基于NLRP3信號通路探討三痹湯對佐劑型關(guān)節(jié)炎大鼠的治療作用及機(jī)制探討

姚舒婷，張春芳，周晶

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.廈門大學(xué)附屬翔安醫(yī)院，福建 廈門 361000）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種全身性的炎癥性關(guān)節(jié)炎，其特征是進(jìn)行性軟骨和骨質(zhì)破壞以及自身抗體的產(chǎn)生，以滑膜增生、關(guān)節(jié)軟骨破壞及關(guān)節(jié)畸形為主要病理改變［1］。RA患者活動(dòng)受限，甚至導(dǎo)致殘疾，需要承受巨大的經(jīng)濟(jì)和心理壓力。RA全球患病率約為1%，我國患病率約為0.28%～0.40%，其中患病男女比例為1∶3，尤其是45～54歲的女性尤為高發(fā)［2］。研究表明，RA的發(fā)病與多種因素密切相關(guān)，當(dāng)疾病發(fā)生后，自身免疫系統(tǒng)啟動(dòng)，分泌大量的炎性因子，從而引發(fā)“炎性風(fēng)暴”，造成骨破壞，若病情得不到控制，最終導(dǎo)致患者關(guān)節(jié)畸形或功能喪失［3］。西醫(yī)主要依靠藥物治療，一經(jīng)確診就需終身服藥，且部分患者由于不良反應(yīng)、過敏等，難以堅(jiān)持用藥［4］。三痹湯首載于《婦人大全良方》，具有祛風(fēng)濕、強(qiáng)筋骨、補(bǔ)肝腎的功效，常用于痹癥的治療［5］。藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在抗炎止痛、保護(hù)骨組織、提高免疫力等方面，三痹湯所含有效成分具有良好的效果［6］。課題組前期研究表明，三痹湯能夠有效降低血清中TNF-α、IL-8、IL-17、IL-1、IL-6和MCP-1的含量，抑制MMP-3、明膠酶-B表達(dá)水平，調(diào)控TLR4/MAPKs/NF-κB信號通路，并可提高IL-10、TGF-β的表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)，改善骨質(zhì)破壞［7］。NLRP3炎性體（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）在RA的發(fā)生中起關(guān)鍵作用，NLRP3炎性體蛋白的突變可引起RA患者NLRP3炎性體的活性增強(qiáng)，在RA患者細(xì)胞和滑膜中可觀察到NLRP3 mRNA和NLRP3-炎性體相關(guān)蛋白和基因的高水平表達(dá)，通過激活Caspase-1，從而使IL-1β和IL-18表達(dá)升高，引起骨破壞及關(guān)節(jié)組織損傷［8］。為了進(jìn)一步觀察三痹湯治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制，本研究通過復(fù)制佐劑型關(guān)節(jié)炎大鼠模型，以NLRP3信號通路為切入點(diǎn)，探討三痹湯對佐劑型關(guān)節(jié)炎（adjuvant arthritis，AA）模型大鼠滑膜損傷的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級Wistar雄性大鼠60只，體質(zhì)量（160±200） g，購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司。許可證號：SCXK（遼）F20220531051，相對濕度為40%～70%，大鼠在正常室溫下于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院動(dòng)物房適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，飲水、飲食、活動(dòng)自由，所有操作均符合動(dòng)物倫理學(xué)要求。

1.2 藥物與試劑

三痹湯組方：川續(xù)斷30 g，杜仲30 g，防風(fēng)30 g，肉桂30 g，細(xì)辛30 g，人參30 g，白茯苓30 g，當(dāng)歸30 g，白芍30 g，黃芪30 g，川牛膝30 g，甘草30 g，秦艽5 g，生地黃5 g，川芎5 g，川獨(dú)活15 g，均購于黑龍江省藥材公司。

三痹湯藥液的制備：三痹湯遵循原方比例，將方中所有生藥加3倍水浸泡1 h，大火煮沸后小火煎煮1 h，紗布過濾，收集藥液。再加2倍水煮沸后煎煮1 h，收集藥液。將兩次藥液混合在一起，濃縮至3.52 g/mL，加蒸餾水配制成三痹湯混懸液，濃度為20%，冷藏儲存?zhèn)溆谩?/p>

來氟米特混懸液的制備：將來氟米特片（福建匯天生物藥業(yè)有限公司，批號：20061229）研磨成粉，用純水配成1.8 mg/kg的來氟米特混懸液，冷藏儲存?zhèn)溆谩?/p>

