基于干種子DNA的洋蔥雜交種純度分子標(biāo)記快速鑒定

孫亞玲 李艷偉 王振寶 吳雄 劉冰江 楊妍妍

關(guān)鍵詞：洋蔥；種子；DNA提??；純度；快速鑒定

洋蔥（Allium cepaL．）屬于石蒜科（Amarylli-daceae）蔥屬（Allium）二年生草本植物，栽培歷史悠久，適應(yīng)性強(qiáng)，在我國(guó)種植范圍較廣。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，采用分子標(biāo)記技術(shù)與傳統(tǒng)育種相結(jié)合的方法開展洋蔥分子育種研究已成為趨勢(shì)。DNA提取是分子技術(shù)實(shí)施的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)，DNA制備質(zhì)量對(duì)于后續(xù)實(shí)驗(yàn)開展的效率及準(zhǔn)確率尤為重要。傳統(tǒng)的植物總DNA提取方法有CTAB法、SDS法和高鹽低pH法等，國(guó)內(nèi)外生物公司還開發(fā)了多種商品化快捷型的DNA提取試劑盒。但由于不同植物中次生代謝產(chǎn)物的種類和含量存在較大差異，即使同種植物不同組織的次生代謝產(chǎn)物和含量也不盡相同，使得對(duì)某種植物組織優(yōu)化的DNA提取方法不一定適用于其他材料。

目前已成功從植物葉、莖、根、幼苗、組培苗、愈傷組織、果實(shí)等組織或器官中提取到DNA，而干燥種子的DNA與組蛋白緊密結(jié)合，導(dǎo)致提取的DNA豐度低、質(zhì)量不高，加大了從含有大量蛋白質(zhì)、多糖類物質(zhì)的干種子中提取高質(zhì)量DNA的難度。關(guān)于從種子中提取DNA的實(shí)驗(yàn)方法國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道，如：Chunwongse等發(fā)明了從水稻和小麥的半粒種子中提取DNA的方法：McDo-nald、Kang等發(fā)明了從玉米、棉花、小麥、花生、大豆等作物種子中提取DNA的方法：國(guó)內(nèi)研究者也相繼發(fā)明了從不同作物干種子中提取DNA的方法，并取得了較好的效果。但關(guān)于洋蔥干種子DNA提取方法尚未見報(bào)道。鑒于此，本研究以洋蔥干種子為試材，考慮到種子中含有蛋白質(zhì)、脂肪和多糖等，采用全式金PlantZol試劑盒、天根快捷型植物基因組DNA提取系統(tǒng)、TPS法和CTAB法提取洋蔥干種子及不同發(fā)芽天數(shù)種子的基因組總DNA。同時(shí)對(duì)種子用量進(jìn)行篩選，通過(guò)比較提取的DNA質(zhì)量，確定了一種能夠從洋蔥干種子中提取高質(zhì)量DNA的方法，并用于對(duì)雜交種Ms位點(diǎn)基因型的SCAR標(biāo)記鑒定，以期建立一種基于干種子DNA的洋蔥雜交種純度鑒定體系，為快速準(zhǔn)確地鑒定雜交種的純度及進(jìn)行種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析等工作奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

本研究選用黃皮洋蔥雜交種‘天正105、紫皮洋蔥雜交種‘紫鈴及其父母本的種子，均由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所洋蔥課題組提供。

1.2DNA提取方法

1.2.1PlantZol試劑盒法參照北京全式金生物技術(shù)有限公司PlantZol（EE141 -01）試劑盒說(shuō)明書對(duì)3?！镶徃煞N子進(jìn)行DNA提取。

1.2.2快捷型植物基因組DNA提取系統(tǒng)法參照天根生化科技（北京）有限公司快捷型植物基因組DNA提取系統(tǒng)（DP321非離心柱型）說(shuō)明書對(duì)3?！镶徃煞N子進(jìn)行DNA提取。

1.2.3TPS法將3粒‘紫鈴干種子放人2.0mL離心管中，加入鋼珠，在組織破碎儀中破碎2min；加人800uL TPS緩沖液禾口5uL RNase，渦旋振蕩1min，80℃水浴加熱30min，期間顛倒混勻2～3次；12000r/min離心5min，取上清液至新的1.5mL無(wú)菌離心管中，加入等體積的異丙醇，再12000r/min離心5min，沉淀用70%乙醇洗2次，徹底晾干；加入20uL無(wú)菌ddH20溶解DNA沉淀，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4CTAB法分別將1、2、3、4、5?！镶徃煞N子及其發(fā)芽3、5、7、9d的種子放人2.0 mL離心管中，加入鋼珠，在組織破碎儀中破碎2min;加入1mL65℃預(yù)熱的CTAB提取液和5uLRNase，渦旋振蕩1min，65℃恒溫水浴30min，期間顛倒混勻2～3次，12000r/min離心5min，吸取上清液至新的2.0mL無(wú)菌離心管中，用DNA提取液（25：24：1）抽提1次，12000r/min離心5min，吸取上清液至新的1.5mL無(wú)菌離心管中，加入等體積的異丙醇，充分混勻，12000r/min離心5min，棄上清，沉淀用70%乙醇漂洗2次，徹底晾干：加入20uL無(wú)菌ddH20溶解DNA沉淀，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3基因組總DNA的質(zhì)量檢測(cè)

