茶皂苷-黃芩苷膠束的溶解性及功效性研究

蔡寶國，粟艷婷，王少茹，張 健

（上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海 200418）

黃芩苷是黃酮類化合物，作為黃芩中的主要活性成分，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗抑郁、抗過敏等作用［1-3］。此外，黃芩苷在化妝品也占有重要地位，其是一種具有防曬性能和美白的天然物質(zhì)［4］。但由于黃芩苷水溶性極差，且性質(zhì)不穩(wěn)定，生物利用度極低，僅為2.2%［5］，限制了它在藥學(xué)和化妝品領(lǐng)域中的應(yīng)用。

提高黃芩苷溶解性的研究數(shù)量眾多，主要的制劑技術(shù)有納米粒［6］、納米乳液［7］、脂質(zhì)體［8］、固體分散體［9］、納米混懸液［10］、β-環(huán)糊精包合［11］、聚合物膠束［12］等，這些技術(shù)均能在一定程度上提高黃芩苷的溶解性及其生物利用度，但也存在局限性，如納米粒輔料復(fù)雜可能帶來的毒副作用，脂質(zhì)體成型困難、載藥量低及易泄露，固體分散體儲存時不穩(wěn)定易老化，β-環(huán)糊精疏水空腔對客分子的限制，聚合物膠束輔料的安全性等問題［13］。茶皂苷又稱茶皂素，是一種從茶籽提取的天然非離子型表面活性劑，結(jié)構(gòu)中含有親水性的糖體和疏水性的皂苷元，具有獨特的雙親性功能［14］，研究和發(fā)展前景日趨廣闊［15］。鑒于現(xiàn)有的黃芩苷制劑未能完全滿足黃芩苷的臨床應(yīng)用，利用茶皂苷能夠在水中自組裝形成膠束的性質(zhì)來增加黃芩苷的水溶性，實現(xiàn)黃芩苷的傳遞吸收，從而提高黃芩苷的生物利用度。

1 材料

1.1 儀器 M200PRO 多功能酶標儀（奧地利帝肯公司）；Q2000 差示掃描量熱儀（美國TA 公司）； Tecnai G2 ST 透射電子顯微鏡（日本電子株式會社）； 2NS3600 納米粒度和電位儀（英國馬爾文儀器有限公司）； VERTEX-70 傅里葉紅外光譜儀（德國Bruker 公司）； Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）； UV-1800 紫外分光光度計（日本島津公司）； RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海江儀儀器有限公司）； HT-111B 恒溫搖床 （上海赫田科學(xué)儀器有限公司）； AL104 分析天平 （瑞士梅特勒-托利多公司）；1620QT 超聲波震蕩器（昆山市超聲儀器有限公司）；

1.2 試劑與藥物 黃芩苷對照品（純度≥90%）、過氧化硫酸鉀（分析純）（上海阿達瑪斯試劑有限公司）； 茶皂苷原料藥（純度≥90%，湖南今漢藥業(yè)有限公司）； 聚乙二醇-400 （PEG-400，分析純，上海泰坦科技股份有限公司）；茶皂苷對照品（純度98%，上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司）； 酪氨酸酶（25KU，上海威林頓生物科技有限公司）；L-酪氨酸（純度≥99%，深圳市瑞必拓科技有限公司）。超純水（色譜純，上海屈臣氏日用品有限公司）。

2 方法

2.1 黃芩苷膠束制備 精密稱取茶皂苷15 g，溶于50%乙醇中，60 ℃下超聲提取40 min，過濾。分別稱取黃芩苷1 g、PEG-400 0.5 g，混勻后加入茶皂苷濾液中，超聲提取20 min，85 ℃水浴旋蒸除去溶劑，得到黃芩苷膠束的固體粉末，加入蒸餾水溶解，即得。