試劑：注射用完全弗式佐劑（美國Sigma公司，貨號：F5881）；IL-1β、IL-18試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號：G3013）；4%多聚甲醛（江蘇艾迪生生物科技有限公司，批號：B0010）；PBS溶液（0.01M）（江蘇艾迪生生物科技有限公司，批號：B0002）；10×EDTA修復(fù)液（江蘇艾迪生生物科技有限公司，批號：B0015）；蘇木素染液（江蘇艾迪生生物科技有限公司，批號：B1001）；三氯甲烷（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：10006818）；Anti-NLRP3 antibody（武漢菲恩生物科技有限公司，批號：20221110）；Anti-Caspase-1 antibody（武漢菲恩生物科技有限公司，批號：20221110）；異丙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：80109218）；無水乙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：10009218）；HyPure TMMolecular Biology Grade Water（吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)，批號：GNM14002）；SweScript RT I First Strand cDNA Synthesis Kit（Servicebio，批號：G3330）；HieffTM qPCR SYBR?Green Master Mix （No Rox Plus） 11201ES（Shanghai Yeasen BioTechnologies，批號：11201ES03）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

足容積測量儀（自制）；勻漿儀（Servicebio，型號：KZ-Ⅲ-FP）；臺式高速冷凍型微量離心機(jī)（DragonLab，型號：D3024R）；超凈工作臺（蘇凈安泰，型號：SW-CJ-1FD）；超微量分光光度計(jì)（Thermo，型號：NanoDrop2000）；標(biāo)準(zhǔn)試劑型純水儀（青島富勒姆科技有限公司，型號：FBZ2001-up-p）；離心管（Biosharp）；TIP頭（Biosharp）；酶標(biāo)分析儀（Rayto RT-6100）；熒光定量PCR儀（酷搏科技，Quantagene q225熒光定量PCR檢測系統(tǒng)）；普通光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS，型號：CX-21）；倒置顯微鏡（OLYMPUS，型號：Ⅸ51）；成像系統(tǒng)（Q-IMAGING，型號：MicroPublisher）；離心管、TIP頭均購濕熱滅菌40 min，干燥。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及造模

60只大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)選取10只作為空白組（Control），剩余50只大鼠制備佐劑型誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠模型。常規(guī)消毒后將其右后肢拉直，用1 mL 注射器針頭于足跖中部皮內(nèi)注射，每只大鼠注射0.1 mL弗氏完全佐劑，每日觀察大鼠右后肢發(fā)炎腫脹情況和其他體征表現(xiàn)，若右后肢出現(xiàn)明顯的發(fā)炎紅腫和活動(dòng)受限情況，且AI評分 ≥ 6分表明大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型誘導(dǎo)成功。造模后第7天所有AA大鼠AI評分 ≥6分，提示模型誘導(dǎo)成功。將造模成功的50只大鼠隨機(jī)分為模型組（Model）、來氟米特組（LeF）和三痹湯高劑量組（SBT-H）、三痹湯中劑量組（SBT-M）、三痹湯低劑量組（SBT-L），每組10只。

2.2 給藥方法

造模后第8天開始給藥，連續(xù)給藥3周，按大鼠與人的體表面積計(jì)算出相應(yīng)的用藥劑量，三痹湯高劑量組灌服三痹湯7.35 g/kg；三痹湯中劑量組灌服三痹湯3.67 g/kg；三痹湯低劑量組灌服三痹湯1.83 g/kg，來氟米特組灌服來氟米特混懸液1.8 mg/kg；模型組和空白組灌服相同體積的蒸餾水，連續(xù)灌胃21 d，每日1次，至免疫后28 d處死大鼠。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 關(guān)節(jié)腫脹程度

在免疫前及免疫后，每周用自制足容積測量儀測量各組大鼠右后足容積，以足容積變化情況觀察足腫脹程度。

2.3.2 關(guān)節(jié)炎指數(shù)

