基于質量標志物-有效對照提取物模式的黑骨藤質量評價

劉 剛，安蘭蘭，周環(huán)娟，付 艷，王瑞鑫，劉育辰，孫慶文，張永萍

（貴州中醫(yī)藥大學，貴州 貴陽 550025）

中藥質量是中藥有效性和安全性的反映和表征［1］，目前中藥質量標準多是通過使用對照品測定一種或多種成分的含量評價中藥質量，而部分對照品不易獲得，檢測成本高，且與傳統(tǒng)功效的關聯(lián)性不強，難以反映中藥質量與療效的關系［2-4］。鑒于此，國內學者相繼提出了“對照提取物”［5］、“ 中藥質量標志物 （ quality markers，Qmarkers）”［6］中藥質量評價方法，為中藥質量控制研究帶來了新思路，已被應用于多種中藥的質量評價［7-9］。對照提取物法可同時測定樣品（包括藥材、中成藥和提取物等）中的多個指標性成分，且可大大降低檢驗成本，但其指標與功效關聯(lián)性不強，因此，在確認其Q-Marker 的基礎上，以Q-Marker 作為指標性成分更為科學，這種對照提取物稱為“有效對照提取物”。

黑骨藤為蘿藦科植物黑龍骨PeriplocaforrestiiSchltr.的干燥全株［10］，其乙醇提取物乙酸乙酯部位為其抗類風濕性關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）的有效部位［11］，本研究采用藥理學與化學相結合的方法，以黑骨藤為研究對象，制備其抗RA 的有效對照提取物，明確其Q-Marker，建立基于有效對照提取物-中藥質量標志物模式的黑骨藤質量評價體系，嘗試構建能體現(xiàn)中醫(yī)藥特色且與臨床療效相關聯(lián)的中藥質量評價新模式，為進一步完善中藥質量評價體系提供新思路。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1290 InfinityⅡ超高效液相色譜儀，配置二元梯度泵、高能自動進樣器、DAD 檢測器和色譜工作站（美國Agilent 公司）； FA2204B 型電子天平（萬分之一，上海天美天平儀器有限公司）； MS205DU 型電子天平［十萬分之一，梅特勒-托利多儀器（中國）有限公司］； DZ-2BCIV 型真空干燥箱 （天津市泰斯特儀器有限公司）；TD5A-WS 型離心機 （湖南湘立科學儀器有限公司）；JE1002 型電子天平（上海浦春計量儀器有限公司）； MNT-150 型數(shù)顯卡尺 （浙江德清信泰電子科技有限公司）；Rayto RT-6100 酶標分析儀（深圳雷杜生命科學股份有限公司）； CX22 光學顯微鏡（日本Olympus 公司）； RM2235 石蠟切片機、DM1000 徠卡顯微成像系統(tǒng)（德國Leica 公司）。

1.2 試劑與藥物 黑骨藤經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學藥學院劉育辰教授鑒定為蘿藦科杠柳屬植物黑龍骨PeriplocaforrestiiSchltr.，具體見表1。雷公藤多苷片（批號1450003，貴州漢方藥業(yè)有限公司）。新綠原酸（批號CHB190217）、綠原酸 （批號 BD33230、CHB190121）、隱綠原酸 （批號CHB180905）、綠原酸甲酯（批號CHB190117）、異綠原酸B （批號CHB180923）、異綠原酸A （批號CHB180921）、異綠原酸C （批號CHB180925）均購于成都克洛瑪生物科技有限公司，純度均大于98%。PRP-512B 型樹脂（北京聚福樹脂廠）； 牛Ⅱ型膠原溶液（批號200297）、弗氏完全佐劑（批號200200）、弗氏不完全佐劑（批號200336）均購于美國Chondrex 公司。EDTA 脫鈣液（型號B0317-11，四川楊克斯特科技有限公司）； 7122 蘇木素、伊紅（美國Thenrmo Fisher Scientific 公司）。乙腈 （色譜純，美國TEDIA 公司）； 其余試劑均為分析純； 水為純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。SPF 級SD 大鼠，體質量（200±20 g），購于湖南省長沙市天勤生物技術有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK （湘）2019-0014，實驗動物使用許可證號SYXK （黔）2021-0005，于室溫下適應性飼養(yǎng)7 d。實驗經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準（審批號20210161）。