2.2 黃芩苷含量測定 精密稱取黃芩苷對照品1 mg，置于10 mL 量瓶中，加入50%乙醇至刻度，得到質(zhì)量濃度為100 μg／mL 的貯備液，依次稀釋為50、40、30、20、10 μg／mL對照品溶液。對照品溶液和空白載體（50%乙醇）在150～500 nm 波長內(nèi)進行掃描，確定黃芩苷的最大吸收波長及空白載體的干擾。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標（X），最大吸收波長處吸光度為縱坐標（A）進行回歸，計算含量。將黃芩苷膠束固體粉末和純黃芩苷用10 mL 蒸餾水溶解形成過飽和溶液，過濾后取上清液，用50%乙醇稀釋至適當(dāng)濃度后采用紫外分光光度法測定黃芩苷含量，代入方程中計算溶解度。

2.3 粒徑和形貌測定 取新鮮制備的黃芩苷膠束溶液置于石英比色皿和U 形電位杯中，利用動態(tài)光散射粒徑儀測定黃芩苷膠束粒徑，平衡120 s，重復(fù)3 次，取平均值。采用透射電鏡觀察黃芩苷膠束形態(tài)，將黃芩苷膠束溶液稀釋至適宜質(zhì)量濃度后，滴加于銅網(wǎng)上，用濾紙吸去多余液體。將銅網(wǎng)置于室溫下自然風(fēng)干，使膠束粒子在銅網(wǎng)上濃縮沉積，在透射電鏡下進行觀測并拍照，測定條件為電壓200 kV，電子束電流102 μA。

2.4 紅外光譜和差示掃描量熱分析 采用傅里葉變換紅外光譜（FTIR）對茶皂苷、黃芩苷、黃芩苷膠束進行測定，推斷茶皂苷和黃芩苷的相互作用。分別取適量黃芩苷膠束、茶皂苷、黃芩苷物理混合物于氧化鋁坩堝中，進行差示掃描量熱（DSC）測試，參比對照為氧化鋁坩堝，氣體為氮氣，升溫速率為10 ℃／min，在30～200 ℃范圍內(nèi)掃描，測定樣品與參比的熱量變化值。

2.5 體外釋放試驗 精密量取1 mL 1 mg／mL 黃芩苷膠束和黃芩苷-丙二醇溶液，分別置于預(yù)溶脹、截留分子量為15 kDa 的透析袋中，排出氣泡，將透析袋兩頭密封后置于100 mL 0.5%吐溫80-pH 6.8 磷酸緩沖液中，37 ℃恒溫水浴中85 r／min 振蕩，于0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、12 h各取出1 mL，并及時補充等體積等溫度的樣品，HPLC 法測定黃芩苷含量。參照文獻 ［16］方法，色譜條件為Agilent Zorbax SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流動相甲醇（A）-0.1% 甲酸（B），梯度洗脫（0 ～5 min，0～10% A； 5 ～10 min，10% ～60% A； 10 ～25 min，60% ～90%A； 25～35 min，90% ～10%A）； 體積流量0.8 mL／min；柱溫30 ℃； 檢測波長278 nm； 進樣量10 μL。精密吸取0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mL 黃芩苷貯備液至10 mL 量瓶中，加入0.5%吐溫80-pH 6.8 磷酸緩沖液混勻并定容，得到質(zhì)量濃度為5、10、15、20、25 μg／mL 的標準溶液，計算藥物累積釋放量并繪制釋放曲線，公式為Er＝，其中Er為黃芩苷累積釋放量，Ve為樣品置換體積，V0為樣品體積，Ci為第i次取樣時黃芩苷質(zhì)量濃度，m為黃芩苷加入量，n為置換樣品次數(shù)。

2.6 酪氨酸酶抑制率測定 參照文獻［17］方法，分別取適量黃芩苷、黃芩苷膠束，加水溶解，制成黃芩苷濃度為1.3 μmol／mL 的樣品。按表1 方案設(shè)計反應(yīng)液。

