HPLC 多指標(biāo)成分定量聯(lián)合化學(xué)計(jì)量學(xué)評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地茜草

姜云，喬春鳳，劉華，喬亞紅，李俊濤

1.鄭州頤和醫(yī)院 藥學(xué)部，河南 鄭州 450047

2.河南省醫(yī)藥科學(xué)研究院 藥物研究所，河南 鄭州 450052

茜草是茜草科植物茜草Rubia cordifoliaL.的干燥全草，可涼血、祛瘀、止血、通經(jīng)，臨床上主要用于吐血、衄血、崩漏、外傷出血、瘀阻經(jīng)閉、關(guān)節(jié)痹痛、跌撲腫痛[1]。蒽醌及其苷類(lèi)化合物、萘醌類(lèi)、萘氫醌、黃酮類(lèi)、環(huán)己肽類(lèi)、多糖類(lèi)和微量元素等是茜草中主要藥效成分[2-4]。現(xiàn)代研究表明，茜草具有抗腫瘤、升高白細(xì)胞、免疫調(diào)節(jié)、護(hù)肝、抗炎、抗風(fēng)濕、抗氧化、止血等作用[5-7]，并且現(xiàn)代研究還證明，蒽醌類(lèi)成分茜草素在體外對(duì)沙門(mén)菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和變形桿菌等都具有明顯的抑制作用[4]，還用于治療嬰幼兒病毒性腹瀉[5,8]。茜草收載于《中國(guó)藥典》2020 年版一部，標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定大葉茜草素不得少于0.40%，羥基茜草素不得少于0.10%。對(duì)于茜草質(zhì)量研究文獻(xiàn)僅限指紋圖譜[9-12]和1～2 個(gè)成分的定量[13-15]。中藥是復(fù)雜的個(gè)體，所含成分多而雜，少數(shù)指標(biāo)成分不能詮釋其內(nèi)在整體質(zhì)量。主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）是化學(xué)計(jì)量學(xué)常用的技術(shù)手段，通過(guò)對(duì)含量數(shù)據(jù)分析挖掘，查找共性和不同，對(duì)樣品分組分類(lèi)，發(fā)現(xiàn)決定產(chǎn)品質(zhì)量的標(biāo)志性成分，預(yù)測(cè)精度高[16-19]?；疑P(guān)聯(lián)度分析（GRA）可客觀地對(duì)各組數(shù)據(jù)相似程度進(jìn)行因素間相互關(guān)聯(lián)分析，是解決多目標(biāo)之間復(fù)雜關(guān)系問(wèn)題的有力工具[20-22]。PCA、OPLS-DA 和GRA 均不存在主觀因素，客觀地對(duì)大量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，非常適用于所含成分繁多的中藥。本研究收集陜西、河南、安徽、河北、山東、青海、四川和西藏8 省區(qū)共18個(gè)批茜草藥材，采用HPLC 法同時(shí)測(cè)定新橙皮苷、山柰酚、茜草素、異茜草素、羥基茜草素、1,3,6-三羥基-2-甲基蒽醌、大葉茜草素、去氫-α-拉杷醌、β-谷甾醇、異落葉松脂素10 種成分，通過(guò)化學(xué)計(jì)量學(xué)結(jié)合GRA 法進(jìn)行綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)，希望為茜草質(zhì)量總體評(píng)價(jià)和新標(biāo)準(zhǔn)的提升、制定提供數(shù)據(jù)。