表1 樣品信息

2 方法與結果

2.1 對照提取物制備 取黑骨藤粗粉適量置于圓底燒瓶中，加入25 倍量70%乙醇，加熱回流提取3 次，每次1 h，合并提取液，減壓濃縮至無醇味，加水混懸，依次用等量石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取，各3 次，合并乙酸乙酯萃取液，減壓濃縮，真空干燥，即得乙酸乙酯萃取部位。

精密稱取黑骨藤乙酸乙酯萃取部位10 g，加等量PRP-512B 型樹脂拌樣，裝柱。依次用20%、30%、50% 甲醇梯度洗脫，每個梯度4 000 mL。其中，20% 甲醇洗脫段前1 000 mL 合并為第1 段（a1），中間2 500 mL 合并為第2 段（a2），后500 mL 為第3 段（a3），30%、50% 甲醇洗脫段各自合并，分別為a4、a5。精密稱取a5 段2 g，用等量PRP-512B 型樹脂拌樣，裝柱，依次用20%、30%、50% 甲醇梯度洗脫，各自合并為b1 段、b2 段、b3 段。將以上a2段和b3 段按一定比例合并，即得黑骨藤對照提取物。

2.2 對照提取物抗類風濕性關節(jié)炎有效性驗證

2.2.1 造模、分組和給藥 56 只大鼠隨機選取8 只作為空白對照組，其余48 只參考文獻［12］方法建立CIA 藥理模型，并隨機分成6 組，分別為雷公藤多苷（TG）對照組（10 mg／kg）、模型組、對照提取物給藥低劑量組（36 mg／kg）、對照提取物給藥高劑量組（144 mg／kg）、對照品（按對照提取物中各成分所占比例混合配制）給藥低劑量組、對照品給藥高劑量組，每組8 只。各藥物用生理鹽水溶液分散，空白對照組和模型組給予生理鹽水溶液，給藥體積均為10 mL／kg，灌胃28 d，每天1 次。

2.2.2 一般指標檢測 從造模前1 d 及造模成功后第7 天開始，每7 d 測量各組大鼠右足趾、左足趾厚度，兩者厚度差值作為腫脹度，并記錄體質量變化。

2.2.3 關節(jié)炎指數(shù)（arthritis index，AI）評分 從造模成功后的第7 天開始，每天觀察并詳細記錄各組大鼠全身的關節(jié)病變程度，按照5 級評分法評價［13］，將4 個關節(jié)的積分進行累計，即為每只大鼠的AI。

2.2.4 血清因子測定、滑膜病理變化觀察 大鼠給藥第28天后禁食12 h 以上，不禁水，用麻醉劑麻醉，腹主動脈取血，迅速將血液于冰浴上靜置30 min，置于離心機中離心20 min （轉速4 000 r／min），取上清液，置于-80 ℃冰箱中備用。根據(jù)ELISA 試劑盒說明書操作，大鼠取血后麻醉脫頸處死，去除左后足踝關節(jié)皮毛，用動物骨剪取下踝關節(jié)，置于4%多聚甲醛中性固定液中固定，常規(guī)脫鈣后包埋組織塊于石蠟中，切成5 μm 薄片，脫蠟后伊紅染色，顯微鏡下觀察組織病理學變化。

2.2.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 24.0、Graphpad Prism 8.0.2 軟件進行分析及作圖，數(shù)據(jù)以（±s）表示，再進行單因素方差分析，方差齊時組間兩兩比較采用LSD 檢驗，方差不齊時組間兩兩比較采用Tamhance’s T2 檢驗。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2.2.6 藥理實驗結果

