金銀花外觀性狀與主要有效成分含量的相關(guān)性研究

唐志強(qiáng) 程雪梅 劉謙 李佳 劉振華 張永清 劉紅燕 蒲高斌

關(guān)鍵詞：金銀花；外觀性狀：有效成分：相關(guān)性分析

金銀花為忍冬科植物忍冬（Lonicerae japonzcaThunb.）的干燥花蕾及初開(kāi)的花，是我國(guó)傳統(tǒng)大宗中藥材之一，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱等功效，被廣泛應(yīng)用于中藥臨床及中成藥復(fù)方制劑。金銀花主產(chǎn)于山東、河南、河北等地，主要有效成分為黃酮類、有機(jī)酸類及萜類等，其中木犀草苷和綠原酸類化合物是2020版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的金銀花指標(biāo)性成分。

中藥材質(zhì)量一直是制約中醫(yī)臨床合理用藥的瓶頸問(wèn)題之一．傳統(tǒng)的依靠經(jīng)驗(yàn)通過(guò)藥材外觀進(jìn)行品質(zhì)鑒別，即所謂的“辨狀論質(zhì)”，目前仍是中藥材真?zhèn)蝺?yōu)劣鑒別的主要方法。如細(xì)辛以色白者為善；知母以根黃白、脂潤(rùn)者為好；黃芪以大而肥潤(rùn)箭直者良。然而，“辨狀論質(zhì)”主要依靠專家經(jīng)驗(yàn)，受人為主觀因素及判別標(biāo)準(zhǔn)等的影響，很難形成統(tǒng)一、客觀的標(biāo)準(zhǔn)。如何解析“辨狀論質(zhì)”背后的科學(xué)道理成為中藥現(xiàn)代化發(fā)展亟需解決的問(wèn)題。為此，有學(xué)者從外觀性狀與有效成分間相關(guān)性的角度對(duì)中藥材“辨狀論質(zhì)”的科學(xué)性進(jìn)行探討，已在多個(gè)物種中得到驗(yàn)證，但尚未見(jiàn)金銀花的相關(guān)研究。因此，本試驗(yàn)選用顏色、花蕾直徑和長(zhǎng)度等金銀花外觀指標(biāo)，分析其與金銀花主要有效成分（木犀草苷和綠原酸類物質(zhì)）含量之間的相關(guān)性，以期為金銀花“優(yōu)形”“優(yōu)質(zhì)”研究提供新思路，進(jìn)而為金銀花藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料與試劑

供試的50批金銀花于2022年3月分別收集于山東、河南和河北三省份，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)蒲高斌教授鑒定，為忍冬科多年生木質(zhì)藤本植物忍冬（Lonicerae japonica Thunb.）的花蕾。

木犀草苷（批號(hào)Y13JIOH93050）、綠原酸（批號(hào)20130415）、異綠原酸A（批號(hào)20130816）、異綠原酸C（批號(hào)20130924）對(duì)照品均由上海源葉生物科技有限公司提供，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%。乙腈、甲酸為色譜純，其他試劑為分析純。

1.2調(diào)查項(xiàng)目及方法

1.2.1金銀花顏色值測(cè)定每批金銀花隨機(jī)抽取10個(gè)完整花蕾，用CM-600D型色差儀（杭州柯盛行儀器有限公司）進(jìn)行掃描，使用光源為D65，照明口徑為50mm，波長(zhǎng)掃描范圍為380～780nm，標(biāo)準(zhǔn)觀察角度為10°，掃描速度為600nm/min。所測(cè)數(shù)據(jù)用色空間法表示，其中，L*為亮度值，值越大表示亮度越高；a表征紅一綠色軸，正值為紅，負(fù)值為綠；b表征黃-藍(lán)色軸，正值為黃，負(fù)值為藍(lán)。以標(biāo)準(zhǔn)白板作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，測(cè)得L*=17.53，a=13.76，b=45.64。將所測(cè)得的金銀花樣品色度值與標(biāo)準(zhǔn)樣品的測(cè)定值做差，即為樣品的色度值；其中，Aa值越大樣品顏色越紅，反之越綠，而Ab值越大樣品顏色越黃，反之越藍(lán)。每個(gè)花蕾掃描10次，取平均值。

1.2.2花蕾外觀性狀測(cè)量每批金銀花隨機(jī)抽取10個(gè)完整花蕾，用游標(biāo)卡尺分別測(cè)量其長(zhǎng)度及上、中、下部直徑，取平均值。

1.2.3金銀花有效成分含量的測(cè)定使用Agi-lent 1260高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。

混合對(duì)照品溶液的制備：精密稱取綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A和異綠原酸C對(duì)照品適量，用50%的甲醇制成單個(gè)對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別精密量取各儲(chǔ)備液適量，配制成系列濃度的混合對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備：精密稱取金銀花樣品粉末（過(guò)3號(hào)篩）1.0g，置100mL具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50mL，密塞，稱重，超聲處理（100W，100kHz） 30min，放冷，用50%甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，4000r/min離心10min，取上清，過(guò)0.22um微孔濾膜，即得供試品溶液。

