護肝布祖熱顆粒定性與定量質量控制方法的研究

王百才,汪依格,米梓毓,梁裕婷,瑪依熱·納麥提,卡吾薩爾·恰依馬爾旦,楊建華,2,胡君萍*

1.新疆醫(yī)科大學藥學院，烏魯木齊 830054；2.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，烏魯木齊 830054

護肝布祖熱顆粒是由菊苣根、菊苣子、芹菜根、芹菜子、小茴香、茴香根皮以及菟絲子7 味藥材加工制成，具有補益肝胃、散氣止痛、利膽利水的功效［1］，臨床上用于治療急慢性乙型肝炎、黃疸性肝炎、急慢性膽囊炎、膽管炎、急慢性胃炎及泌尿系統(tǒng)感染等疾?。?］。維吾爾醫(yī)認為菊苣藥性濕寒味苦，有清肝利膽、健胃消食、利尿消腫的作用；芹菜藥性干熱，能消除寒濕閉阻、消食健胃、消腫散氣、消石止痛；小茴香藥性干熱，有祛散寒氣、溫腎暖胃、通水利濕、消腫止痛的作用；菟絲子藥性干熱，有通阻止痛的作用［3］。現(xiàn)代藥理學研究表明，護肝布祖熱顆粒能抑制活性氧的產生，抑制應激活化蛋白激酶活性而減輕小鼠免疫性肝損傷［4］；其通過抑制炎癥和抑制肝細胞凋亡對酒精致小鼠急性肝損傷發(fā)揮保護作用［5］；并能夠減輕CCl4所致大鼠肝細胞變性、壞死及肝組織損傷，逆轉大鼠肝纖維化［6］。此外，護肝布祖熱顆粒通過抗氧化應激、抑制組織細胞凋亡、降低血清中炎癥因子的水平保護小鼠急性腎損傷等［7］。

作為維吾爾醫(yī)保肝護肝經典制劑，護肝布祖熱顆?，F(xiàn)行的質量標準較簡單，部頒標準中記載有處方、制法、性狀、鑒別（三氯化鐵反應和熒光觀察）、檢查、功能與主治、用法與用量、規(guī)格、貯藏等項目［1］，缺少用現(xiàn)代色譜學方法對制劑中藥材進行定性鑒別和有效成分含量測定的質量控制手段，難以有效保證制劑質量的穩(wěn)定性和臨床用藥的安全性。因此，本研究分別建立了處方中各藥材的薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）鑒別方法，并用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）對其特征成分秦皮乙素進行了含量測定，以提高護肝布祖熱顆粒制劑質量，為加強藥品質量控制和提高臨床療效提供技術支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20A 型高效液相色譜儀、 230 V 光電二極管陣列紫外可見光檢測器（SPD-M220A），均購自成都島津儀器設備有限公司；AB135-S 電子分析天平（梅特勒-托利多測量技術有限公司）；KQ5200DE 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ZF-2 型三用紫外儀（上海市安亭電子儀器廠）；LDP-500A 型高速多功能搖擺粉碎機（浙江永康市紅太陽機電有限公司）；T200Y 電子秤（常熟市雙杰測試儀器廠）；N-1001 旋轉蒸發(fā)儀（上海愛朗有限公司）；DKT-B 型電熱套和SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，均購自鄭州長城科工貿有限公司。

1.2 試藥

菊苣根（批號JJZ-YP-191209）、菊苣子（批號JJZ-YP-200527）均購自新疆和田維吾爾藥材市場；芹菜根（批號Z30131002）、芹菜子（批號Z30142203）均購自新疆麥迪森維藥有限公司飲片廠；小茴香（批號XHX-YP-170803，新疆恩薩爾維吾爾醫(yī)飲片有限公司）；茴香根皮（批號HXGP-YP-210115，新疆維吾爾醫(yī)院）；菟絲子（批號910023，新疆本草堂有限公司）；護肝布祖熱顆粒（批號200568，新疆維吾爾藥業(yè)有限責任公司）；秦皮乙素對照品（批號1025A023，北京索萊寶科技有限公司）；金絲桃苷對照品（批號09012021，上海同田生物技術公司）；芹菜素（批號WG20190312，西安綠騰生物科技有限公司）；東莨菪素對照品（批號21022308，上海純優(yōu)科技生物有限公司）；硅膠G 板（批號20141012）、高效硅膠G 板（批號20151014）均購自青島海洋化工廠分廠；薄層色譜用甲醇、二氯甲烷、石油醚、甲酸、冰乙酸、乙酸乙酯、正丁醇、三氯甲烷、三氯化鋁、磷酸均為分析純，購自天津市致遠化學試劑有限公司；甲醇為色譜純，購自費希爾控制設備國際有限公司；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 TLC 法鑒別護肝布祖熱顆粒中的藥材