2.2.6.1 黑骨藤對照提取物對CIA 大鼠的影響 （1）對CIA 大鼠后足足趾厚度的影響。給藥前，與模型組比較，各給藥組對后足足趾厚度的影響無顯著性差異（P＞0.05），空白對照組有極顯著差異（P＜0.01），給藥第28 天后仍有極顯著性差異（P＜0.01），說明造模成功，模型相對穩(wěn)定；給藥第28 天后，與模型組比較，TG 組、對照提取物給藥低劑量組、對照提取物給藥高劑量組對右后足足趾厚度的影響均有極顯著性差異（P＜0.01）； 同樣給藥第28 天后，與模型組比較，TG 組、對照提取物給藥低劑量組、對照提取物給藥高劑量組對左后足足趾厚度的影響也均有極顯著性差異（P＜0.01）。

（2）對CIA 大鼠AI 值的影響。給藥前，與模型組比較，各給藥組無顯著性差異（P＞0.05）； 給藥第28 天后，與模型組比較，對照提取物給藥低劑量組、高劑量組和TG組均有極顯著性差異（P＜0.01）； 模型組第0～28 天無顯著性差異（P＞0.05）； 對照提取物給藥高劑量組在給藥第13天之后有極顯著差異（P＜0.01），TG 組與對照提取物給藥低劑量組在給藥第20 天后有極顯著性差異（P＜0.01）。

（3）對CIA 大鼠血清促炎細胞因子表達的影響。與模型組比較，對照提取物給藥低劑量組大鼠血清中TNF-α 水平降低（P＜0.01），對照提取物給藥高劑量組大鼠血清中TNF-α 水平降低（P＜0.05），TG 組大鼠血清中TNF-α 水平降低（P＜0.05）； 與空白對照組比較，模型組大鼠血清中TNF-α 水平升高（P＜0.01），TG 組TNF-α 水平升高（P＜0.05）。

2.2.6.2 對照品對CIA 大鼠的影響

（1）對照品對CIA 大鼠后足足趾厚度的影響。給藥前，與模型組比較，各藥物組無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），空白對照組有極顯著差異（P＜0.01），給藥28 d 后仍有極顯著性差異（P＜0.01），說明造模成功，模型相對穩(wěn)定； 給藥28 d 后，與模型組比較，對照品低、高劑量組和TG 組對右后足足趾厚度的影響均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）； 同樣給藥第28 天后，與模型組比較，TG 組、對照品低劑量組、高劑量組對左后足足趾厚度的影響也均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

（2）對照品對CIA 大鼠AI 值的影響。給藥前，與模型組比較，各藥物組無明顯差異（P＞0.05）； 給藥第28 天后，與模型組比較，對照品低劑量組、高劑量組和TG 組有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

（3）對照品對CIA 大鼠血清促炎細胞因子表達的影響。與模型組比較，對照品低劑量組大鼠血清中TNF-α 水平降低（P＜0.05），對照品高劑量組大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α 水平降低（P＜0.01）； 與TG 組比較，對照品高劑量組大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α 水平降低（P＜0.01）；與對照品低劑量比較，對照品高劑量組大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α 水平降低（P＜0.01）； 與空白對照組比較，模型組大鼠血清中TNF-α 水平升高（P＜0.01），TG 組和對照品低劑量組大鼠血清中TNF-α 水平升高（P＜0.05）。

2.3 對照提取物成分含量測定 采用UPLC 法。

2.3.1 色譜條件 ZORBAX Eclipse plus C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）； 流動相0.1% 甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫 （0 ～3.4 min，7% ～9% B； 3.4 ～5.4 min，9% ～11% B； 5.4 ～7 min，11% ～13% B； 7 ～8.3 min，13% ～13.5% B； 8.3 ～10 min，13.5% ～15% B； 10 ～14.5 min，15% ～15.1% B； 14.5～15 min，15.1% ～16% B；15～17 min，16% ～18% B； 17～21 min，18% ～21% B； 21～23 min，21% ～26% B； 23 ～25 min，26% ～100% B）； 體積流量0.2 mL／min； 柱溫30 ℃； 檢測波長327 nm； 進樣量2 μL。色譜圖見圖1。