在造模前，后續(xù)每隔7 d各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度并對其進(jìn)行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分（AI），根據(jù)大鼠四肢紅腫程度評為1～4分。0分，無腫脹；1分，單一趾關(guān)節(jié)紅斑或輕微腫脹；2分，兩個(gè)及兩個(gè)以上趾關(guān)節(jié)出現(xiàn)中度紅腫現(xiàn)象；3分，整個(gè)足爪包括趾跖關(guān)節(jié)在內(nèi)都嚴(yán)重發(fā)炎紅腫；4分，整個(gè)踝關(guān)節(jié)嚴(yán)重腫脹甚至變形。大鼠四肢關(guān)節(jié)所得的評分相加，即為關(guān)節(jié)炎指數(shù)，AI ＞ 6分即可認(rèn)為大鼠炎癥明顯，造模成功。

2.3.3 滑膜組織標(biāo)本采集及HE病理學(xué)觀察

取大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織，置于4%多聚甲醛中固定，乙醇逐級脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。進(jìn)行組織切片（2～4 μm），HE常規(guī)染色。組織切片進(jìn)行脫蠟，采用體積分?jǐn)?shù)100%、90%、75%乙醇梯度脫水，滴加蘇木素染色5 min，沖洗3 s，滴加1%鹽酸乙醇分化，沖洗，滴加0.5%伊紅染色液3 min，沖洗，采用體積分?jǐn)?shù)75%、90%、100%乙醇脫水，滴加松節(jié)油透明，中性樹膠封片。光鏡下觀察踝關(guān)節(jié)滑膜組織形態(tài)學(xué)病理改變。

2.3.4 血液樣本采集及血清炎性指標(biāo)檢測

末次給藥后禁食24 h，腹主動(dòng)脈取血，3 000 r/min離心10 min，分離血清，采用ELISA檢測試劑盒測定血清IL-1β、IL-18。檢測步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.3.5 PCR法檢測各組大鼠滑膜組織中NLRP3 mRNA表達(dá)水平

2.3.5.1 總RNA抽提

①取勻漿管，置冰上預(yù)冷，加入1 mL的Trizol Reagent，研磨中至無可見沉淀。②12 000 r/min離心10 min取上清。③加入250 μL三氯甲烷，顛倒離心管30 s，充分混勻，靜置5 min。④4 ℃ 下12 000 r/min離心15 min。⑤將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入0.8倍體積的異丙醇，顛倒混勻。⑥-20 ℃放置20 min。⑦4 ℃下12 000 r/min離心10 min，管底的白色沉淀即為RNA。⑧重復(fù)洗滌一次。⑨加入10 μL無RNA酶的水溶解RNA。⑩55 ℃孵育5 min。

2.3.5.2 反轉(zhuǎn)錄

反轉(zhuǎn)錄體系：5×Reaction Buffer 4 μL；Oligo（dT）18Primer（50 μm）1 μL；Servicebio?RT Enzyme Mix 1 μL；RNase free water 12 μL；mRNA 2 μL。

2.3.5.3 逆轉(zhuǎn)錄程序設(shè)置

輕輕混勻并離心，于PCR儀上進(jìn)行，程序設(shè)置見表1。

表1 PCR儀程序設(shè)置

2.3.5.4 定量PCR

取0.2 mL PCR管，配制反應(yīng)體系：2×SYBR Gree qPCR Master Mix 5 μL；Forward Primer 0.2 μL；Reverse Primer 0.2 μL；Nuclease-Free Water 2.6 μL；cDNA 2 μL。每個(gè)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制3管。PCR擴(kuò)增程序設(shè)置見表2。引物序列表見表3。按照ΔΔCT法計(jì)算。

表2 PCR儀擴(kuò)增程序設(shè)置

表3 引物序列

A=CT（目的基因，待測樣本）-CT（內(nèi)標(biāo)基因，待測樣本）

B=CT（目的基因，對照樣本）-CT（內(nèi)標(biāo)基因，對照樣本）

K=A-B

表達(dá)倍數(shù)=2-K

2.3.6 免疫組化法檢測大鼠滑膜組織中NLRP3、Caspase-1 蛋白表達(dá)

取大鼠踝關(guān)節(jié)，消毒，取出所需軟骨和滑膜組織，固定，石蠟包埋切片，貼片。免疫組化染色，石蠟切片脫蠟和水化，自來水沖洗2次，PBS洗5 min×3次；修復(fù)，3%的過氧化氫孵育15 min；加一抗，37 ℃復(fù)蘇35 min，PBS洗5 min×3次；加二抗，37 ℃孵育30 min，PBS洗5 min×3次；加三抗，37 ℃孵育30 min；PBS洗5 min×3次；DAB顯色8 min，鏡下觀察，蘇木素復(fù)染，室溫，60 s，自來水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示；對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布且方差齊性的資料采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD法；不符合正態(tài)分布且方差不齊的資料采用非參數(shù)檢驗(yàn)，以P＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠一般狀態(tài)