2.1.1 菊苣根和菊苣子的鑒別

2.1.1.1 秦皮乙素對照品溶液的配制 精密稱取秦皮乙素對照品1.0 mg，加甲醇溶解，制成每1 mL含秦皮乙素0.2 mg 的對照品溶液。

2.1.1.2 供試品溶液的配制 稱取護肝布祖熱顆粒12.0 g，加甲醇100 mL 超聲提取30 min，過濾后濃縮至2 mL，即得護肝布祖熱顆粒供試品溶液。

2.1.1.3 對照藥材溶液和缺方陰性對照溶液的配制 按照護肝布祖熱顆粒的處方比例，稱取菊苣根2.0 g 和菊苣子4.0 g，加100 mL 甲醇超聲提取30 min，過濾后濃縮至2 mL，即得對照藥材溶液。按照該處方比例，稱取芹菜根4.0 g、芹菜子2.0 g、小茴香2.0 g、茴香根皮4.0 g、菟絲子1.0 g，按照2.1.1.2 項下供試品溶液制備方法制備缺方陰性對照溶液。

2.1.1.4 TLC 色譜條件與結果 分別吸取缺方陰性對照溶液、秦皮乙素對照品溶液、供試品溶液和菊苣對照藥材溶液各5 μL，點于硅膠G 板上，以二氯甲烷-甲醇-甲酸（10∶0.3∶0.3）為展開劑展開，取出晾干，置于紫外光燈下檢視。供試品溶液色譜在與秦皮乙素對照品色譜相應的位置上顯示相同的藍色熒光斑點，Rf 值為0.42；對照藥材色譜在與對照品色譜相應位置顯示相同顏色熒光斑點；缺方陰性樣品色譜在與對照品色譜相應位置無干擾，表明該方法專屬性良好。結果見圖1。

圖1 菊苣根和菊苣子的TLC 圖Fig.1 TLC chromatogram of Cichorium intybus radix and semen

2.1.2 小茴香和茴香根皮的鑒別

2.1.2.1 東莨菪素對照品溶液的配制 精密稱取東莨菪素對照品1.0 mg，加乙酸乙酯溶解，制成每1 mL 含東莨菪素0.2 mg 的對照品溶液。

2.1.2.2 供試品溶液的配制 稱取護肝布祖熱顆粒12.0 g，加100 mL 水超聲提取30 min，提取液過濾，加乙酸乙酯萃取，將乙酸乙酯層濃縮至2 mL，即得護肝布祖熱顆粒供試品溶液。

2.1.2.3 對照藥材溶液和缺方陰性對照溶液的配制 按照護肝布祖熱顆粒的處方比例，稱取小茴香2.0 g、茴香根皮4.0 g，加100 mL 水超聲提取30 min，過濾，加等量乙酸乙酯萃取3 次，合并乙酸乙酯層溶液并濃縮至2 mL，即得對照藥材溶液。按照該處方比例，稱取芹菜根4.0 g、芹菜子2.0 g、菟絲子1.0 g、菊苣根2.0 g、菊苣子4.0 g，按照2.1.2.2 項下供試品溶液制備方法制備缺方陰性對照溶液。

2.1.2.4 TLC 色譜條件與結果 分別吸取東莨菪素對照品溶液、小茴香對照藥材溶液、缺方陰性對照溶液和供試品溶液各5 μL，點于高效硅膠G 板上，以石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯（1∶4）為展開劑展開，取出，晾干，置于紫外光燈下檢視。供試品溶液色譜在與東莨菪素對照品色譜相應的位置上顯示相同的藍色熒光斑點，Rf 值為0.63；對照藥材色譜在與對照品色譜相應位置顯示相同顏色熒光斑點；缺方陰性樣品色譜在與對照品色譜相應位置無干擾，表明該方法的專屬性良好。結果見圖2。

