牡荊素調(diào)控Sirt1/FoxO1 通路介導(dǎo)的鐵死亡對(duì)變應(yīng)性鼻炎大鼠鼻黏膜損傷的保護(hù)作用

李艷峰，盧振民

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 耳鼻咽喉科，河南 新鄉(xiāng) 453100

變應(yīng)性鼻炎是一種以鼻塞、流鼻涕、打噴嚏及鼻癢等為主要特征且病因較為復(fù)雜的鼻黏膜變應(yīng)性炎癥性的疾病，也被稱為過(guò)敏性鼻炎[1]。近年來(lái)，變應(yīng)性鼻炎的發(fā)病率呈逐年上升態(tài)勢(shì)，全球有10%～40%的人口患有變應(yīng)性鼻炎，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量，已經(jīng)成為耳鼻咽喉科臨床醫(yī)生和患者共同關(guān)注的重要醫(yī)療疾病[2]。目前，關(guān)于變應(yīng)性鼻炎的治療藥物主要包含抗組胺藥、抗白三烯和皮質(zhì)類固醇等。然而，上述藥物在長(zhǎng)期治療變應(yīng)性鼻炎中可能會(huì)有一定的不良反應(yīng)，且在治療患者中療效并不理想。此外，變應(yīng)性鼻炎的發(fā)病機(jī)制也較為復(fù)雜，與氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥及免疫調(diào)控失衡等密切相關(guān)。但是有關(guān)其發(fā)病的具體機(jī)制至今尚未完全闡明。因此，積極探尋變應(yīng)性鼻炎的發(fā)病機(jī)制并開(kāi)發(fā)新型治療藥物對(duì)于改善變應(yīng)性鼻炎患者臨床癥狀具有重大意義。

鐵死亡是由脂質(zhì)過(guò)氧化引起的一種鐵依賴性、非凋亡形式的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡，是機(jī)體抗氧化和氧化系統(tǒng)失衡的結(jié)果[3]。鐵死亡與呼吸道炎癥性疾病密切相關(guān)。研究顯示，白細(xì)胞介素-6（IL-6）能夠通過(guò)誘導(dǎo)活性氧氣簇（ROS）依賴性的脂質(zhì)過(guò)氧化以及鐵離子穩(wěn)態(tài)，誘導(dǎo)上皮細(xì)胞鐵死亡[4]。采用鐵死亡抑制劑處理能夠明顯減輕氧化損傷、影響鐵代謝進(jìn)而抑制卵清白蛋白誘導(dǎo)的小鼠哮喘以及白細(xì)胞介素-13（IL-13）誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞鐵死亡發(fā)生[5]。此外，在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞系BEAS-2B 體外急性呼吸窘迫綜合征模型中，細(xì)胞鐵死亡標(biāo)志蛋白溶質(zhì)載體家族7 成員11（SLC7A11）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（GPX4）表達(dá)明顯降低，丙二醛（MDA）和鐵離子水平顯著升高，而鐵死亡抑制劑ferrostatin-1 處理后能夠改善LPS誘導(dǎo)的損傷，減輕肺部炎癥[6]。新近研究證實(shí)，膳食碘能夠通過(guò)調(diào)控活化B細(xì)胞鐵死亡改善變應(yīng)性鼻炎癥狀[7]。此外，PM2.5能夠通過(guò)激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）介導(dǎo)的細(xì)胞自噬促進(jìn)人鼻黏膜上皮細(xì)胞鐵死亡，從而引起鼻黏膜上皮損傷，加重變應(yīng)性鼻炎，而采用鐵死亡抑制劑去鐵胺和ferrostatin-1 能夠顯著逆轉(zhuǎn)PM2.5誘導(dǎo)的人鼻黏膜上皮細(xì)胞鐵死亡，改善PM2.5誘導(dǎo)的鼻黏膜損傷[8]。以上研究表明鐵死亡可能是變應(yīng)性鼻炎鼻黏膜損傷的治療的潛在靶點(diǎn)。沉默信息調(diào)節(jié)因子1（Sirt1）/叉頭框蛋白O1（FoxO1）信號(hào)通路參與了氧化應(yīng)激[9]、細(xì)胞凋亡[10]以及鐵死亡[11]等過(guò)程。研究證實(shí)，Sirt1能夠促使FoxO1 去乙?；M(jìn)而影響下游基因表達(dá)，從而抑制機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)[12]。Yuan 等[13]研究證實(shí)，Sirt1 能夠通過(guò)抑制變應(yīng)性鼻炎小鼠中Th2 細(xì)胞介導(dǎo)的促炎癥細(xì)胞因子的釋放，減輕小鼠過(guò)敏性癥狀。此外，白藜蘆醇能夠通過(guò)激活鼻黏膜組織中Sirt1 蛋白表達(dá)，抑制炎癥細(xì)胞因子釋放，進(jìn)而改善卵清白蛋白誘導(dǎo)的小鼠變應(yīng)性鼻炎[14]，表明通過(guò)調(diào)節(jié)Sirt1/FoxO1 通路可能是改善變應(yīng)性鼻炎的重要機(jī)制。