色譜條件：色譜柱ZORBAXSB-C18（250mmx4.6mm．5um）；流速1.0mL/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量20uL；檢測(cè)波長(zhǎng)327、350nm。流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液，B為乙腈。洗脫梯度：0～10min，8%～10%B;10～20min，10%～15%B;20～30min，15%B;30～40min， 15%～25%B;40～60min，25%～100%B。

1.3數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 22.0軟件對(duì)金銀花外觀性狀指標(biāo)及有效成分含量進(jìn)行Pearson雙側(cè)相關(guān)性統(tǒng)計(jì)分析，并進(jìn)行逐步回歸分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同批次金銀花顏色差異分析

為減小誤差，每批金銀花隨機(jī)選10個(gè)花蕾進(jìn)行顏色值測(cè)定，然后取平均值，結(jié)果如表1所示，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均<3%。50批次金銀花的AL*均為正值，說(shuō)明花蕾亮度比較大；其中，山東13個(gè)批次金銀花除山東007的AL*值僅為4.86外，其他的AL*值均在10.15～18.65范圍內(nèi)；河南21批次金銀花的AL*值大多在10.00左右，僅河南01 1較低，為2.80;河北16批次的金銀花除河北003（4.94）、河北006（2.88）、河北010（5.59）外，AL*值均大于10.00。50批次的金銀花中絕大多數(shù)的Aa*、△b為負(fù)值，說(shuō)明花蕾顏色偏綠、偏藍(lán)；僅河北010的Aa*、△b值為正，山東007的Ab*值為正，說(shuō)明這兩批次金銀花均偏黃，河北010金銀花偏紅。

2.2不同批次金銀花花蕾形態(tài)指標(biāo)的差異分析

由表2可見(jiàn)，50批次金銀花的花蕾上、中、下部直徑分別分布在2.12～3.70、0.96～1.62、0.66～1.03mm，均表現(xiàn)為上部直徑>中部直徑>下部直徑，其中山東010金銀花的花蕾上部直徑最大，河北001金銀花的花蕾中、下部直徑最大。50批次金銀花的花蕾長(zhǎng)度均在17.65～31.40mm范圍內(nèi)，大多25mm左右，其中，河南009批次的金銀花最長(zhǎng)，河南001批次的金銀花最短。

2.3不同批次金銀花的有效成分含量測(cè)定及差異分析

2.3.1線性關(guān)系考察在1.2.3中的方法條件下，各成分分離度良好（圖1）。分別吸取不同體積的混合對(duì)照品溶液，用50%的甲醇稀釋至10mL，制成10個(gè)質(zhì)量濃度梯度的系列溶液進(jìn)行高效液相色譜（HPLC）測(cè)定，以對(duì)照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果（表3）顯示，四種有效成分均存在線性區(qū)間，R2值達(dá)到0.9997～0.9999，線性關(guān)系良好。

2.3.2方法學(xué)考察（1）精密度試驗(yàn)：精密吸取混合對(duì)照品溶液，按照上述色譜條件分別進(jìn)行日內(nèi)精密度考察（1天內(nèi)連續(xù)分析5次）和日間精密度考察（每3天分析一次）。結(jié)果顯示，兩種考察方法下，4種有效成分峰面積的RSD均<1.5%，表明儀器精密度良好。

（2）重復(fù)性試驗(yàn)：取同一供試品各1.0g，平行制備6份供試品溶液，進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果顯示各成分峰面積RSD在0.38%～0.96%，表明方法重復(fù)性良好。

（3）穩(wěn)定性試驗(yàn)：取金銀花供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)行HPLC分析，4種成分峰面積的RSD在0.86%～1.78%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

（4）加樣回收率試驗(yàn)：精密稱取已知成分含量的金銀花供試品6份，分別加入一定量的對(duì)照品，進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果顯示，各成分平均加樣回收率為98.78%～103.66%，符合要求。

2.3.3有效成分含量測(cè)定由表4可見(jiàn)，河北001金銀花的綠原酸含量最高，為4.31%；有3批金銀花的綠原酸含量低于1.50%，其中河北010金銀花的最低，為0.58%。河北003金銀花的異綠原酸A和異綠原酸C含量最高，分別為2.12%和0.42%：河北010金銀花的異綠原酸A和異綠原酸C含量最低，分別為0.30%和0.05%。3種綠原酸類物質(zhì)總量最高的是河北003金銀花，為6.49%：有18批次金銀花的3種綠原酸類物質(zhì)總量低于3.80%，其中河北010的最低，為0.93%。