造模前，各組大鼠毛色柔順，攝食飲水正常，活動(dòng)靈敏，反應(yīng)靈活，二便正常，四肢爪甲呈現(xiàn)淡紅色，精神狀態(tài)良好，活潑好動(dòng)；造模后，除空白組外，AA大鼠右側(cè)足爪紅腫加重，活動(dòng)明顯受限，毛色暗淡，攝食飲水減少，便溏，反應(yīng)遲鈍。見圖1。

圖1 各組大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束足腫脹度的情況

3.2 各組大鼠足容積情況比較

與空白組比較，模型組大鼠在第7～28天足容積顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；與模型組比較，三痹湯高、中、低劑量組和來氟米特組在第7～28天足容積顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；與三痹湯高劑量組比較，三痹湯中劑量在第14～28天足容積升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），三痹湯低劑量在第7～28天足容積升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；與來氟米特組比較，三痹湯中劑量在第14～28天足容積升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），三痹湯低劑量在第7～28天足容積升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），三痹湯高劑量與來氟米特組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。見表4。

表4 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)足容積比較（±s，mL）

表4 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)足容積比較（±s，mL）

注：與空白組比較，*P ＜ 0.05；與模型組比較，^P ＜ 0.05；與三痹湯高劑量組比較，aP ＜ 0.05；與來氟米特組比較，bP ＜ 0.05。

第28天2.06±0.09 2.54±0.13*1.91±0.03^2.01±0.09^ab 2.25±0.15^ab 1.83±0.06^組別空白組模型組三痹湯高劑量組三痹湯中劑量組三痹湯低劑量組來氟米特組n 10 10 10 10 10 10第1天1.80±0.09 2.20±0.12 2.26±0.11 2.11±0.07 2.13±0.09 2.10±0.08第7天1.86±0.08 2.88±0.10*2.56±0.14^2.48±0.12^2.62±0.05^ab 2.35±0.14^第14天1.94±0.09 2.80±0.18*2.27±0.18^2.34±0.15^ab 2.56±0.06^ab 2.23±0.16^第21天2.01±0.10 2.80±0.16*2.05±0.09^2.19±0.17^ab 2.45±0.15^ab 1.99±0.09^

3.3 各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)比較

與模型組比較，三痹湯高、中、低劑量組和來氟米特組在第7～28天關(guān)節(jié)炎指數(shù)均有下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；與三痹湯高劑量組比較，三痹湯中劑量在第14～28天關(guān)節(jié)炎指數(shù)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），三痹湯低劑量在第7～28天關(guān)節(jié)炎指數(shù)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；與來氟米特組比較，三痹湯中、低劑量在第7～28天關(guān)節(jié)炎指數(shù)均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），三痹湯高劑量組在第7～28天關(guān)節(jié)炎指數(shù)變化情況無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。見表5。

表5 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)關(guān)節(jié)炎指數(shù)比較（±s，分）

表5 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)關(guān)節(jié)炎指數(shù)比較（±s，分）

注：與模型組比較，^P ＜ 0.05；與三痹湯高劑量組比較，aP ＜ 0.05；與來氟米特組比較，bP ＜ 0.05。

第28天8.50±0.52 6.10±0.45^6.70±0.48^ab 7.25±0.35^ab 5.75±0.54^組別模型組三痹湯高劑量組三痹湯中劑量組三痹湯低劑量組來氟米特組n 10 10 10 10 10第0天7.50±0.53 7.15±0.85 7.05±0.74 7.25±0.64 7.35±0.48第7天9.20±0.42 7.90±0.73^8.46±0.41^b 8.65±0.42^ab 7.75±0.88^第14天8.95±0.49 7.70±0.58^7.90±0.45^ab 8.00±0.40^ab 6.85±0.67^第21天8.70±0.42 6.73±0.63^7.25±0.54^ab 7.80±0.33^ab 6.45±0.55^