表1 反應(yīng)液設(shè)計方案

取4 mL 離心管，按照表1 方案分別加入樣品、PBS（pH 6.8）、100 U／mL 酪氨酸酶，在37 ℃下恒溫水浴10 min，再加入1 mL 1.5 mmol／L 酪氨酸，在37 ℃下反應(yīng)5 min，吸取200 μL 各組溶液至96 孔板中，在475 nm 波長處測定吸光度（A），總測定時間為20 min，各反應(yīng)組吸光度分別為A1、A2、A3、A4，重復(fù)3 次，計算酪氨酸酶抑制率，公式為抑制率＝ ［1- （A3-A4）／ （A1-A2）］×100%。通過GraphPad 8.0 軟件進行處理，數(shù)據(jù)以（±s）表示，組間兩兩比較采用t檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.7 ABTS 自由基清除率的測定 參照文獻［18］方法，取適量ABTS 配制成濃度為7.4 mmol／L 的溶液，與2.6 mmol／L 過氧化硫酸鉀溶液等比例混合，室溫黑暗放置12～16 h，在734 nm 波長處測定吸光度，無水乙醇稀釋100 倍至吸光度為0.7，即得ABTS 貯備液。在96 孔板上加入100 μL ABTS 儲備液，分別加入50 μL 質(zhì)量濃度為0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 mg／mL 的黃芩苷、黃芩苷膠束，混勻后室溫放置避光反應(yīng)30 min，在734 nm 波長處測定吸光度（A3），100 μL 乙醇與50 μL 黃芩苷、黃芩苷膠束測得的吸光度為A2，100 μL ABTS 儲備液加50 μL 乙醇測得的吸光度為A1，計算ABTS 自由基清除率，公式為清除率＝ ［1-（A3-A2）／A1］×100%。

3 結(jié)果

3.1 黃芩苷膠束含量及溶解度 黃芩苷全波長掃描圖譜顯示，在278 nm 波長處有最大吸收峰，但有干擾； 黃芩苷在319 nm 波長處顯示第2 個較大的吸收峰，干擾較小，故選擇319 nm 作為檢測波長。黃芩苷回歸方程為A＝51.4X＋0.168 （r＝0.995 5），在10 ～50 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。將黃芩苷膠束粉末復(fù)溶于水，得到溶液為黃色澄清透明溶液，無不溶性顆粒，見圖1； 黃芩苷溶解度為1.823 mg／mL，比在水中的（0.123 mg／mL）增加了15 倍。

圖1 黃芩苷膠束溶液形態(tài)

3.2 黃芩苷膠束粒徑和形貌 黃芩苷膠束平均粒徑為249 nm，分散系數(shù)（PDI）為0.30，表明它在水中分布均勻，所形成的粒徑較小，在透射電鏡下形成球狀和殼-核結(jié)構(gòu)，見圖2。黃芩苷膠束為雙層球形狀，外殼為整齊排列的茶皂苷，可以推測出形成疏水端朝內(nèi)、親水端朝外與水分子結(jié)合，從而增大溶解性； 中間分散著少量PEG-400，其部分連接著黃芩苷的表面，PEG-400 上的羥基與黃芩苷的羥基可以形成氫鍵作用，輔助茶皂苷和黃芩苷形成膠束結(jié)構(gòu)； 分子間存在著相互作用力、氫鍵、疏水相互作用，對黃芩苷膠束的形成具有主要的作用。

圖2 空白膠束、黃芩苷膠束透射電鏡圖

3.3 紅外光譜分析 由圖3 可知，黃芩苷的特征吸收峰1 409、1 564、1 662 cm-1為苯環(huán)的C ＝C 伸縮振動吸收峰，900～650 cm-1為芳烴的C-H 面外彎曲振動吸收峰，1 722 cm-1為C＝O 的伸縮振動吸收峰，1 206 cm-1為C-O 伸縮振動吸收峰，2 891、2 982 cm-1為C-H 伸縮振動特征峰； 茶皂苷吸收峰均在黃芩苷膠束納米粒載藥系統(tǒng)中呈現(xiàn)，但黃芩苷在1 409、1 564、1 662、1 722 cm-1處的特征峰減弱或消失，同時黃芩苷在675、749、909 cm-1處的吸收峰也消失，表明黃芩苷被包裹進膠束體系外殼內(nèi)，膠束系統(tǒng)已形成，其特征峰被掩蓋未出現(xiàn)。綜上所述，形成納米膠束后黃芩苷特征峰發(fā)生變化，進一步表明黃芩苷膠束載藥系統(tǒng)已經(jīng)形成。