1 材料

1.1 試藥

新橙皮苷（批號(hào)111857-202305，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.6%）、山柰酚（批號(hào)110861-202214，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.4%）、羥基茜草素（批號(hào)111898-202004，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.8%）、大葉茜草素（批號(hào)110884-202107，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.5%）、β-谷甾醇（批號(hào)110851-201909，質(zhì)量分?jǐn)?shù)92.7%）對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；茜草素（批號(hào)CFS202301，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.2%）、異茜草素（批號(hào)CFS202201，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.5%）、1,3,6-三羥基-2-甲基蒽醌（批號(hào)CFS202201，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.9%）、去氫-α-拉杷醌（批號(hào)CFS202201，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%）、異落葉松脂素（批號(hào)CFS202201，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.5%）對(duì)照品均購(gòu)自武漢天植生物技術(shù)有限公司；乙腈（色譜純，VSA 公司），磷酸（色譜純，F(xiàn)isher 公司），水為純凈水，甲醇（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；茜草經(jīng)河南省醫(yī)藥科學(xué)研究院李俊濤研究員鑒定為正品，產(chǎn)地信息見(jiàn)表1。

1.2 儀器

LC-20A HPLC 儀（日本島津）；CP225D 型電子分析天平（北京賽多利斯），SB-5200 DTD 超聲波發(fā)生器（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

精準(zhǔn)稱取新橙皮苷、山柰酚、茜草素、異茜草素、羥基茜草素、1,3,6-三羥基-2-甲基蒽醌、大葉茜草素、去氫-α-拉杷醌、β-谷甾醇、異落葉松脂素10個(gè)對(duì)照品適量，用60%甲醇溶解并制成質(zhì)量濃度分別為0.028、0.492、0.610、0.064、1.370、1.878、4.730、0.092、0.128、0.236 mg/mL 的混合貯備液，再將混合貯備液用同一溶劑稀釋20 倍，即得混合對(duì)照品溶液（含新橙皮苷、山柰酚、茜草素、異茜草素、羥基茜草素、1,3,6-三羥基-2-甲基蒽醌、大葉茜草素、去氫-α-拉杷醌、β-谷甾醇和異落葉松脂素1.40、24.60、30.50、3.20、68.50、93.90、236.50、4.60、6.40、11.80 μg/mL）。

2.2 供試品溶液的制備

將茜草樣品干燥、粉碎（過(guò)二號(hào)篩），取粉末約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入60%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流45 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用提取溶劑補(bǔ)足質(zhì)量，搖勻，0.45 μm濾膜濾過(guò)，即得。

2.3 色譜條件

Alltima C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相0.2%磷酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～12 min，20.0% B；12～19 min，20.0%→28.0% B；19～40 min，28.0%→45.0% B；40～53 min，45.0%→80.0% B；53～60 min，80.0%→20.0% B）；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm（0～40 min，新橙皮苷、山柰酚、茜草素、異茜草素、羥基茜草素、1,3,6-三羥基-2-甲基蒽醌、大葉茜草素、去氫-α-拉杷醌）、210 nm（40～60 min，β-谷甾醇、異落葉松脂素）；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。在上述色譜條件下，供試品溶液中10 種成分色譜峰的保留時(shí)間與對(duì)照品一致，且峰形對(duì)稱，與相鄰色譜峰分離良好（分離度均≥1.5），色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照品（A）和茜草供試品（B）的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms reference substances (A)and Rubiae Radix samples (B)

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸混合貯備溶液，分別用60%甲醇按照4、10、20、40、100、200 倍稀釋成從高到低的6 個(gè)質(zhì)量濃度，進(jìn)樣測(cè)定，用得到的色譜峰峰面積作線性回歸處理。逐步稀釋各對(duì)照品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算主峰峰高與基線噪音的比值（S/N）。以S/N 為3 時(shí)的質(zhì)量濃度計(jì)為檢測(cè)限濃度；S/N 為10 時(shí)的質(zhì)量濃度計(jì)為定量限濃度。結(jié)果見(jiàn)表2?？梢?jiàn)10 個(gè)成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 線性關(guān)系考察Table 2 Linear relationship investigation