2.4金銀花外觀性狀與主要有效成分的相關(guān)性分析

如表5所示，AL*與綠原酸含量極顯著負(fù)相關(guān)，與木犀草苷含量極顯著正相關(guān)，與3種綠原酸物質(zhì)總量顯著負(fù)相關(guān)；△a、Ab、花蕾上部直徑與異綠原酸A和C含量及3種綠原酸物質(zhì)總量均呈極顯著負(fù)相關(guān)；花蕾中、下部直徑與木犀草苷含量呈極顯著正相關(guān)，與3種綠原酸物質(zhì)總量顯著正相關(guān)：花蕾長(zhǎng)度與木犀草苷含量和3種綠原酸物質(zhì)總量極顯著負(fù)相關(guān)，與異綠原酸A顯著相關(guān)。

在相關(guān)性分析基礎(chǔ)上建立各有效成分含量與金銀花外觀性狀的線性回歸模型，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見(jiàn)表6。以AL為自變量X，以綠原酸含量為因變量Y，建立回歸方程Y=10.481-0.536X，驗(yàn)證其顯著性的F值和P值分別為6.820和0.009，達(dá)極顯著水平；以Aa*、△b、花蕾上部直徑、長(zhǎng)度為自變量，以異綠原酸A含量為因變量，建立回歸方程Y=0.722-0.093Aa-0.007Ab-0.097X上部直徑+0.012X長(zhǎng)度，其F值和P值分別為50.043和0.000，達(dá)極顯著水平；以Aa、Ab、花蕾上部直徑為自變量，以異綠原酸C含量為因變量，建立回歸方程Y=0.158-0.005Aa*-0．001△b-0.008X上部直徑，其F值和P值分別為17.286和0.000，達(dá)極顯著水平；以AL*、Aa*、Ab*及花蕾上、中、下部直徑為自變量，以3種綠原酸物質(zhì)總量為因變量，建立回歸方程Y= 2.553-0.027AL-0.316Aa-0.024Ab-0.144X上部直徑+0.179X+0.40IX下部直徑，其F值和P值分別為54.445和0.000，達(dá)極顯著水平；以AL*、Aa*、中部直徑、下部直徑、花蕾長(zhǎng)度為自變量，以木犀草苷含量為因變量，建立回歸方程Y=0.041+其F值和P值分別為36.189和0.000，達(dá)極顯著水平。

3討論與結(jié)論

目前對(duì)中藥材質(zhì)量的評(píng)價(jià)方法多以主觀描述為主，因此外觀性狀是判斷藥材質(zhì)量等級(jí)和預(yù)測(cè)活性成分含量的重要依據(jù)。如巴戟天、紅花和甘草等可以通過(guò)色澤、大小、直徑等外在指標(biāo)判斷藥材品質(zhì)和有效成分含量。本研究對(duì)50批次金銀花藥材“形”與“質(zhì)”的關(guān)系進(jìn)行了初步探索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，金銀花中綠原酸含量與AL*值具有顯著負(fù)相關(guān)性，亮度越大，綠原酸含量越低：異綠原酸A和C的含量及3種綠原酸物質(zhì)總量均與Aa*、Ab*、花蕾上部直徑極顯著負(fù)相關(guān)，3種綠原酸物質(zhì)總量還與AL*和花蕾長(zhǎng)度顯著負(fù)相關(guān)，而與花蕾中、下部直徑顯著正相關(guān)，說(shuō)明花蕾顏色偏綠、偏藍(lán)、上部直徑偏小的金銀花藥材含有較多異綠原酸A、異綠原酸C，3種綠原酸物質(zhì)總量較高，這與王玲娜等的研究結(jié)果一致；木犀草苷含量與AL*和花蕾中、下部直徑呈極顯著正相關(guān)，而與Aa*和花蕾長(zhǎng)度呈極顯著負(fù)相關(guān)，說(shuō)明花蕾偏綠、偏亮、中下部直徑偏粗的金銀花藥材木犀草苷含量較高。上述結(jié)論使得借助信息化技術(shù)搭建金銀花人工智能鑒別平臺(tái)成為可能，從而實(shí)現(xiàn)短時(shí)間、低成本、高精度鑒定，為建立金銀花品質(zhì)快速鑒別和評(píng)價(jià)體系奠定基礎(chǔ)，從而有效解決傳統(tǒng)中藥材鑒別人才流失和不足的問(wèn)題。

在金銀花藥材形成過(guò)程中，色素積累是導(dǎo)致其色澤發(fā)生改變的主要原因。植物體內(nèi)色素的積累和代謝受基因型、代謝途徑、氣候條件等多種因素的影響。今后可圍繞金銀花色素合成基因的克隆、表達(dá)模式、功能鑒定、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)等方面展開(kāi)研究，以從分子層面揭示金銀花外觀性狀與有效成分的相關(guān)性，為制定金銀花藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)。