圖1 對照品（A）、黑骨藤對照提取物（B）UPLC 色譜圖

2.3.2 對照品溶液制備 分別精密稱取對照品新綠原酸5.06 mg、綠原酸25.05 mg、隱綠原酸8.04 mg、綠原酸甲酯5.05 mg，異綠原酸B 5.02 mg，異綠原酸A 5.00 mg，異綠原酸C 7.05 mg，置于50 mL 量瓶中，50%甲醇溶解并稀釋至刻度，得對照品溶液①，搖勻，精密吸取1 mL，置于100 mL 量瓶中，50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，得對照品溶液②。

2.3.3 供試品溶液制備 精密稱取黑骨藤對照提取物14 mg，置于10 mL 量瓶中，加50% 甲醇2 mL，超聲處理1 min，冷卻至室溫，50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 方法學考察

2.3.4.1 線性關系考察 精密吸取不同體積對照品溶液適量，在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定。以對照品進樣量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，結果見表2，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表2 各成分線性關系（Ⅰ）

2.3.4.2 精密度試驗 對照品溶液①在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、綠原酸甲酯、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 峰面積RSD 分別為 0.07%、0.10%、0.08%、0.09%、0.11%、0.15%、0.15%，表明儀器精密度良好。

2.3.4.3 重復性試驗 精密稱取對照提取物6 份，按“2.3.3” 項下方法制備供試品溶液，在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定，測得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、綠原酸甲酯、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 含量RSD分別為1.09%、0.34%、0.51%、1.22%、1.10%、1.21%、2.13%，表明該方法重復性良好。

2.3.4.4 穩(wěn)定性試驗 按“2.3.3” 項下方法制備供試品溶液1 份，于0、2、4、8、12、20、24 h 在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定，測得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、綠原酸甲酯、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 峰面積RSD 分別為 0.35%、0.14%、0.39%、0.28%、2.26%、0.34%、0.20%，表明溶液在24 h 內穩(wěn)定性良好。

2.3.4.5 加樣回收率試驗 精密稱定各成分含量已知的對照提取物6 份，每份7 mg，按100%水平加入對照品溶液，按“2.3.3” 項下方法制備供試品溶液，在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、綠原酸甲酯、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 平均加樣回收率 （RSD）分別為102.51%（0.68%）、100.85% （1.27%）、99.05% （1.45%）、97.84%（ 2.37%）、100.33% （ 1.55%）、99.49%（ 1.53%）、97.70% （1.32%）。

2.3.5 樣品含量測定 取3 批對照提取物，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定，計算含量。結果，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、綠原酸甲酯、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 含量總和分別為51.81%、53.30%、52.46%，表明該方法重復性良好，可用于制備對照提取物。

2.4 對照提取物在黑骨藤質量控制中的應用

2.4.1 對照提取物溶液制備 精密稱取黑骨藤對照提取物40.03 mg，置于5 mL 量瓶中，加50%甲醇2 mL，超聲處理1 min，放冷至室溫，50% 甲醇定容至刻度，搖勻，溶解，制成新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、綠原酸甲酯、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 質量濃度分別為0.205 0、2.958 8、0.763 3、0.455 2、0.016 8、0.031 3、0.059 2 mg／mL 的溶液A，再分別稀釋10、100、250 倍，作為溶液B、C、D。

2.4.2 供試品溶液制備 精密稱取藥材粉末16.0 g，按“2.1” 項下方法制備醇提物乙酸乙酯萃取部位（HGT-C），精密稱取25 mg，置于10 mL 量瓶中，2 mL 甲醇溶解并定容，0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4.3 色譜條件 同“2.3.1” 項，色譜圖見圖2。

