADRB2、SCN5A等靶點(diǎn)防治INCPH，這也不失為一個(gè)有意義的研究方向。綜上來(lái)看，本研究為后續(xù)INCPH的生理病理機(jī)制以及治療藥物的研究提供了可參考的方向和思路，但后續(xù)仍然需要進(jìn)行多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證研究的真實(shí)性和準(zhǔn)確性，以便更好地探究INCPH的生理病理機(jī)制，加強(qiáng)對(duì)于該疾病的實(shí)體認(rèn)識(shí)，更好地指導(dǎo)臨床診斷和治療。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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