3.4 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理形態(tài)比較

大鼠踝關(guān)節(jié)HE染色結(jié)果顯示：空白組大鼠的踝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)比較完整，未見異常的滑膜增生，滑膜細(xì)胞排列均勻規(guī)整，未見炎性細(xì)胞的浸潤，沒有軟骨破壞和新生血管；模型組大鼠可見滑膜組織出現(xiàn)異常增生，細(xì)胞排列雜亂，可見明顯的炎性細(xì)胞浸潤，并且部分滑膜組織侵入軟骨，出現(xiàn)新生血管的形成；三痹湯低劑量組大鼠踝關(guān)節(jié)組織細(xì)胞排列紊亂，可見滑膜細(xì)胞增生，炎性細(xì)胞浸潤，血管翳形成，以及壞死的軟骨；三痹湯高、中劑量組和來氟米特組均表現(xiàn)出滑膜組織輕度增生或無增生，炎性細(xì)胞浸潤較少，未見明顯的軟骨侵蝕和新生血管，改善情況從強(qiáng)到弱依次為來氟米特組、三痹湯高劑量組、三痹湯中劑量組。見圖2。

圖2 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理形態(tài)（HE，×200）

3.5 各組大鼠血清中IL-1β、IL-18含量比較

與空白組比較，模型組大鼠血清中IL-1β、IL-18含量明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；與模型組比較，三痹湯高、中劑量組、三痹湯中劑量加來氟米特組、來氟米特組大鼠血清中IL-1β、IL-18含量明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；與三痹湯高劑量組比較，三痹湯低劑量組大鼠血清中IL-1β、IL-18含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；與來氟米特組比較，三痹湯中、低劑量組大鼠血清中IL-1β、IL-18含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），三痹湯高劑量組大鼠血清中IL-1β、IL-18含量變化比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。見表6。

表6 各組大鼠血清中IL-1β、IL-18含量比較（±s，pg/L）

表6 各組大鼠血清中IL-1β、IL-18含量比較（±s，pg/L）

注：與空白組比較，*P ＜ 0.05；與模型組比較，^P ＜ 0.05；與三痹湯高劑量組比較，aP ＜ 0.05；與來氟米特組比較，bP ＜ 0.05。

IL-18 85.87±10.94 159.86±19.76*117.02±20.11^111.84±10.75^b 143.51±14.95^ab 109.14±20.43^組別空白組模型組三痹湯高劑量組三痹湯中劑量組三痹湯低劑量組來氟米特組n 10 10 10 10 10 10 IL-1β 16.37±3.13 39.82±4.54*29.24±5.22^31.23±2.74^b 33.49±4.55^ab 27.72±6.84^

3.6 各組大鼠滑膜組織中NLRP3 mRNA蛋白表達(dá)水平比較

與空白組比較，模型組大鼠滑膜組織中NLRP3 mRNA蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；與模型組比較，三痹湯高、中、低劑量組和來氟米特組大鼠滑膜組織中NLRP3 mRNA蛋白表達(dá)水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；與三痹湯高劑量組比較，三痹湯中、低劑量組大鼠滑膜組織中NLRP3 mRNA蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；與來氟米特組比較，三痹湯低劑量組大鼠滑膜組織中NLRP3 mRNA蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。見表7。

表7 各組大鼠滑膜組織中NLRP3 mRNA蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表7 各組大鼠滑膜組織中NLRP3 mRNA蛋白表達(dá)水平比較（±s）

注：與空白組比較，*P ＜ 0.05；與模型組比較，^P ＜ 0.05；與三痹湯高劑量組比較，aP ＜ 0.05；與來氟米特組比較，bP ＜ 0.05。

NLRP3 1.00±0.01 4.62±0.20*1.51±0.05^2.71±0.10^a 3.37±0.21^ab 2.64±0.43^組別空白組模型組三痹湯高劑量組三痹湯中劑量組三痹湯低劑量組來氟米特組n 10 10 10 10 10 10

3.7 PCR擴(kuò)增曲線和熔解曲線

目的基因NLRP3與內(nèi)參基因GAPDH不同CT值的擴(kuò)增曲線呈S形，拐點(diǎn)清晰、整體平行性很好，并且目的基因與內(nèi)參基因擴(kuò)增曲線傾斜程度相似，說明目的基因與內(nèi)參基因擴(kuò)增效率基本一致，擴(kuò)增良好。擴(kuò)增產(chǎn)物熔解曲線呈單一峰，其他位置未出現(xiàn)波形，說明產(chǎn)物特異性良好，且無污染。見圖3。