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄新橙皮苷、山柰酚、茜草素、異茜草素、羥基茜草素、1,3,6-三羥基-2-甲基蒽醌、大葉茜草素、去氫-α-拉杷醌、β-谷甾醇、異落葉松脂素色譜峰峰面積，計(jì)算得10 個(gè)成分峰面積的RSD 值分別為1.45%、1.06%、0.98%、1.23%、0.56%、0.50%、0.39%、1.32%、1.18%、1.22%。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 稱取1 份茜草（S1）樣品，制成供試品溶液，分別在0、2、5、9、14、20、24 h進(jìn)樣，計(jì)算得新橙皮苷、山柰酚、茜草素、異茜草素、羥基茜草素、1,3,6-三羥基-2-甲基蒽醌、大葉茜草素、去氫-α-拉杷醌、β-谷甾醇、異落葉松脂素峰面積的RSD 值分別為1.95%、1.66%、1.08%、1.74%、0.78%、0.92%、0.67%、1.62%、1.88%、1.76%，結(jié)果表明茜草供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取茜草（S1）6 份，制備供試品溶液，進(jìn)樣，結(jié)果新橙皮苷、山柰酚、茜草素、異茜草素、羥基茜草素、1,3,6-三羥基-2-甲基蒽醌、大葉茜草素、去氫-α-拉杷醌、β-谷甾醇、異落葉松脂素的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.032、0.549、0.836、0.073、1.922、2.537、6.561、0.098、0.136、0.253 mg/g，RSD 值分別為1.98%、1.86%、1.35%、1.60%、1.02%、0.89%、0.63%、1.57%、1.79%、1.81%。

2.4.5 回收率試驗(yàn) 取茜草（S1）細(xì)粉（過(guò)二號(hào)篩）9 份，每份0.5 g，精密稱定，分別加入混合對(duì)照品溶液（含新橙皮苷、山柰酚、茜草素、異茜草素、羥基茜草素、1,3,6-三羥基-2-甲基蒽醌、大葉茜草素、去氫-α-拉杷醌、β-谷甾醇、異落葉松脂素0.017、0.271、0.426、0.039、0.965、1.263、3.251、0.048、0.069、0.124 mg/mL）0.8、1.0、1.2 mL，制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定峰面積，計(jì)算得10 種成分的平均回收率分別為96.97%、97.68%、98.05%、97.54%、100.10%、99.09%、100.18%、97.15%、97.38%、98.05%，RSD 值分別為0.93%、1.43%、1.34%、1.06%、0.76%、1.38%、0.69%、1.51%、1.13%、1.91%。

2.5 樣品測(cè)定

精密吸取18 批茜草樣品，制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，采用外標(biāo)法計(jì)算新橙皮苷、山柰酚、茜草素、異茜草素、羥基茜草素、1,3,6-三羥基-2-甲基蒽醌、大葉茜草素、去氫-α-拉杷醌、β-谷甾醇、異落葉松脂素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 茜草中新橙皮苷、山柰酚、茜草素、異茜草素、羥基茜草素、1,3,6-三羥基-2-甲基蒽醌、大葉茜草素、去氫-α-拉杷醌、β-谷甾醇、異落葉松脂素的測(cè)定結(jié)果（n＝3）Table 3 Determination of neohesperidin,kaempferol,alizarin,xanthopurpurin,purpurin,1,3,6-trihydroxy-2-methylanthraquinone,mollugin,dehydro-α-lapachone,β-sitosterol and isolariciresinol from Rubiae Radix (n＝3)

2.6 主成分分析（PCA）

應(yīng)用SIMCA 14.1 軟件對(duì)18 批茜草樣品中新橙皮苷、山柰酚、茜草素、異茜草素、羥基茜草素、1,3,6-三羥基-2-甲基蒽醌、大葉茜草素、去氫-α-拉杷醌、β-谷甾醇、異落葉松脂素質(zhì)量分?jǐn)?shù)數(shù)據(jù)建立PCA模型，得圖2。提取出2 個(gè)主成分，其中模型系數(shù)R2X＝0.820，18 批茜草樣品分為3 組，S1～S5 為1組，S6～S12 為2 組，S13～S18 為3 組，聚為相同組的樣品來(lái)自1 個(gè)產(chǎn)區(qū)，說(shuō)明相同產(chǎn)區(qū)的茜草，質(zhì)量較接近，且所有散點(diǎn)均在95%置信區(qū)間內(nèi)，表明檢測(cè)數(shù)據(jù)未出現(xiàn)異常。