牡荊素是一種天然的生物活性黃酮類化合物，具有抗炎[15]、抗氧化[16]以及抗腫瘤[17]等多種生物學(xué)活性，且對(duì)疾病的治療效果較為顯著，不良反應(yīng)小、安全性較高等優(yōu)勢(shì)，被認(rèn)為是一種極具開(kāi)發(fā)潛力的活性天然化合物。本課題組前期研究顯示，牡荊素能夠通過(guò)抑制AMPK/Nod 樣受體蛋白3（NLRP3）通路介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，降低中耳黏膜組織炎癥反應(yīng)，減輕分泌性中耳炎大鼠中耳黏膜組織病理性損傷[18]。但是，有關(guān)牡荊素對(duì)變應(yīng)性鼻炎大鼠鼻黏膜損傷的影響及其調(diào)控機(jī)制尚不清楚。為此，本研究擬通過(guò)卵清白蛋白誘導(dǎo)變應(yīng)性鼻炎大鼠模型，以Sirt1/FoxO1 信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞鐵死亡為機(jī)制靶標(biāo)，探究牡荊素對(duì)變應(yīng)性鼻炎模型大鼠鼻黏膜損傷的保護(hù)作用，以期闡明牡荊素對(duì)變應(yīng)性鼻炎的治療作用及為變應(yīng)性鼻炎疾病的防治提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 雄性，SPF 級(jí)，SD 大鼠90 只，6～8周齡，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)買于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[SCXK（滬）2021-0026]。動(dòng)物飼養(yǎng)條件為溫度：（25±2）℃，相對(duì)濕度50%～65%，12 h/12 h 晝夜交替光照，自由飲食、飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合3R 原則，且本實(shí)驗(yàn)研究通過(guò)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查（批準(zhǔn)號(hào)LLSC2021-08-015）。

1.1.2 試劑 牡荊素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司，批號(hào)20220312）；Sirt1 抑制劑EX527（美國(guó)ApexBio 公司，貨號(hào)A4181）；卵清蛋白、氫氧化鋁粉末[西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司，貨號(hào)M0228A、MKCM1237]；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH）、丙二醛（MDA）、Fe2+檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所，貨號(hào)A001-3-2、A005-1-2、A003-1-2、A039-2-1）；ROS 檢測(cè)試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司，貨號(hào)SY0802）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒、蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒、ECL 發(fā)光液、山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗、GPX4 抗體、SLC7A11 抗體及β-actin 抗體（上海碧云天生物技術(shù)公司，批號(hào)C0105S、P0011、P0018FS、A0409、A0413、AF7020、AF7992、AF0003）；ACSL4 抗體（Abcam 公司，貨號(hào)ab155282）；Sirt1 抗體、FoxO1抗體、磷酸化FoxO1（p-FoxO1，美國(guó)Cell Signaling Technology，貨號(hào)9475、2880、9461）；乙酰化-FoxO1抗體（Ac-FoxO1，美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司，貨號(hào)PA5104560）。

