千里光化學(xué)成分及其心肌細胞保護活性

劉 平，吳 凱，趙生文

（1.海南省司法醫(yī)院，海南 ?？?571100； 2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530000； 3.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，海南 ?？?570102）

千里光屬植物目前有一千余種，主要分布在除南極洲之外的全球各地，其中我國有63 種，主要分布在西南地區(qū)，包括千里光、歐洲千里光、北千里光等［1-2］。該屬植物具有豐富的化學(xué)結(jié)構(gòu)類型，包括倍半萜、二萜、生物堿、黃酮、揮發(fā)油等［3-6］，其中吡咯里西啶型生物堿是該屬植物造成肝腎毒性的主要毒性成分［7］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，千里光屬植物具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、保肝、舒緩平滑肌、抗氧化等活性［8-10］。

千里光為菊科千里光屬多年生草本植物千里光SenecioscandensBuch.-Ham.的干燥地上部分，味苦，性寒，歸肺、肝經(jīng)，具有清熱解毒、明目、利濕的功效，用于癰腫瘡毒、感冒發(fā)熱、目赤腫痛、泄瀉痢疾、皮膚濕疹等疾病的治療［11］，倍半萜類成分是該植物的代表性藥效成分［12-13］。為進一步尋找倍半萜類成分，豐富該屬植物的化學(xué)結(jié)構(gòu)類型，本實驗圍繞千里光進行化學(xué)成分研究。綜合運用各種色譜學(xué)和波譜學(xué)方法，從中分離得到7 個倍半萜類單體化合物，其中化合物1 為新化合物，其他化合物均首次從該植物中分離，同時體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)，化合物2～3、5 具有良好的心肌細胞保護活性。

1 材料

Bruker Avance-400 型核磁共振光譜儀（德國Bruker 公司）； SAD-M20A、LC-60AD 型高效液相色譜儀（日本島津公司）； Hpf-1722 型分析天平（美國Ohaus 公司）； RE2000A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（河南鞏義予華儀器有限公司）； 色譜柱（250 mm×10 mm，5 μm，日本YMC 公司）； MCI gel CHP 20P（75～150 μm，日本三菱公司）； Sephadex LH-20 凝膠（美國GE 公司）； ODS （ODS-A 12 nm S-50 μm，日本YMC 公司）； 硅膠（100 ～200、200 ～300 目，青島海洋化工有限公司）。氘代氯仿（0.1% TMS，寧波萃英化學(xué)技術(shù)有限公司）； 其余試劑均為分析純或色譜純。

H9c2 細胞株（中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫）； DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青霉素-鏈霉素（PS）、胰蛋白酶（美國Gibco 公司）；96 孔板、MTT （上海碧云天生物技術(shù)有限公司）； 槲皮苷、過氧化氫（上海源葉生物科技有限公司）。

千里光于2021 年6 月購自安徽亳州中藥材市場，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)吳凱鑒定為菊科千里光屬植物千里光SenecioscandensBuch.-Ham.ex D.Don 的干燥地上部分。

2 提取與分離

15.2 kg 千里光粉碎，95% 乙醇冷浸提取，減壓濃縮，得到浸膏1.5 kg，用2 L 水均勻混懸后依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取，減壓濃縮，得到石油醚部位300 g，經(jīng)100 ～200 目硅膠柱分離，以石油醚-丙酮（100 ∶0 ～0 ∶100）梯度洗脫，TLC 檢識合并，得到Fr.A～Fr.J。

Fr.D （25.7 g）經(jīng)MCI 柱分離，以75% ～100%乙醇梯度洗脫，得到Fr.D1 ～Fr.D4。Fr.D2（5.2 g）經(jīng)200 ～300 目硅膠柱分離，以石油醚-乙酸乙酯（100 ∶0～0 ∶100）梯度洗脫，TLC 檢識合并，得到Fr.D2-1～Fr.D2-7。Fr.D2-4 有晶體析出，以二氯甲烷-甲醇-水（1 ∶1 ∶0.1）重結(jié)晶，得到化合物4 （100 mg）。Fr.D2-5 （1.5 g）經(jīng)反相硅膠柱分離，以70% ～100% 甲醇梯度洗脫，得到Fr.D2-5-1～Fr.D2-5-5。Fr.D2-5-3 （720 mg）經(jīng)反相硅膠柱分離，以60% ～100%丙酮梯度洗脫，得到Fr.D2-5-3-1 ～Fr.D2-5-3-3。Fr.D2-5-3-1 （110 mg）經(jīng)半制備HPLC 純化，以70% 甲醇洗脫，得到化合物1 （tR＝23.4 min，2.4 mg）、2 （tR＝27.9 min，4.9 mg）。Fr.D2-5-3-2 （327 mg）經(jīng)半制備HPLC 純化，以60%乙腈洗脫，得到化合物3 （tR＝42.1 min，13.9 mg）、5 （tR＝44.7 min，5.4 mg）。Fr.D2-6 （2.7 g）經(jīng)Sephadex LH-20 分離，以二氯甲烷-甲醇（1 ∶1）洗脫，得到Fr.D2-6-1～D2-6-6。Fr.D2-6-3 （1.1 g）經(jīng)硅膠柱分離，得到化合物6（76.5 mg）和Fr.D2-6-3-1～Fr.D2-6-3-4。Fr.D2-6-3-2 （115 mg）經(jīng)半制備HPLC 純化，以72%甲醇洗脫，得到化合物7 （tR＝35.5 min，12.7 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