圖2 PCA 得分圖Fig.2 PCA score chart

2.7 正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）

運(yùn)行OPLS-DA 程序，結(jié)果見(jiàn)圖3，模型參數(shù)R2X＝0.990、R2Y＝0.935、Q2＝0.753，均大于0.5，表明建立的模型穩(wěn)定可靠、預(yù)測(cè)能力強(qiáng)[16]。再以變量重要性投影（VIP）值＞1 為顯著影響[18]，共找到4 個(gè)差異性標(biāo)志成分，影響顯著性為大葉茜草素＞茜草素＞1,3,6-三羥基-2-甲基蒽醌＞羥基茜草素，VIP 值分別為1.810 3、1.366 7、1.240 5、1.226 4，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖3 茜草的OPLS-DA 模型得分圖Fig.3 Score chart of OPLS-DA model for Rubiae Radix

圖4 茜草的VIP 圖Fig.4 VIP images of Rubiae Radix

2.8 灰色關(guān)聯(lián)度分析（GRA）

采用均值變換法對(duì)18 批茜草中10 個(gè)成分新橙皮苷、山柰酚、茜草素、異茜草素、羥基茜草素、1,3,6-三羥基-2-甲基蒽醌、大葉茜草素、去氫-α-拉杷醌、β-谷甾醇、異落葉松脂素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行規(guī)格化處理（表4）。以處理后每個(gè)成分的最大值為最優(yōu)參考序列，最小值為最差參考序列，分別計(jì)算各評(píng)價(jià)單元與最優(yōu)參考序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)、與最差參考序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)（表5、6）[20]，最后計(jì)算相對(duì)關(guān)聯(lián)度[20]。以相對(duì)關(guān)聯(lián)度為測(cè)度，對(duì)茜草樣品進(jìn)行質(zhì)量?jī)?yōu)劣排序（表7）。結(jié)果18 批茜草的相對(duì)關(guān)聯(lián)度在0.327 6～0.592 7，S16、S15、S14、S13、S18、S17 分別位于排名前6 位，S3、S5、S2、S4、S1 位于排名中間位置，S12、S9、S11、S6、S8、S10、S7位于排名后7 位。結(jié)果表明陜西、河南和安徽所產(chǎn)的茜草整體質(zhì)量較好，其次為河北和山東產(chǎn)地。

表4 數(shù)據(jù)規(guī)格化處理結(jié)果Table 4 Results of data contents

表5 各指標(biāo)與最優(yōu)參考序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)Table 5 Correlation coefficient between each index and the optimal reference sequence

表6 各指標(biāo)與最差參考序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)Table 6 Correlation coefficient between each index and the worst reference sequence

表7 各樣品相對(duì)關(guān)聯(lián)度及質(zhì)量?jī)?yōu)劣排序Table 7 Relative correlation degree and quality ranking of the samples

3 討論

3.1 目標(biāo)成分的選擇

茜草中主要藥效成分為蒽醌及其苷類(lèi)化合物、萘醌類(lèi)、萘氫醌、黃酮類(lèi)、環(huán)己肽類(lèi)、多糖類(lèi)等，現(xiàn)代研究表明萘醌類(lèi)和蒽醌及其苷類(lèi)化合物類(lèi)為茜草中最主要的活性成分，與其抗氧化、抗炎、抗腫瘤功能密切相關(guān)用[5]，以茜草素、羥基茜草素、1-羥甲基蒽醌、1,3,6-三羥基-2-甲基蒽醌、大葉茜草素、異茜草素、山柰酚、新橙皮苷的含量較高；甾醇類(lèi)是一類(lèi)天然化合物，以β-谷甾醇含量較高。故本實(shí)驗(yàn)以上述10 種成分作為目標(biāo)成分，采用HPLC法同時(shí)測(cè)定。