1.1.3 儀器 BX53 型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；H-2050R-1 型離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；LD-96A 型酶標(biāo)儀（山東萊恩德智能科技有限公司）；Gel dox XR+型凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad 公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組、造模及給藥 將SD 大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、牡荊素（3、6、12 mg/kg）組[18]，每組各10 只。除對(duì)照組外，其余各組大鼠均采用卵清白蛋白誘導(dǎo)建立變應(yīng)性鼻炎大鼠模型。依據(jù)參考文獻(xiàn)報(bào)道[1]復(fù)制變應(yīng)性鼻炎大鼠模型：以0.3 mg 卵清白蛋白為抗原＋30 mg 氫氧化鋁為佐劑混合后溶解于1 mL 生理鹽水中制備混懸液，予以大鼠ip 進(jìn)行基礎(chǔ)致敏，隔天1 次，連續(xù)8 次，共計(jì)15 d。第16 天時(shí)經(jīng)鼻腔滴入2%的卵清白蛋白溶液（每側(cè)50 μL），連續(xù)7 d，強(qiáng)化致敏。在末次滴鼻結(jié)束后30 min，觀察大鼠在5 min 內(nèi)的行為，并按照變應(yīng)性鼻炎行為學(xué)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)分，若總分≥5 分則視為變應(yīng)性鼻炎大鼠模型構(gòu)建成功[19]。待變應(yīng)性鼻炎模型構(gòu)建成功后，牡荊素各劑量組大鼠ip 相應(yīng)藥物濃度。對(duì)照組和模型組大鼠ip 等量的生理鹽水，1 次/d，連續(xù)14 d。

1.2.2 大鼠行為學(xué)評(píng)分 末次給藥結(jié)束30 min 后，觀察并記錄在5 min 內(nèi)各組大鼠的行為并進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分。噴嚏次數(shù)：1～3 個(gè)計(jì)1 分，4～10 個(gè)計(jì)2分，≥11 個(gè)計(jì)3 分；鼻流涕：鼻涕流至前鼻孔計(jì)1分，超出前鼻孔計(jì)2 分，鼻涕流至滿面計(jì)3 分；鼻癢程度：輕度的瘙癢、抓撓1～2 次計(jì)1 分，劇烈瘙癢、抓撓＞2 次計(jì)2 分；將上述每項(xiàng)評(píng)分相加得到其行為學(xué)評(píng)分，若行為學(xué)評(píng)分≥5 分視為模型構(gòu)建成功[1]。

1.2.3 大鼠鼻黏膜組織形態(tài)學(xué)觀察 末次給藥結(jié)束后，ip 戊巴比妥鈉麻醉大鼠，進(jìn)行鼻腔開(kāi)縫，剝離鼻黏膜組織，放置于4%的多聚甲醛中固定2 d，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、組織石蠟包埋、切片3～5 μm，行HE 染色，顯微鏡下觀察鼻黏膜組織形態(tài)學(xué)變化。

1.2.4 大鼠鼻黏膜組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)及Fe2+水平檢測(cè) 取各組大鼠鼻黏膜組織，加入預(yù)冷的生理鹽水充分碾磨，4 ℃、3 000 r/min 離心15 min，吸取上清液，采用生化法檢測(cè)鼻黏膜組織勻漿中SOD、GSH、MDA 含量，比色法測(cè)定Fe2+含量。

1.2.5 ROS 水平檢測(cè) 取鼻黏膜組織50 mg，加入適量的緩沖溶液進(jìn)行充分碾磨，于4 ℃、3 000 r/min離心15 min，吸取上清液，按照ROS 檢測(cè)試劑盒進(jìn)行ROS 含量測(cè)定，使用熒光酶標(biāo)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度，BCA 法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