圖2 對照提取物（A）、黑骨藤（B）UPLC 色譜圖

2.4.4 方法學考察

2.4.4.1 線性關系考察 精密吸取“2.4.1” 項下對照提取物溶液適量，在“2.4.3” 項色譜條件下進樣測定。以對照品進樣量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，結果見表3，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表3 各成分線性關系（Ⅱ）

2.4.4.2 方法學考察 表4 顯示，該方法儀器精密度、方法重復性、穩(wěn)定性、準確性均良好，可用于含量測定。

表4 方法學考察結果

2.4.5 樣品含量測定 取12 批藥材，按“2.4.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.4.3” 項色譜條件下進樣測定，分別采用對照提取物法、單體對照品法計算含量，結果見表5。

表5 各成分含量測定結果（mg／g）

3 討論

3.1 藥理實驗研究 通過藥理學實驗驗證，發(fā)現(xiàn)黑骨藤對照提取物和含有7 種咖啡酰基奎寧酸類成分的對照品可有效緩解足趾腫脹，減小關節(jié)炎評分，并且有效減少了CIA大鼠血清中的促炎細胞因子水平，尤其是TNF-α，表明黑骨藤乙酸乙酯部位所含的咖啡?；鼘幩犷惓煞志哂辛己玫目筊A 活性。

3.2 黑骨藤抗RA 質量標志物辨識 RA 是一種自身免疫性疾病，它導致滑膜組織和關節(jié)慢性炎癥，導致關節(jié)功能障礙，最終導致殘疾［14］。CIA 模型與人RA 具有共同的免疫學和病理學特征，因此常用于新藥或其他治療藥物的初步藥理學研究［15］。體內外實驗結果顯示［16-21］，黑骨藤中咖啡?；鼘幩犷惓煞志哂休^好的抗類風濕性關節(jié)炎活性。本研究通過藥理學實驗證實對照提取物組和咖啡?；鼘幩犷惓煞謱φ掌?，都具有一定的抗RA 作用，進一步驗證了黑骨藤中的7 個咖啡?；鼘幩犷惓煞质瞧淇筊A 的藥效物質基礎。黑骨藤有效對照提取物中7 種咖啡酰基奎寧酸類成分是黑骨藤中固有的化學成分，具有明確的化學結構式，藥理實驗驗證其與黑骨藤抗RA 功效密切相關，同時可進行定量測定，均滿足Q-marker 的基本條件。因此，上述7 種咖啡?；鼘幩犷惓煞挚勺鳛楹诠翘倏筊A 的Qmarker。

3.3 含量測定色譜條件篩選 通過DAD 檢測器對7 種成分的單一對照品溶液進行全波長掃描，以327 nm 為最大吸收波長。并對流動相、柱溫、進樣量及體積流量進行考察。結果表明，流動相為乙腈-0.1%甲酸時色譜峰峰形最好，分離效果最佳； 柱溫為30 ℃時色譜峰分離度最好； 進樣量為1、3 μL 時色譜峰出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，2 μL 時色譜峰峰形最佳；體積流量為0.2 mL／min 時分離效果好，并且可節(jié)約試劑。3.4 有效對照提取物法驗證 本研究分別采用了對照提取物法和對照品法對黑骨藤中綠原酸等7 種咖啡?；鼘幩犷惓煞诌M行了含量測定分析，結果顯示2 種方法所得結果基本一致，說明對照提取物法可以用于黑骨藤的質量控制，檢測成本更低，方法更簡單，更符合中藥多成分的特色［22］，同時也解決了此類成分不穩(wěn)定、難以制備的難題。上述結果為明確黑骨藤抗RA 的藥效物質基礎和建立全面科學的相關質量評價體系提供了理論基礎。