基因組總DNA的質(zhì)量主要用DNA的完整性、純度和濃度來(lái)衡量。分別采用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳、Nano Photometer超微量分光光度計(jì)儀（IMPLEN，P-Class P330）對(duì)提取的總DNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。

1.4基于SCAR標(biāo)記的洋蔥雜交種純度鑒定

利用本課題組開發(fā)的洋蔥細(xì)胞核雄性不育分子標(biāo)記SCAR（ sequence characterized amplified re-gions．特定序列擴(kuò)增）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用于洋蔥雜交種的純度鑒定。所用引物（表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火45s，72℃延伸2min，35個(gè)循環(huán)；72℃后延伸10min，4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2結(jié)果與分析

2.1洋蔥干種子基因組總DNA提取方法的比較分析

采用全式金PlantZol試劑盒、天根快捷型植物基因組DNA提取系統(tǒng)、TPS法和CTAB法分別提取洋蔥干種子的基因組總DNA，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果（圖1）顯示，除天根快捷型植物基因組DNA提取系統(tǒng)未出現(xiàn)相應(yīng)的DNA電泳條帶外，其他3種方法均可得到完整的DNA條帶。但全式金PlantZol試劑盒和TPS法提取的基因組總DNA帶型呈鋸齒狀，在點(diǎn)樣孔處有明顯的殘留物質(zhì)，其中TPS法的點(diǎn)樣孔處殘留物質(zhì)尤其多；CTAB法提取的基因組總DNA帶型整齊一致、單一明亮，條帶無(wú)拖尾和降解現(xiàn)象，也沒有明顯的RNA和蛋白污染。

采用超微量分光光度計(jì)對(duì)所提取DNA的完整性和純度進(jìn)行檢測(cè)，每種提取方法獲得的DNA樣本均進(jìn)行3次重復(fù)。結(jié)果（表2）顯示，CTAB法提取的DNA濃度和純度均最好，天根快捷型植物基因組DNA提取系統(tǒng)提取的DNA濃度和純度最差，這與瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果一致。

綜上所述，CTAB法是提取洋蔥干種子DNA的最佳方法，用該方法進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2不同粒數(shù)洋蔥干種子基因組總DNA提取質(zhì)量的比較

分別選取1、2、3、4、5粒洋蔥干種子，采用CTAB法進(jìn)行基因組總DNA的提取。對(duì)提取DNA的質(zhì)量檢測(cè)（圖2和表3）發(fā)現(xiàn)，不同粒數(shù)洋蔥干種子均能獲得完整的基因組DNA，且DNA濃度隨著種子粒數(shù)的增加逐漸升高。用1粒和2粒洋蔥干種子提取的基因組DNA條帶雖然較弱，但帶型整齊，無(wú)拖尾現(xiàn)象，點(diǎn)樣孔處無(wú)明顯的殘留物質(zhì)，OD260/OD280分別為1.807和1.809；用3、4、5粒種子得到的DNA條帶雖然明亮，但帶型不整齊，呈鋸齒狀，點(diǎn)樣孔處也越來(lái)越亮，OD260/OD280分別為1.701、1.652、1.528，說(shuō)明存在多糖和蛋白等雜質(zhì)污染?？傮w來(lái)說(shuō)，基因組DNA的濃度與種子數(shù)量呈正相關(guān)，而DNA質(zhì)量以1～2粒種子的較好。

2.3洋蔥干種子及不同發(fā)芽天數(shù)種子基因組總DNA提取質(zhì)量的比較

分別選取干種子及發(fā)芽3、5、7、9d的洋蔥種子，采用CTAB法進(jìn)行基因組總DNA的提取。對(duì)提取DNA的質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果（圖3和表4）表明，洋蔥干種子及不同發(fā)芽天數(shù)的種子均能提取到帶型整齊、無(wú)彌散現(xiàn)象的基因組DNA。發(fā)芽種子的DNA濃度均明顯高于干種子，且隨著發(fā)芽天數(shù)的增加，DNA濃度越來(lái)越高，分別是干種子的1.53～4.01倍，發(fā)芽第9天種子的DNA濃度達(dá)到262.1ng/uL。但是發(fā)芽第5、7、9天的種子提取的DNA點(diǎn)樣孔處有輕微的蛋白殘留，而干種子和發(fā)芽第3天的種子提取的DNA條帶單一清晰，點(diǎn)樣孔處干凈無(wú)雜質(zhì)，OD260/OD280分別為1.836和1.837，說(shuō)明洋蔥干種子和發(fā)芽第3天的種子提取的基因組總DNA更加完整，純度更高。