1.2.6 Western blotting 檢測(cè)鐵死亡相關(guān)蛋白及Sirt1/FoxO1 通路蛋白表達(dá) 末次給藥結(jié)束后，立即將大鼠處死，取適量的鼻黏膜組織并提取總蛋白，按照1∶5 質(zhì)量與體積比加入細(xì)胞裂解液，于4 ℃條件下裂解40 min；BCA 法測(cè)定各組大鼠鼻黏膜組織蛋白質(zhì)濃度；蛋白上樣（按照每孔上樣量30 μg計(jì)算得出上樣體積）；凝膠電泳；濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜；5%BSA 室溫封閉2 h；分別加Sirt1 抗體（1∶500）、Ac-FoxO1 抗體（1∶500）、p-FoxO1 抗體（1∶500）、FoxO1 抗體（1∶1 000）、ACSL4 抗體（1∶1 000）、SLC7A11（1∶500）、GPX4（1∶1 000）以及β-actin抗體（1∶2 000），4 ℃條件下孵育16 h；37 ℃條件下二抗孵育60 min；去除二抗后TBST 洗膜15 min；滴加顯影液于Gel Doc XR+成像系統(tǒng)中顯影拍照，并采用Image Pro Plus 6.0 軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)條帶灰度值半定量分析。

1.2.7 Sirt1 抑制劑對(duì)牡荊素改善大鼠鼻黏膜損傷的影響

將SD 大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、牡荊素（12 mg/kg）組、牡荊素＋Sirt1 抑制劑（EX527，5 mg/kg）組，每組各10 只。除對(duì)照組外，其余各組大鼠均采用卵清白蛋白誘導(dǎo)建立變應(yīng)性鼻炎大鼠模型。待模型構(gòu)建成功后，牡荊素組大鼠ip 12 mg/kg牡荊素；牡荊素＋Sirt1 抑制劑組大鼠ip 12 mg/kg 牡荊素后，即刻注射5 mg/kg EX527；對(duì)照組和模型組大鼠ip 等量的生理鹽水。各組大鼠給藥1 次/d，連續(xù)14 d。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 牡荊素對(duì)大鼠行為學(xué)評(píng)分的影響

如表1 所示，與模型組相比，牡荊素各劑量組大鼠行為學(xué)評(píng)分均顯著降低（P＜0.05），且呈劑量相關(guān)性。

表1 各組大鼠行為學(xué)評(píng)分比較（，n =10）Table 1 Comparison of behavioral scores of rats in each group (,n =10)

表1 各組大鼠行為學(xué)評(píng)分比較（，n =10）Table 1 Comparison of behavioral scores of rats in each group (,n =10)

與對(duì)照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05；與牡荊素3 mg·kg-1 組比較：&P＜0.05；與牡荊素6 mg·kg-1 組比較：△P＜0.05。*P ＜ 0.05 vs control group;#P ＜ 0.05 vs model group;&P ＜ 0.05 vs vitexin 3 mg·kg-1 group;△P ＜ 0.05 vs vitexin 6 mg·kg-1 group.

2.2 牡荊素對(duì)大鼠鼻黏膜組織損傷的影響

對(duì)照組大鼠鼻黏膜組織形態(tài)、結(jié)構(gòu)正常。模型組大鼠鼻黏膜組織結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，纖毛出現(xiàn)大片脫落，且伴有大量的炎癥性細(xì)胞浸潤(rùn)，固有層血管擴(kuò)張明顯。與模型組相比，牡荊素各劑量組大鼠鼻黏膜組織上皮排列相對(duì)整齊，纖毛完整、排列方向一致，炎癥性細(xì)胞浸潤(rùn)程度明顯減輕，固有層血管擴(kuò)張降低，且呈劑量相關(guān)性改善鼻黏膜損傷，見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠鼻黏膜組織病理學(xué)（HE，×200）Fig.1 Histopathology of nasal mucosa of rats in each group (HE,× 200）

2.3 牡荊素對(duì)大鼠鼻黏膜組織氧化應(yīng)激水平及Fe2+水平的影響

如表2 所示，與模型組相比，牡荊素各劑量組大鼠鼻黏膜組織勻漿SOD、GSH 活性顯著升高，MDA、ROS、Fe2+含量均顯著降低（P＜0.05），且呈劑量相關(guān)性。

表2 各組大鼠鼻黏膜組織SOD、GSH、MDA、ROS、Fe2+水平比較（，n =10）Table 2 Comparison of SOD,GSH,MDA,ROS,and Fe2+ levels in nasal mucosa tissues of rats in each group (,n =10)