圖2 小茴香和茴香根皮的TLC 圖Fig.2 TLC chromatogram of Foeniculum vulgare cortex and fructus

2.1.3 芹菜根和芹菜子的鑒別

2.1.3.1 芹菜素對照品溶液的配制 精密稱取芹菜素對照品1.0 mg，加甲醇溶解，制成每1 mL 含芹菜素0.2 mg 的對照品溶液。

2.1.3.2 供試品溶液的配制 稱取護肝布祖熱顆粒12.0 g，加甲醇100 mL 超聲提取30 min，過濾濃縮至2 mL，即得護肝布祖熱供試品溶液。

2.1.3.3 對照藥材溶液和缺方陰性對照溶液的配制 按照護肝布祖熱顆粒的處方比例，稱取芹菜子2.0 g、芹菜根4.0 g，加100 mL 甲醇超聲提取30 min，過濾，將濾液濃縮至2 mL，即得對照藥材溶液。按照該處方比例，稱取菟絲子1.0 g，小茴香2.0 g、茴香根皮4.0 g、菊苣根2.0 g、菊苣子4.0 g，按照2.1.3.2 項下供試品溶液制備方法制備缺方陰性對照溶液。

2.1.3.4 TLC 色譜條件與結果 分別吸取芹菜素對照品溶液、芹菜對照藥材溶液、缺方陰性對照溶液和供試品溶液各5 μL，點于高效硅膠G 板上，以石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯-乙酸（12∶10∶1）為展開劑展開，取出晾干，噴以30 g·L-1AlCl3乙醇溶液顯色，置于紫外光燈下檢視。供試品溶液色譜在與芹菜素對照品色譜相應的位置上顯示相同的藍色熒光斑點，Rf 值為0.50；對照藥材色譜在與對照品色譜相應位置顯示相同顏色熒光斑點；缺方陰性樣品色譜在與對照品色譜相應位置無干擾，表明該方法的專屬性良好。結果見圖3。

圖3 芹菜根和芹菜子的TLC 圖Fig.3 TLC chromatogram of Apium graveolens radix and semen

2.1.4 菟絲子的TLC 鑒別

2.1.4.1 金絲桃苷對照品溶液的配制 精密稱取金絲桃苷對照品1.0 mg，加甲醇溶解，制成每1 mL含金絲桃苷0.2 mg 的對照品溶液。

2.1.4.2 供試品溶液的配制 稱取護肝布祖熱顆粒12.0 g，加水100 mL 超聲提取30 min，過濾濃縮至10 mL，加等量正丁醇萃取3 次，合并正丁醇層濃縮蒸干，加甲醇2 mL 溶解，即得護肝布祖熱供試品溶液。

2.1.4.3 對照藥材溶液和缺方陰性對照溶液的配制 稱取菟絲子2.0 g，加水100 mL 超聲提取30 min，過濾，濃縮至10 mL，用等量正丁醇萃取3 次，合并正丁醇層濃縮蒸干，加甲醇2 mL 溶解，即得對照藥材溶液。按照護肝布祖熱顆粒的處方比例，稱取芹菜根4.0 g、芹菜子2.0 g、小茴香2.0 g、茴香根皮4.0 g、菊苣根2.0 g、菊苣子4.0 g，按照2.1.4.2 項下供試品溶液制備方法制備缺方陰性對照溶液。

2.1.4.4 TLC 色譜條件與結果 分別吸取金絲桃苷對照品溶液、菟絲子對照藥材溶液、缺方陰性對照溶液和供試品溶液各5 μL，點于高效硅膠G 板上，以乙酸乙酯-丙酮-乙酸-水（5∶3∶1∶1）為展開劑展開，取出晾干，30 g·L-1AlCl3乙醇溶液顯色，置于紫外光燈下檢視。供試品溶液色譜在與金絲桃苷對照品色譜相應的位置上顯示相同的藍色熒光斑點，Rf 值為0.42；對照藥材色譜在與對照品色譜相應位置顯示相同顏色熒光斑點；缺方陰性樣品色譜在與對照品色譜相應位置無干擾，表明該方法的專屬性良好。結果見圖4。