圖3 茶皂苷、黃芩苷、黃芩苷膠束紅外光譜圖

3.4 DSC 分析 由圖4 可知，黃芩苷與載體的物理混合物在76.8 ℃處形成寬的吸熱熔融峰，在黃芩苷膠束發(fā)生了偏移； 物理混合物在89.4 ℃處出現(xiàn)1 個小的熔融吸熱峰，而黃芩苷膠束曲線中未出現(xiàn)該熔融峰； 物理混合物160 ℃左右有3 個尖銳的吸熱熔融峰，而黃芩苷膠束中該峰消失，表明在載藥黃芩苷膠束系統(tǒng)中黃芩苷與載體的物相狀態(tài)發(fā)生了改變，印證了該載藥系統(tǒng)的形成。

圖4 物理混合物、黃芩苷膠束差熱分析圖

3.5 對體外釋放的影響 由于黃芩苷基本不溶于水，因此導(dǎo)致其需要溶液形式的給藥途徑困難，一般可以用丙二醇輔助其溶解。黃芩苷膠束、黃芩苷-丙二醇溶液體外釋放曲線見圖5，在pH 6.8 磷酸緩沖液中，黃芩苷-丙二醇溶液呈現(xiàn)突釋的趨勢，在2 h 時的釋放量達到43.3%； 黃芩苷膠束呈現(xiàn)出較緩慢的釋放趨勢，在2 h 時的釋放量為26.0%；黃芩苷-丙二醇溶液從2 ～6 h 的釋藥量迅速增大呈直線上升，達到80%以上； 黃芩苷膠束溶液釋放曲線較平緩，12 h 時的累積藥物釋放量為65.4%，表明黃芩苷膠束具有緩釋效果，推測膠束可能存在氫鍵、疏水相互作用力，并且電鏡照片顯示黃芩苷被包裹于膠束的中心，從而使其具有緩慢釋放的特性。另外，黃芩苷膠束的緩慢釋放特性可以使包載的黃芩苷免受皮膚環(huán)境或其他外側(cè)環(huán)境的破壞，保持黃芩苷的藥理活性，從而有利于增加黃芩苷的吸收利用度。

圖5 黃芩苷膠束、黃芩苷-丙二醇體外釋放曲線

3.6 對酪氨酸酶抑制率的影響 酪氨酸酶是黑色素產(chǎn)生的關(guān)鍵酶，它控制著黑色素的形成過程，其活性程度對色素的沉積起主要作用，黑色素水平的增加會導(dǎo)致人體皮膚的色素沉著障礙，如黃褐斑、雀斑、老年斑和惡性黑色素瘤［19］。由圖6 可知，黃芩苷與黃芩苷膠束的起始抑制率分別為34.4%、73.0%，即黃芩苷膠束對酪氨酸酶的抑制率顯著優(yōu)于黃芩苷； 黃芩苷膠束對酪氨酸酶的抑制率隨著時間延長下降較黃芩苷緩慢，20 min 時后者降低至3.93%，而前者仍達53.86%。黃芩苷膠束化后，黃芩苷被包載在緊密排列的膠束內(nèi)核中，阻止了與外界空氣的接觸，有效提高了黃芩苷的穩(wěn)定性，同時延緩了其釋放至環(huán)境的時間，使其能夠長時間保留藥物性質(zhì)，起到緩釋作用。茶皂苷對酪氨酸酶作用的報道極少［20］，黃芩苷膠束對酪氨酸酶的抑制作用可能包含了茶皂苷對酶的共同作用，目前其在膠束中作用大小的強度影響尚待進一步研究。黃芩苷本身具有美白特性，通過制備成黃芩苷膠束增大了其對酪氨酸酶活性的抑制，有助于多巴色素的還原，從而減少和抑制黑色素的生成，達到美白祛斑的作用。