表2 各組大鼠鼻黏膜組織SOD、GSH、MDA、ROS、Fe2+水平比較（，n =10）Table 2 Comparison of SOD,GSH,MDA,ROS,and Fe2+ levels in nasal mucosa tissues of rats in each group (,n =10)

與對(duì)照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05；與牡荊素3 mg·kg-1組比較：&P＜0.05；與牡荊素6 mg·kg-1 組比較：△P＜0.05。*P ＜ 0.05 vs control group;#P ＜ 0.05 vs model group;&P ＜ 0.05 vs vitexin 3 mg·kg-1 group;△P ＜ 0.05 vs vitexin 6 mg·kg-1 group.

2.4 牡荊素對(duì)大鼠鼻黏膜組織鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖2、表3 所示，與模型組相比，牡荊素各劑量組大鼠鼻黏膜組織SLC7A11、GPX4 蛋白表達(dá)顯著升高，ACSL4 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），且呈劑量相關(guān)性。

圖2 各組大鼠鼻黏膜組織SLC7A11、GPX4、ACSL4 蛋白表達(dá)條帶圖Fig.2 Expression bands of SLC7A11,GPX4,and ACSL4 proteins in the nasal mucosa of rats in each group

表3 各組大鼠鼻黏膜組織SLC7A11、GPX4、ACSL4 蛋白相對(duì)表達(dá)量（，n =10）Table 3 Relative expression of SLC7A11,GPX4,and ACSL4 proteins in nasal mucosa tissues of rats in each group (,n =10)

表3 各組大鼠鼻黏膜組織SLC7A11、GPX4、ACSL4 蛋白相對(duì)表達(dá)量（，n =10）Table 3 Relative expression of SLC7A11,GPX4,and ACSL4 proteins in nasal mucosa tissues of rats in each group (,n =10)

與對(duì)照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05；與牡荊素3 mg·kg-1組比較：&P＜0.05；與牡荊素6 mg·kg-1 組比較：△P＜0.05。*P ＜ 0.05 vs control group;#P ＜ 0.05 vs model group;&P ＜ 0.05 vs vitexin 3 mg·kg-1 group;△P ＜ 0.05 vs vitexin 6 mg·kg-1 group.

2.5 牡荊素對(duì)大鼠鼻黏膜組織Sirt1/FoxO1 通路的影響

如圖3、表4 所示，與模型組相比，牡荊素各劑量組大鼠鼻黏膜組織Sirt1、FoxO1 蛋白表達(dá)均顯著升高，p-FoxO1、Ac-FoxO1 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），且呈劑量相關(guān)性。

圖3 各組大鼠Sirt1、FoxO1、p-FoxO1、Ac-FoxO1 蛋白表達(dá)條帶圖Fig.3 Protein expression bands of Sirt1,FoxO1,and Ac-FoxO1 in each group of rats

表4 各組大鼠鼻黏膜組織Sirt1、FoxO1、p-FoxO1、Ac-FoxO1 蛋白相對(duì)表達(dá)量（，n =10）Table 4 Relative expression of Sirt1,FoxO1,p-FoxO1,and Ac-FoxO1 proteins in nasal mucosa tissues of rats in each group(,n =10)

表4 各組大鼠鼻黏膜組織Sirt1、FoxO1、p-FoxO1、Ac-FoxO1 蛋白相對(duì)表達(dá)量（，n =10）Table 4 Relative expression of Sirt1,FoxO1,p-FoxO1,and Ac-FoxO1 proteins in nasal mucosa tissues of rats in each group(,n =10)

與對(duì)照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05；與牡荊素3 mg·kg-1組比較：&P＜0.05；與牡荊素6 mg·kg-1 組比較：△P＜0.05。*P ＜ 0.05 vs control group;#P ＜ 0.05 vs model group;&P ＜ 0.05 vs vitexin 3 mg·kg-1 group;△P ＜ 0.05 vs vitexin 6 mg·kg-1 group.