圖4 菟絲子的TLC 圖Fig.4 TLC chromatogram of Cuscuta chinensis semen

2.2 HPLC 法測定護肝布祖熱顆粒中秦皮乙素的含量

2.2.1 供試品溶液的制備 精密稱取護肝布祖熱顆粒12.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇溶液50 mL，超聲處理30 min，上清液過0.22 μm 微孔濾膜，即得。

2.2.2 對照品溶液及缺方陰性對照溶液的配制 精密稱取秦皮乙素對照品 5.0 mg，加甲醇定容于5 mL量瓶中，精密吸取0.2 mL 置于50 mL 量瓶中，并用甲醇稀釋定容，過0.22 μm 微孔濾膜得到質量濃度為4 μg·mL-1的秦皮乙素對照品溶液。按照護肝布祖熱顆粒處方比例，除去菊苣根和菊苣子，稱取剩余各味藥材芹菜根4.0 g、芹菜子2.0 g、小茴香2.0 g、茴香根皮4.0 g、菟絲子1.0 g，加入甲醇50 mL，超聲30 min，提取液過0.22 μm 微孔濾膜，即得缺方陰性對照溶液。

2.2.3 色譜條件 色譜柱為SunFire C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫為30 ℃；流速為1 mL·min-1；進樣體積為10 μL；檢測波長為349 nm；流動相為甲醇（A）-1 mL·L-1磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～2 min，5% A；2～5 min，5%～27% A；5～30 min，27% A）。

2.2.4 系統(tǒng)適用性實驗 分別取上述供試品溶液、秦皮乙素對照品溶液和缺方陰性溶液適量，按照2.2.3 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果顯示，秦皮乙素色譜峰峰形好，tR=15.8 min，且與鄰近色譜峰的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)不低于5 000，缺方陰性樣品溶液對秦皮乙素的測定無干擾。色譜圖見圖5。

圖5 各樣品HPLC 色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of samples

2.2.5 線性關系考察 取2.2.2 項下秦皮乙素對照品溶液適量，分別取樣0.2、0.5、1.0、2.0、2.5、5.0 mL，用甲醇定容至5 mL 量瓶中，過0.22 μm 微孔濾膜，按照2.2.3 項下色譜條件進樣，進樣體積為10 μL，記錄峰面積，以對照品質量濃度為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y），計算回歸方程為y=57 382x-2 594.3（r2=0.999 7）。結果顯示，秦皮乙素質量濃度在0.16～4.00 μg·mL-1范圍內與其峰面積呈良好的線性關系。

2.2.6 精密度考察 取2.2.2 項下秦皮乙素對照品溶液適量，按照2.2.3 項下色譜條件，于1 d 內連續(xù)進樣6 次，進樣體積為10 μL，記錄峰面積，結果顯示，秦皮乙素峰面積的RSD 值為0.19 %，表明儀器的日內精密度良好。

2.2.7 重復性實驗 精密稱取同一批次護肝布祖熱顆粒（批號200568）6 份，各12.00 g，按照2.2.1 項下方法平行制備6 份供試品溶液，按照2.2.3 項下色譜條件進樣，進樣體積為10 μL，記錄峰面積，代入線性回歸方程計算秦皮乙素的含量及其RSD 值。結果顯示，含量的RSD 值為1.43%，表明供試品溶液制備方法的重復性良好。

2.2.8 穩(wěn)定性實驗 精密稱取護肝布祖熱顆粒（批號200568）12.00 g，按照2.2.1 項下方法制備供試品溶液，按照2.2.3 項下色譜條件于0、2、4、8、12、24 h分別進樣，進樣體積為10 μL，記錄峰面積。結果顯示，秦皮乙素峰面積的 RSD 值為1.03%，表明供試品溶液在室溫下24 h 內穩(wěn)定性良好。

2.2.9 加樣回收率實驗 精密稱取同一批次護肝布祖熱顆粒（批號200568）9 份，各12.00 g，分別加入低、中、高質量濃度的秦皮乙素對照品溶液，按照2.2.1 項下方法制備供試品溶液。進樣體積為10 μL，記錄峰面積，計算加樣回收率。加樣回收率（%）=［（測得量-樣品含量）/加入量］×100%。結果顯示，秦皮乙素的平均加樣回收率為97.71%，平均RSD 值為0.83%，表明該方法準確可靠。結果見表1。