圖6 黃芩苷膠束、黃芩苷對酪氨酸酶抑制率的影響（±s，n＝3）

圖7 黃芩苷膠束、黃芩苷對ABTS 自由基清除率的影響（±s，n＝3）

3.7 對ABTS 自由基清除率的影響 由圖6 可知，黃芩苷膠束、黃芩苷對ABTS 自由基均具有較強的清除作用，并呈濃度依賴性； 在質(zhì)量濃度0～0.4 mg／mL 范圍內(nèi)，黃芩苷膠束對ABTS 自由基的清除率始終高于黃芩苷，為0.1 mg／mL時就達到了ABTS 的半數(shù)有效自由基清除率以上，清除率為57.1%，此時黃芩苷對ABTS 自由基清除率僅為31.2%，其半數(shù)有效清除率為0.2 mg／mL； 黃芩苷膠束在0.3 mg／mL 的清除率已經(jīng)達到最大清除率，接近100%。茶皂苷具有一定的抗氧化能力［21］，其對DPPH 自由基、ABTS 自由基、羥基自由基（·OH）清除能力以及抗壞血酸的IC50在6 ～10 mg／mL 之間［22-23］，而黃芩苷膠束清除ABTS 自由基的IC50低于0.1 mg／mL，與茶皂苷單獨作用相差較大，推測原因可能是黃芩苷形成膠束后，在水中溶解度提高，從而其生物活性也得到相應(yīng)的提升。結(jié)果表明經(jīng)膠束化后可以有效的提高黃芩苷清除自由基的能力，從而提高黃芩苷的抗氧化能力。

4 討論

采用溶劑蒸發(fā)法制備得到黃芩苷膠束固體顆粒制劑，該顆粒復(fù)溶于水中能得到澄清透明的膠束溶液，紅外光譜和差示掃描圖譜分別顯示在膠束中某些黃芩苷特征峰消失及熱吸收物相變化，進一步表明膠束系統(tǒng)的形成。膠束化后黃芩苷在水中的溶解性比未經(jīng)制備的黃芩苷增大了15倍。透射電鏡結(jié)果表明黃芩苷能夠包載于圓形膠束內(nèi)殼中，一定程度上能夠保護黃芩苷，增強其穩(wěn)定性。體外釋放實驗表明黃芩苷膠束具有緩釋特性，能夠延長黃芩苷的釋放，使其具有更長的作用時間，這一性能可以克服黃芩苷很快被酶代謝消除的缺點，延長藥物的作用時間，能夠有利于到達病灶部位發(fā)揮作用。通過比較相同濃度的黃芩苷膠束和黃芩苷對酪氨酸酶抑制率的結(jié)果顯示黃芩苷膠束的抑制率顯著高于黃芩苷的抑制率，而且隨著時間的增加黃芩苷膠束對酪氨酸酶的抑制率下降較為緩慢，增加黃芩苷的作用。黃芩苷膠束對ABTS 自由基具有良好的清除效果，低濃度下就具有較大的清除能力，黃芩苷膠束對ABTS 自由基的清除能力提高了2 倍。

綜上所述，黃芩苷膠束可以有效的增大黃芩苷溶解性和穩(wěn)定性，并且能夠在一定程度上提高其功效性及其利用度，本研究采用的制備方法簡單，易于工藝放大，安全性較高，由于本研究開發(fā)的黃芩苷膠束所用的原輔料安全可靠，且茶皂苷具有一定的抑菌美白等功效，與黃芩苷協(xié)同可能會發(fā)揮更大的效果，可以有廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和化妝品領(lǐng)域內(nèi)的潛力。