2.6 Sirt1 抑制劑對(duì)牡荊素改善大鼠鼻黏膜損傷的影響

如表5、圖4 所示，與模型組相比，牡荊素組大鼠行為學(xué)評(píng)分顯著降低（P＜0.05），鼻黏膜上皮損傷明顯減輕。與牡荊素組相比，牡荊素＋EX527組大鼠行為學(xué)評(píng)分顯著升高（P＜0.05），鼻黏膜上皮損傷程度加重。

圖4 Sirt1 抑制劑對(duì)大鼠鼻黏膜組織病理形態(tài)學(xué)的影響（HE，×200）Fig.4 Effect of Sirt1 inhibitor on the pathological morphology of rat nasal mucosa tissue (HE,× 200)

表5 各組大鼠行為學(xué)評(píng)分比較（，n =10）Table 5 Comparison of behavioral scores of rats in each group (,n =10)

表5 各組大鼠行為學(xué)評(píng)分比較（，n =10）Table 5 Comparison of behavioral scores of rats in each group (,n =10)

與對(duì)照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05；與牡荊素組比較：&P＜0.05。*P ＜ 0.05 vs control group;#P ＜ 0.05 vs model group;&P ＜ 0.05 vs vitexin group.

2.7 Sirt1 抑制劑對(duì)大鼠鼻黏膜氧化應(yīng)激及Fe2+水平的影響

如表6 所示，與模型組相比，牡荊素組大鼠鼻黏膜組織勻漿SOD、GSH 活性顯著升高，MDA、ROS、Fe2+含量均顯著降低（P＜0.05）。與牡荊素組相比，牡荊素＋EX527 組大鼠鼻黏膜組織勻漿SOD、GSH 活性顯著降低，MDA、ROS、Fe2+含量均顯著升高（P＜0.05）。

表6 各組大鼠鼻黏膜組織SOD、GSH、MDA、ROS、Fe2+水平比較（，n =10）Table 6 Comparison of SOD,GSH,MDA,ROS and,Fe2+levels in nasal mucosa tissues of rats in each group (,n =10)

表6 各組大鼠鼻黏膜組織SOD、GSH、MDA、ROS、Fe2+水平比較（，n =10）Table 6 Comparison of SOD,GSH,MDA,ROS and,Fe2+levels in nasal mucosa tissues of rats in each group (,n =10)

與對(duì)照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05；與牡荊素組比較：&P＜0.05。*P ＜ 0.05 vs control group;#P ＜ 0.05 vs model group;&P ＜ 0.05 vs vitexin group.

2.8 Sirt1 抑制劑對(duì)大鼠鼻黏膜組織Sirt1/FoxO1通路及鐵死亡的影響

如圖5、表7 所示，與模型組相比，牡荊素組大鼠鼻黏膜組織中Sirt1、FoxO1、GPX4、SLC7A11蛋白表達(dá)均顯著升高，p-FoxO1、Ac-FoxO1、ACSL4蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.05）。與牡荊素組相比，牡荊素＋EX527 組大鼠鼻黏膜組織中Sirt1、FoxO1、GPX4、SLC7A11 蛋白表達(dá)均顯著降低，p-FoxO1、Ac-FoxO1、ACSL4 蛋白表達(dá)均顯著升高（P＜0.05）。

圖5 各組大鼠鼻黏膜組織Sirt1、FoxO1、p-FoxO1、Ac-FoxO1、SLC7A11、GPX4、ACSL4 蛋白表達(dá)條帶圖Fig.5 Expression bands of Sirt1,FoxO1,p-FoxO1,Ac-FoxO1,SLC7A11,GPX4,and ACSL4 proteins in the nasal mucosa of rats in each group

表7 各組大鼠鼻黏膜組織Sirt1、FoxO1、p-FoxO1、Ac-FoxO1、SLC7A11、GPX4、ACSL4 蛋白相對(duì)表達(dá)（，n =10）Table 7 Relative expression of Sirt1,FoxO1,p-FoxO1,Ac-FoxO1,SLC7A11,GPX4,and ACSL4 proteins in nasal mucosatissues of rats in each group (,n =10)

表7 各組大鼠鼻黏膜組織Sirt1、FoxO1、p-FoxO1、Ac-FoxO1、SLC7A11、GPX4、ACSL4 蛋白相對(duì)表達(dá)（，n =10）Table 7 Relative expression of Sirt1,FoxO1,p-FoxO1,Ac-FoxO1,SLC7A11,GPX4,and ACSL4 proteins in nasal mucosatissues of rats in each group (,n =10)

與對(duì)照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05；與牡荊素組比較：&P＜0.05。*P ＜ 0.05 vs control group;#P ＜ 0.05 vs model group;&P ＜ 0.05 vs vitexin group.