圖3 NLRP3與GAPDH擴(kuò)增曲線和熔解曲線

3.8 各組大鼠滑膜組織中NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)比較

與空白組比較，模型組大鼠滑膜組織中NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；與模型組比較，除三痹湯低劑量組外，其余各組大鼠滑膜組織中NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；與三痹湯高劑量組比較，三痹湯中、低劑量組大鼠滑膜組織中NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；與來氟米特組比較，三痹湯中、低劑量組滑膜組織中NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），三痹湯高劑量組滑膜組織中NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)水平變化比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。見圖4～5和表8。

圖4 各組大鼠滑膜組織中NLRP3蛋白表達(dá)情況（×400）

圖5 各組大鼠滑膜組織中Caspase-1蛋白表達(dá)情況（×400）

表8 各組大鼠滑膜組織中NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)比較（±s）

表8 各組大鼠滑膜組織中NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與空白組比較，*P ＜ 0.05；與模型組比較，^P ＜ 0.05；與三痹湯高劑量組比較，aP ＜ 0.05；與來氟米特組比較，bP ＜ 0.05。

CasPase-1 38.38±3.86 70.10±4.35*47.73±2.71^56.34±5.55^ab 59.29±3.67ab 55.11±3.51^組別空白組模型組三痹湯高劑量組三痹湯中劑量組三痹湯低劑量組來氟米特組n 10 10 10 10 10 10 NLRP3 13.29±1.39 51.83±5.41*16.47±1.50^25.09±2.98^ab 31.30±2.24ab 20.83±2.05^

4 討論

痹證的病因?yàn)樵陲L(fēng)寒濕外邪等因素影響下，外邪侵襲導(dǎo)致經(jīng)脈痹阻，氣血運(yùn)行失常，以致血瘀氣滯，津停為痰，不通則痛，引發(fā)痹痛［9］。發(fā)病日久，肝腎虧損，氣血虧虛，元?dú)獯髠?，形成虛痹。故痹證的病機(jī)總結(jié)為正氣不足，衛(wèi)外不顧。三痹湯以補(bǔ)肝腎、祛風(fēng)濕、強(qiáng)筋骨為立方依據(jù)。痹癥以正氣虧虛為本，風(fēng)、寒、濕、熱、痰等邪侵襲人體四肢筋骨、關(guān)節(jié)、肌肉為標(biāo)，而痹癥病機(jī)關(guān)鍵即經(jīng)脈痹阻［10］。三痹湯中人參、茯苓意在治療痹癥日久，正氣虧虛，配伍甘草調(diào)和諸藥，降燥烈之性補(bǔ)虧虛正氣；氣血不足，氣虛血弱，不能濡養(yǎng)經(jīng)脈，血虛則肢體不榮，肢端麻木，運(yùn)動(dòng)不靈，氣虛則推動(dòng)無力，血行瘀阻。方中熟地黃、白芍、當(dāng)歸、川芎，養(yǎng)血補(bǔ)血，活血化瘀。黃芪益氣固表，扶正祛邪。杜仲具有滋補(bǔ)肝腎及增強(qiáng)肌肉和骨骼的作用。續(xù)斷具有調(diào)理肝腎、增強(qiáng)肌肉和骨骼以及治療跌打損傷的功效［11］。間歇性活性成分可保護(hù)骨組織，具有消炎、鎮(zhèn)痛等作用。獨(dú)活、秦艽為治療關(guān)節(jié)痛的對藥，兩者合用，使其祛風(fēng)勝濕，除痹止痛功效更佳，正切病機(jī)［12］。

通過定期觀察AA大鼠關(guān)節(jié)腫脹度，筆者發(fā)現(xiàn)灌胃給藥結(jié)束后三痹湯高、中、低劑量組和來氟米特組大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度以及關(guān)節(jié)炎指數(shù)明顯低于模型組，且三痹湯高劑量及來氟米特組效果最優(yōu)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)HE結(jié)果也顯示三痹湯高劑量組及來氟米特組較模型組病變程度明顯減輕，踝關(guān)節(jié)滑膜中只有少量的炎性細(xì)胞浸潤，少量血管翳形成，成纖維樣細(xì)胞增生較少，關(guān)節(jié)軟骨增生及骨質(zhì)破壞較少。三痹湯中劑量組大鼠滑膜損傷較模型組明顯減輕，三痹湯低劑量組大鼠滑膜損傷與模型組大鼠滑膜損傷相比無明顯變化。提示三痹湯有良好的抗炎效果，且藥物療效與給藥劑量有關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)中，三痹湯高劑量組大鼠與來氟米特組大鼠踝關(guān)節(jié)病理改善程度基本一致，說明三痹湯同樣可以有效抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)，延緩RA進(jìn)展?？傮w來說，三痹湯高劑量及來氟米特組對AA大鼠模型組踝關(guān)節(jié)病變的改善功效基本一致，優(yōu)于三痹湯中、低劑量組。