圖1 化合物1 的結(jié)構(gòu)和關(guān)鍵HMBC、1H-1H COSY 相關(guān)Fig.1 Structure and key HMBC，1H-1H COSY correlations on compound 1

1H-NMR 顯示化合物1 在低場區(qū)存在2 個存在間位耦合的芳環(huán)質(zhì)子δH7.20 （1H，d，J＝1.20 Hz，H-6），7.11 （1H，d，J＝1.20 Hz，H-8）。此外，觀察到存在1 個次甲基信號和3 組亞甲基信號δH2.93 （1H，m，H-4），2.60 （2H，m，H-1），1.88 （1H，m，H-2a），1.77 （1H，m，H-2b），1.59 （2H，m，H-3），4 組甲基信號δH2.33（3H，s，11-CH3），1.58 （6H，s，13，14-CH3），1.30 （3H，s，15-CH3）。13C-NMR 結(jié)合DEPT135譜提示化合物1 存在15 個碳原子，包括1 組芳環(huán)信號δC146.1 （C-7），142.2 （C-5），136.4 （C-9），133.9 （C-10），123.4 （C-8），122.0 （C-6），1 個連氧季碳信號δC75.6 （C-12），1 個次甲基信號δC33.2 （C-4），3 個亞甲基信號δC31.0 （C-3），27.0 （C-1），20.1 （C-2），4 個甲基信號δC31.9 （C-13 ～14），23.3 （C-15），20.1 （C-11）。以上數(shù)據(jù)提示化合物1 為倍半萜類化合物，經(jīng)檢索［14］化合物 1 與 1，2，3，4-tetrahydro-1，5-dimethyl-7-isopropylnaphthalene 存在相同的化學(xué)骨架，仔細比對提示其可能是該化合物的C-12 位羥基氧化衍生物。

HSQC 圖譜對化合物1 的碳氫數(shù)據(jù)進行的完全歸屬，1H-1H COSY 圖譜提示存在2.60 （H-1）?1.88 （H-2a）／1.77 （H-2b）?1.59 （H-3）的一組自旋耦合系統(tǒng)。在HMBC 譜中可以觀察到13-CH3、14-CH3與C-7、C-12 之間，H-6、H-8 與C-7、C-12 之間存在遠程相關(guān)關(guān)系，即化合物1 是1，2，3，4-tetrahydro-1，5-dimethyl-7-isopropylnaphthalene的氧化衍生物。由此化合物1 的平面結(jié)構(gòu)確定，進一步分析發(fā)現(xiàn)其中還存在1 個手性中心，通過與已知化合 物 6，9-dihydroxy-1-oxo-14-noreudesm-5，7，9-triene［15］比對比旋光值可以確定化合物1 的構(gòu)型為R型。至此確認化合物1 為新的倍半萜類化合物，命名為（R）-千里光萜醇。詳見表1。

表1 化合物1 的1H-NMR 和13C-NMR 數(shù)據(jù)Tab.1 1H-NMR and13C-NMR spectra data on compound 1