3.2 流動(dòng)相和供試品溶液的處理方式確定

考察了洗脫能力較強(qiáng)的有機(jī)相乙腈，水相選擇0.1%磷酸、0.2%磷酸、0.5%磷酸、0.1%甲酸、水。綜合色譜峰對(duì)稱情況、基線平穩(wěn)情況、成分間的分離度、出峰時(shí)間等，最終確定流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸溶液。由于本實(shí)驗(yàn)中待測(cè)成分涵蓋了黃酮類(lèi)、萜類(lèi)、蒽醌類(lèi)、甾醇類(lèi)化合物，各類(lèi)物質(zhì)極性不同，在供試品的預(yù)處理時(shí)，以新橙皮苷、山柰酚、茜草素、異茜草素、羥基茜草素、1,3,6-三羥基-2-甲基蒽醌、大葉茜草素、去氫-α-拉杷醌、β-谷甾醇和異落葉松脂素的綜合提取率、雜質(zhì)峰為指標(biāo)，通過(guò)對(duì)提取溶劑（45%甲醇、60%甲醇、75%甲醇）進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)以60%甲醇提取色譜峰數(shù)目多，且峰的純度高。通過(guò)對(duì)提取方式（超聲、加熱回流）和時(shí)間（30、45、60 min）進(jìn)行了考察，最終確定以60%甲醇加熱回流提取45 min 為茜草供試品溶液的最佳提取方式。

3.3 測(cè)定結(jié)果和化學(xué)計(jì)量學(xué)分析結(jié)果評(píng)價(jià)

本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同產(chǎn)地的18 批茜草中新橙皮苷、山柰酚、茜草素、異茜草素、羥基茜草素、1,3,6-三羥基-2-甲基蒽醌、大葉茜草素、去氫-α-拉杷醌、β-谷甾醇和異落葉松脂素進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示部分產(chǎn)地茜草中未檢出新橙皮苷、異茜草素和去氫-α-拉杷醌，大葉茜草素和羥基茜草素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別在5.258～8.815 mg/g 和1.520～3.065 mg/g，符合《中國(guó)藥典》2020 年版一部的要求。采用化學(xué)計(jì)量學(xué)中最常用的PCA 和OPLS-DA 對(duì)全國(guó)8 個(gè)省產(chǎn)地的18 批茜草中新橙皮苷、山柰酚、茜草素、異茜草素、羥基茜草素、1,3,6-三羥基-2-甲基蒽醌、大葉茜草素、去氫-α-拉杷醌、β-谷甾醇和異落葉松脂素共10個(gè)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示大葉茜草素、茜草素、1,3,6-三羥基-2-甲基蒽醌和羥基茜草素是影響茜草質(zhì)量的主要物質(zhì)，提示對(duì)茜草的研究應(yīng)著重關(guān)注上述4 個(gè)成分，而且這4 個(gè)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)結(jié)果顯示S13～S18 明顯高于其他批次。同時(shí)GRA 結(jié)果顯示，陜西、河南和安徽產(chǎn)地的茜草整體質(zhì)量較好，與文獻(xiàn)報(bào)道[6,9,12]相符，為茜草的道地性研究指明了方向。

本研究檢測(cè)的10 個(gè)成分新橙皮苷、山柰酚、茜草素、異茜草素、羥基茜草素、1,3,6-三羥基-2-甲基蒽醌、大葉茜草素、去氫-α-拉杷醌、β-谷甾醇和異落葉松脂素涵蓋了黃酮類(lèi)、蒽醌類(lèi)、甾體類(lèi)和木脂素類(lèi)，方法便捷、準(zhǔn)確，易于推廣，可以更全面、更系統(tǒng)地評(píng)價(jià)茜草的質(zhì)量，為茜草藥材的綜合評(píng)價(jià)、產(chǎn)地道地性評(píng)價(jià)提供了參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突