表1 秦皮乙素的加樣回收率結果Tab.1 Results of recovery of esculetin

2.2.10 護肝布祖熱顆粒樣品的含量測定 精密稱取護肝布祖熱顆粒（批號200568）6 份，各12.00 g，按照2.2.1 項下方法制備供試品溶液。按照2.2.3 項下色譜條件進樣，記錄秦皮乙素色譜峰面積，計算含量。結果見表2。

表2 護肝布祖熱顆粒的含量測定結果Tab.2 The results of content determination of Hugan Buzure Granules

3 討論

護肝布祖熱顆粒是由菊苣根、菊苣子、芹菜根、芹菜子、小茴香、茴香根皮和菟絲子7 味藥材經水煎提取制成的顆粒劑。該處方中存在同一植物不同藥用部位的2 種藥材配伍使用的情況，如菊苣根和菊苣子、芹菜根和芹菜子、小茴香和茴香根皮，這是民族藥復方配伍中的特殊現(xiàn)象，具體機制尚不明確。在研究質量控制方法時，考慮到來源于同一植物不同藥用部位的2 種藥材含有相同的化學成分，因此制備對照藥材溶液和缺方陰性對照藥材溶液時分別將二者合并提取或一起剔除。

護肝布祖熱顆粒適用于肝寒、胃痛、脾阻脅痛及關節(jié)骨痛、風濕病、泌尿系統(tǒng)疾病的治療。方中菊苣根和菊苣子具有保肝、降血糖、調節(jié)血脂、抗菌、抗氧化和抗炎等藥理作用，菊苣中具有保肝活性的特征成分主要為倍半萜類（如山萵苣素、山萵苣苦素）和香豆素類（如秦皮乙素、秦皮甲素）等［8-10］；小茴香具有調節(jié)胃腸功能、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗肝腎毒性、降血脂、降血糖、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等作用，其主要成分為揮發(fā)油類（如反式茴香腦、茴香醛、茴香醚等）［11-12］；芹菜根和芹菜子具有抗腫瘤、降低血清尿酸、抗炎、抗痙攣、抗細菌感染、治療皮膚疾病、抗腫瘤侵襲和轉移、保護肝功能、預防骨質疏松等作用，其主要成分為芹菜素、肉桂醛、柚皮素等［13-16］；菟絲子具有降血糖、抗衰老、抗骨質疏松等作用，其成分主要為黃酮類化合物如金絲桃苷、山柰酚、槲皮素等［17］。上述這些成分均可以考慮作為質量控制的指標性成分，但在實驗過程中發(fā)現(xiàn)有些成分用TLC 法檢測不能得到很好的分離，專屬性較差，如山柰酚、槲皮素、茴香醛等；而有些成分未檢出，如小茴香中的特征性成分反式茴香腦，這可能與護肝布祖熱顆粒組方復雜、用煎煮法提取后發(fā)生了化學成分的變化或揮發(fā)性成分的損失有關［18-20］。

定性鑒別的目的是分析制劑中各單味藥材的真?zhèn)魏痛嬖谂c否，常用的方法有顯微鑒別、一般理化鑒別、光譜鑒別等，其中薄層鑒別具有分離和鑒定的雙重作用，特別適合中藥組分復雜的情況，是中藥鑒別的首選方法，本文探索了用秦皮乙素、東莨菪素、芹菜素、金絲桃苷4 個成分定性鑒別護肝布祖熱顆粒中的各藥材，填補了原標準中TLC 鑒別項的空白。HPLC 是中藥復方定量分析的常用方法，具有分離效果好、檢測靈敏等特點，本文建立了方中秦皮乙素HPLC 含量測定方法，雖然復方制劑單一成分定量不能客觀反映其整體療效，但結合TLC 定性鑒別能初步控制制劑質量。本研究對完善和提高護肝布祖熱顆粒質量標準、提高該制劑質量控制手段和臨床療效做了有益嘗試，今后還需要對多組分含量測定方法進行深入研究。