RA炎癥反應(yīng)以炎性因子過量產(chǎn)生為特征，大量高度活化的炎性因子浸潤RA患者滑膜組織內(nèi)，破壞其軟骨并帶來一系列關(guān)節(jié)損傷。IL-1β和IL-18這兩種有效致炎因子，能夠迅速招募炎性細(xì)胞從而引起一系列炎癥反應(yīng)，并發(fā)揮其免疫作用使RA愈演愈重［13］。為了進(jìn)一步探討三痹湯對AA大鼠炎癥反應(yīng)的影響，本研究檢測了各組大鼠血清中IL-1β和IL-18含量。結(jié)果顯示，三痹湯高、中、低劑量和來氟米特都可以明顯降低AA大鼠血清中IL-1β、IL-18含量，尤其是三痹湯高劑量組和來氟米特組，且呈劑量依賴性。三痹湯高劑量組大鼠血清IL-1β、IL-18含量與來氟米特組大鼠基本一致，說明三痹湯同樣可以有效抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)，延緩RA進(jìn)展。

目前大量研究表明，NLRP3信號通路在RA的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用，其是機(jī)體固有免疫的重要組成部分［14］，可通過模式識別受體（PRR）識別內(nèi)源性或者外源性刺激因素，從而聚集Caspase-1并使其激活，并剪切IL-1β及IL-18的活性前體pro-IL-1β及pro-IL-18，促進(jìn)其成熟，產(chǎn)生成熟的細(xì)胞因子并釋放，最終導(dǎo)致RA過程中的一系列炎癥反應(yīng)［15］。本研究結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組大鼠血清中IL-1β和IL-18含量顯著升高；踝關(guān)節(jié)滑膜組織中NLRP3、Caspese-1的表達(dá)顯著升高；NLRP3 mRNA蛋白表達(dá)水平顯著升高，可知NLRP3炎性信號通路的激活參與了RA的發(fā)病過程。通過病理檢查不難發(fā)現(xiàn)，模型組病變最為嚴(yán)重，大量炎性細(xì)胞浸潤及肉眼可見的腫脹，這提示我們NLRP3的激活對炎癥的發(fā)生、發(fā)展具有很大的促進(jìn)作用。經(jīng)過相應(yīng)藥物治療后，三痹湯高、中、低劑量組以及來氟米特治療組大鼠血清中IL-1β和IL-18含量均降低；踝關(guān)節(jié)滑膜組織中NLRP3、Caspase-1的表達(dá)均降低；NLRP3 mRNA蛋白表達(dá)水平降低。模型組可能因NLRP3信號通路上游因子NLRP3、Caspase-1激活而致下游因子IL-1β、IL-18合成分泌過多，引起炎性細(xì)胞聚集，因而引起關(guān)節(jié)腫脹、活動(dòng)受限，而三痹湯發(fā)揮其抗炎、鎮(zhèn)痛、保護(hù)骨組織及提高免疫力等功效，可能通過抑制NLRP3信號通路上游因子NLRP3、Caspase-1的激活阻止IL-1β、IL-18的生成，從而達(dá)到對AA大鼠的治療作用。通過觀察三痹湯各劑量組對降低大鼠足容積、關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分以及炎性因子水平的影響，發(fā)現(xiàn)治療效果呈劑量依賴性。其中三痹湯高劑量組效果最好，其次是三痹湯中劑量組，三痹湯低劑量組效果最差。來氟米特組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中NLRP3通路相關(guān)蛋白因子表達(dá)均低于三痹湯中、低劑量組，而三痹湯高劑量組低于來氟米特組，說明高劑量三痹湯在抑制NLRP3信號通路相關(guān)蛋白因子表達(dá)方面強(qiáng)于來氟米特。

5 結(jié)論

三痹湯能夠減輕AA大鼠關(guān)節(jié)腫脹度，改善滑膜組織病理損傷，并通過抑制NLRP3信號通路的激活，降低大鼠血清IL-1β、IL-18水平，對佐劑型關(guān)節(jié)炎大鼠起到治療作用。