3 討論

變應(yīng)性鼻炎具有發(fā)病率、復(fù)發(fā)率高等特點(diǎn)，但是目前有關(guān)其防治手段較為有限，加之變應(yīng)性鼻炎臨床癥狀與分泌性中耳炎、過(guò)敏性結(jié)膜炎及鼻竇炎等疾病的發(fā)生密切相關(guān)，已嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，增加了社會(huì)及家庭的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)?，F(xiàn)如今，變應(yīng)性鼻炎患者的臨床治療藥物多以糖皮質(zhì)激素及抗組胺類藥物為主，能夠明顯減輕患者癥狀，但是長(zhǎng)時(shí)間的使用會(huì)誘發(fā)患者鼻出血、嗜睡等不良反應(yīng)[1]。伴隨中醫(yī)藥在防治變應(yīng)性鼻炎中的不斷發(fā)展，其在變應(yīng)性鼻炎防治中的優(yōu)勢(shì)已逐漸顯現(xiàn)，可以顯著彌補(bǔ)糖皮質(zhì)激素及抗組胺類藥物的不足之處。

牡荊素是從干燥的山楂葉中提取并分離得到的一種黃酮類單體，具有抗炎、抗氧化等生物學(xué)作用。研究顯示，牡荊素能夠降低LPS 誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞凋亡及炎癥因子的釋放[20]。另外，牡荊素能夠通過(guò)調(diào)控自噬、炎癥以及氧化應(yīng)激等途徑改善過(guò)敏性哮喘誘發(fā)的肺部損傷[21]。以上研究提示，牡荊素能夠改善呼吸道炎癥性疾病，但是有關(guān)其對(duì)上呼吸道炎癥性疾病變應(yīng)性鼻炎的作用尚不清楚。為此，本研究首先通過(guò)構(gòu)建變應(yīng)性鼻炎大鼠模型，觀察牡荊素對(duì)其治療效果。結(jié)果顯示，牡荊素能夠以劑量相關(guān)性降低變應(yīng)性鼻炎大鼠行為學(xué)評(píng)分，改善鼻黏膜組織病理性損傷，表明牡荊素具有治療變應(yīng)性鼻炎作用。鐵死亡是一種新型的細(xì)胞調(diào)節(jié)性死亡，被認(rèn)為是鐵依賴性的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的異常代謝，導(dǎo)致ROS 產(chǎn)生增加，進(jìn)而誘發(fā)機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，從而觸發(fā)細(xì)胞死亡[22-24]。SOD 和GSH 作為細(xì)胞內(nèi)抗氧化損傷的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶，其活性的降低可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS 的積累增加，誘導(dǎo)細(xì)胞損傷[25]。MDA 作為細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物，其含量的高低是反映細(xì)胞損傷的重要指標(biāo)[26]。此外，鐵離子可通過(guò)Fenton 反應(yīng)誘導(dǎo)ROS 產(chǎn)生增加以及脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，并最終導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)損傷[27]。本研究結(jié)果顯示，牡荊素能夠呈劑量相關(guān)性增強(qiáng)SOD、GSH 活性，降低MDA、ROS 和Fe2+含量，表明牡荊素能夠抑制變應(yīng)性鼻炎鼻黏膜組織氧化應(yīng)激性損傷。