化合物2：淡黃色油狀液體，分子式C15H22O3，ESI-MSm／z：251.1 ［M＋H］＋。1H-NMR （400 MHz，CDCl3）δ：3.04 （1H，d，J＝11.54 Hz，H-9a），3.03 （1H，dd，J＝9.59，5.39 Hz，H-1），2.96（1H，d，J＝10.34 Hz，H-5），2.67 （1H，dd，J＝10.76，3.96 Hz，H-6a），2.65 （1H，d，J＝10.28 Hz，H-9b），2.28 （1H，m，H-6b），2.21（1H，dd，J＝14.53，10.86 Hz，H-2a），2.13（1H，dd，J＝13.09，7.69 Hz，H-3a），1.76（3H，d，J＝6.12 Hz，12-CH3），1.75 （3H，d，J＝6.12 Hz，13-CH3），1.44 （1H，dt，J＝14.42，9.16 Hz，H-2b），1.36 （3H，s，14-CH3），1.33（3H，s，15-CH3），1.09 （1H，td，J＝12.58，8.17 Hz，H-3b）；13C-NMR （100 MHz，CDCl3）δ：207.4 （ C-8），135.7 （ C-11），134.3 （ C-7），62.3 （5），60.0 （C-1），59.4 （C-4），57.4 （C-10），56.3 （C-9），34.1 （C-3），30.1 （C-6），24.4 （C-2），23.1 （C-12），21.4 （C-13），16.2（C-15），16.1 （C-6）。以上數(shù)據(jù)與文獻［16］報道基本一致，故鑒定為（1S，10S），（4S，5S）-germacrone-1 （10），4-diepoxide。

化合物3：無色油狀液體，分子式C15H22O2，ESI-MSm／z：235.2 ［M＋H］＋。1H-NMR （400 MHz，CDCl3）δ：5.76 （1H，s，H-3），5.05 （1H，d，J＝1.65 Hz，H-12），4.90 （1H，d，J＝1.68 Hz，H-12），4.09 （2H，m，H-13），2.53 （1H，m，H-5），2.20 （1H，m，H-1），2.11 （1H，m，H-1），1.90 （3H，s，14-CH3），1.55 （1H，m，H-8），1.48 （1H，m，H-9），0.88 （3H，s，15-CH3）；13C-NMR （100 MHz，CDCl3）δ：55.0 （C-1），198.2 （C-2），127.1 （C-3），163.0 （C-4），48.9 （C-5），30.4 （C-6），42.5 （C-7），27.8（C-8），41.0 （C-9），38.2 （C-10），155.3 （C-11），107.9 （C-12），65.0 （C-13），21.9 （C-14），17.1 （C-15）。以上數(shù)據(jù)與文獻［17］報道基本一致，故鑒定為12-羥基-莎草酮。

化合物4：無色油狀液體，分子式C15H22O2，ESI-MSm／z：235.1 ［M＋H］＋。1H-NMR （400 MHz，CDCl3）δ：2.74 （2H，brs，H-7），2.47 （2H，d，J＝15.47 Hz，H-10），2.40 （2H，t，J＝7.52 Hz，H-4），2.08 （3H，s，15-CH3），2.02 （3H，s，12-CH3），1.73 （3H，s，13-CH3），1.52 （2H，m，H-3），1.05 （3H，s，14-CH3），0.61 （1H，m，H-6），0.38 （1H，m，H-2）；13C-NMR （100 MHz，CDCl3）δ：208.6 （C-4），201.6 （C-8），147.3 （C-11），128.1 （C-7），48.9 （C-9），43.9（C-3），30.0 （C-15），28.0 （C-6），24.2 （C-1），24.1 （C-5），23.4 （C-2），23.4 （C-12），23.4（C-13），20.1 （C-10），19.1 （C-14）。以上數(shù)據(jù)與文獻 ［18］報道基本一致，故鑒定為urcumenone。

化合物5：黃色油狀液體，分子式C15H24O2，ESI-MSm／z：237.3 ［M＋H］＋。1H-NMR （400 MHz，CDCl3）δ：5.77 （1H，s，H-1），2.40 （2H，m，H-9），2.33 （2H，m，H-4），2.12 （3H，s，14-CH3），1.93 （1H，dd，J＝13.22，6.56 Hz，H-5a），1.74 （1H，dd，J＝13.41，5.94 Hz，H-5b），1.52 （3H，m，H-8，7a），1.38 （1H，m，H-7b），1.10 （6H，d，J＝6.86 Hz，11，12-CH3），1.06 （3H，s，15-CH3）；13C-NMR （100 MHz，CDCl3）δ：204.6 （C-1），169.7 （C-3），122.4 （C-2），44.2 （C-9），43.8 （C-6），36.2（C-7），35.5 （C-13），33.4 （C-5），30.0 （C-10），24.8 （C-4），22.1 （C-6），20.9 （C-11），20.8 （C-12），18.5 （C-8）。以上數(shù)據(jù)與文獻［19］報道基本一致，故鑒定為isopterchiayione。