GPX4、SLC7A11、ACSL4 被認(rèn)為是鐵死亡發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)控基因，其中GPX4 是細(xì)胞中催化還原脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物關(guān)鍵性調(diào)控酶，能夠降解脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物誘發(fā)的細(xì)胞毒性。SLC7A11 介導(dǎo)的胱氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)是合成GSH 所需胱氨酸的主要途徑，抑制SLC7A11 后會(huì)降低GSH 生物合成，導(dǎo)致GPX4 抗氧化能力減低，誘導(dǎo)MDA 產(chǎn)生增多，從而導(dǎo)致細(xì)胞鐵死亡發(fā)生。ACSL4 被證實(shí)是鐵死亡的標(biāo)志物，ACSL4 表達(dá)上調(diào)時(shí)脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物產(chǎn)生會(huì)明顯增多，且GPX4 表達(dá)被顯著抑制，從而導(dǎo)致ROS清除不及時(shí)，進(jìn)而誘導(dǎo)鐵死亡的發(fā)生[28-29]。Gu 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，鐵死亡參與了PM2.5誘導(dǎo)的急性鼻黏膜上皮細(xì)胞損傷。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠鼻黏膜組織中SLC7A11、GPX4 表達(dá)降低，ACSL4 表達(dá)升高，提示變應(yīng)性鼻炎大鼠鼻黏膜組織存在細(xì)胞鐵死亡。牡荊素能夠以劑量相關(guān)性地上調(diào)SLC7A11、GPX4，下調(diào)ACSL4，抑制細(xì)胞鐵死亡發(fā)生。以上研究表明，牡荊素能夠通過(guò)抑制細(xì)胞鐵死亡的發(fā)生，進(jìn)而改善變應(yīng)性鼻炎大鼠鼻黏膜損傷。

Sirt1/FoxO1 信號(hào)通路是與細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥及凋亡等密切相關(guān)。研究顯示，Sirt1 相關(guān)蛋白FoxO1 能夠促進(jìn)SOD 合成，而Sirt1 為NAD+依賴性脫乙酰酶能夠直接去乙酰化FoxO1，可明顯促進(jìn)細(xì)胞保護(hù)基因的表達(dá)[30]。本研究結(jié)果顯示，牡荊素能夠以劑量相關(guān)性激活Sirt1/FoxO1 信號(hào)通路，改善變應(yīng)性鼻炎大鼠癥狀。既往研究顯示，天麻素能夠通過(guò)激活SIRT1/FOXO3A/GPX4 信號(hào)通路抑制腎小管上皮細(xì)胞鐵死亡，從而改善順鉑誘導(dǎo)的小鼠急性腎損傷[31]。Zeng 等[32]研究顯示，白藜蘆醇能夠通過(guò)激活Sirt1/Nrf2 通路介導(dǎo)的心肌細(xì)胞鐵死亡改善膿毒癥誘導(dǎo)的大鼠心肌病，而采用Sirt1 抑制劑EX527 處理能夠誘導(dǎo)心肌細(xì)胞鐵死亡，從而逆轉(zhuǎn)白藜蘆醇對(duì)膿毒癥誘導(dǎo)的大鼠心肌病的保護(hù)作用。為進(jìn)一步明確Sirt1/FoxO1 信號(hào)通路在牡荊素抑制細(xì)胞鐵死亡，改善變應(yīng)性鼻炎大鼠鼻黏膜損傷中的作用。本研究通過(guò)對(duì)牡荊素處理組大鼠ip Sirt1 抑制劑EX527，觀察其對(duì)變應(yīng)性鼻炎大鼠鼻黏膜損傷的作用。結(jié)果顯示，EX527 能夠抑制Sirt1/FoxO1 信號(hào)通路活化，誘導(dǎo)鼻黏膜上皮細(xì)胞鐵死亡，逆轉(zhuǎn)牡荊素對(duì)變應(yīng)性鼻炎大鼠鼻黏膜損傷的保護(hù)作用。

綜上所述，本研究通過(guò)探究牡荊素對(duì)變應(yīng)性鼻炎大鼠鼻黏膜損傷的保護(hù)作用及其調(diào)控機(jī)制。結(jié)果顯示，牡荊素能夠改善變應(yīng)性鼻炎大鼠鼻黏膜損傷，其機(jī)制與激活鼻黏膜組織Sirt1/FoxO1 通路，抑制細(xì)胞鐵死亡有關(guān)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突