化合物6：黃色油狀液體，分子式C15H22O2，ESI-MSm／z：235.1 ［M＋H］＋。1H-NMR （400 MHz，CDCl3）δ：5.49 （1H，m，H-5），3.05 （1H，dd，J＝16.75，7.32 Hz，H-6a），2.95 （1H，m，H-6b），2.91 （2H，dd，J＝13.59，4.24 Hz，H-9），2.57 （1H，m，H-10），2.50 （1H，m，H-3a），2.43 （1H，m，H-3b），2.22 （2H，m，H-2），2.12 （3H，s，14-CH3），1.97 （3H，s，13-CH3），1.77 （3H，s，12-CH3），1.04 （3H，d，J＝7.07 Hz，H-15）；13C-NMR （100 MHz，CDCl3）δ：208.4 （C-4），205.3 （C-8），143.9 （C-1），140.8 （ C-11），134.8 （ C-7），121.3 （ C-5），48.7 （C-9），42.8 （C-3），35.2 （C-10），30.4（C-14），30.1 （C-2），28.0 （C-6），22.7 （C-12），22.4 （C-13），19.3 （C-15）。以上數(shù)據(jù)與文獻［20］報道基本一致，故鑒定為curcumadione。

化合物7：無色油狀液體，分子式C15H24O2，ESI-MSm／z：237.1 ［M＋H］＋。1H-NMR （400 MHz，CDCl3）δ：5.90 （1H，s，H-6），2.83 （1H，m，H-1），2.51 （1H，m，H-3a），2.37 （1H，m，H-3b），2.33 （2H，m，H-2a，8a），2.20 （1H，m，H-11），2.18 （1H，m，H-8b），2.11 （3H，s，15-CH3），2.00 （2H，m，H-9a，10），1.60 （1H，m，H-2b），1.10 （1H，m，H-9b），1.07 （3H，d，J＝6.58 Hz，13-CH3），1.06 （3H，d，J＝6.62 Hz，12-CH3），0.80 （3H，d，J＝6.64 Hz，14-CH3）；13C-NMR （100 MHz，CDCl3）δ：208.9 （C-4），203.4 （C-5），170.2 （C-7），128.0 （C-6），52.9 （C-1），42.0 （C-3），38.1 （C-11），36.3（C-9），33.7 （C-10），29.9 （C-15，8），22.4（C-2），21.0 （C-13），20.7 （C-12），16.3 （C-14）。以上數(shù)據(jù)與文獻［21］報道基本一致，故鑒定為gibberodione。

4 心肌細胞保護活性研究

參考文獻［22］報道，將H9c2 細胞細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞生長至對數(shù)期后，PBS 緩沖溶液沖洗細胞2 次，用0.25%胰酶消化，制成細胞密度為3×103／孔的單細胞懸液，接種于96 孔板，于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h，棄去上清，將細胞分為空白組、模型組（H2O2組）、給藥組、陽性對照組，每組6 個復(fù)孔。空白組加入100 μL 完全培養(yǎng)基，模型組加入含200 μmol／L H2O2的完全培養(yǎng)基100 μL，給藥組分別加入100 μL 含200 μmol／L H2O2和50 μmol／L化合物1 ～7，陽性對照組加入50 μmol／L 槲皮苷，培養(yǎng)24 h。每孔加入MTT 溶液使其終濃度為500 μg／mL，培養(yǎng)4 h，吸去上清液，每孔加入100 μL DMSO，避光溶解10 min，于570 nm 波長處測定吸光度值。通過GraphPad 8.0 軟件進行處理，數(shù)據(jù)以（±s）表示，組間兩兩比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果表明，化合物2～3、5 的細胞存活率分別為（75.2 ± 0.54）%、（66.4 ± 0.79）%、（59.7 ±0.91）%，槲皮苷細胞存活率為（74.9±0.47）%，具有較好的心肌細胞保護活性。

5 討論

本實驗以千里光入手，從其石油醚部位分離鑒定了7 個單體化合物，經(jīng)鑒定所有化合物均為倍半萜類，其中化合物1 為新化合物，化合物2 ～7 均為首次在該藥材中分離得到，體外細胞學(xué)實驗表明，化合物2 ～3、5 具有良好的心肌細胞保護活性，是潛在的心肌保護藥物研發(fā)的先導(dǎo)化合物。以上實驗結(jié)果，進一步拓寬了千里光的研究范圍，為其綜合開發(fā)利用提供了新的思路和方向。