2.4基于SCAR標(biāo)記的洋蔥雜交種純度鑒定

經(jīng)過(guò)上述試驗(yàn)，最終確定CTAB法提取1粒洋蔥干種子DNA的效果最好，用該方法進(jìn)行洋蔥雜交種純度鑒定。以洋蔥雜交種干種子的DNA為模板，利用SCAR分子標(biāo)記進(jìn)行DNA提取質(zhì)量的檢測(cè)，同時(shí)對(duì)Ms位點(diǎn)基因型做出判斷。結(jié)果（圖4）顯示擴(kuò)增出898 bp和621 bp兩條清晰明亮的條帶，說(shuō)明檢測(cè)種子的Ms位點(diǎn)基因型為雜合的Msms，是真實(shí)的雜交種。表明用CTAB法從1粒洋蔥干種子中提取的DNA完全可以滿足雜交種分子標(biāo)記鑒定的要求。

利用SCAR分子標(biāo)記對(duì)本課題組選育的洋蔥雜交種純度進(jìn)行鑒定。隨機(jī)選擇當(dāng)年收獲的洋蔥雜交種‘天正105和‘紫鈴的種子各150粒，采用CTAB法提取DNA，分別以兩個(gè)雜交種的父、母本作對(duì)照進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示所檢測(cè)的洋蔥種子DNA均同時(shí)具有父、母本的特異性條帶（圖5），說(shuō)明檢測(cè)的種子是真正的雜交種，品種純度為100%?？梢?，用本研究確定的方法提取的洋蔥干種子DNA質(zhì)量好，用其基于SCAR分子標(biāo)記檢測(cè)洋蔥細(xì)胞質(zhì)基因型，能實(shí)現(xiàn)雜交種純度的早期鑒定。

3討論與結(jié)論

關(guān)于植物種子DNA最優(yōu)提取方法的篩選，前人研究多以甜瓜、玉米、大豆、小麥等作物為主，對(duì)于蔥屬植物基因組DNA提取方法的研究較少。本研究對(duì)全式金PlantZol試劑盒、天根快捷型植物基因組DNA提取系統(tǒng)、TPS法和CTAB法4種方法提取的洋蔥種子DNA質(zhì)量進(jìn)行了比較，對(duì)不同發(fā)芽天數(shù)種子及得到有效DNA的種子用量進(jìn)行了優(yōu)化篩選，經(jīng)過(guò)凝膠電泳分析和分光光度計(jì)檢測(cè)，結(jié)果表明CTAB法提取的洋蔥干種子基因組總DNA質(zhì)量最好，這與水稻、小麥、玉米等作物種子基因組總DNA提取效果的研究一致。同時(shí)，我們通過(guò)研究不同粒數(shù)（1～5粒）洋蔥干種子DNA提取效果，發(fā)現(xiàn)種子粒數(shù)越多，相應(yīng)的雜質(zhì)也越多，這可能是由于提取時(shí)混有大量種皮且洋蔥富含多糖多酚的緣故。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基于DNA多態(tài)性的分子標(biāo)記正逐漸成為作物雜交種純度鑒定的有力工具。通過(guò)分子標(biāo)記鑒定雜交種純度，可以大大縮短鑒定周期，且操作簡(jiǎn)單，是一種更直接且準(zhǔn)確高效的方法。洋蔥DNA的有效提取是分子標(biāo)記鑒定雜交種純度的前提和基礎(chǔ)，也是較為關(guān)鍵的步驟。目前，關(guān)于植物基因組DNA提取方法已有大量報(bào)道，但大多是以葉片作為DNA的提取材料，需要在播種后25～30d的苗期才能進(jìn)行DNA提取操作，所需周期較長(zhǎng)。本研究利用干種子作為提取材料，不經(jīng)過(guò)苗期階段，在獲得雜交種種子后采用1粒洋蔥干種子即可獲得有效DNA，并利用SCAR分子標(biāo)記對(duì)雜交種純度進(jìn)行鑒定，不但降低了種子消耗成本，還實(shí)現(xiàn)了雜交種純度的早期鑒定。

洋蔥雜交種生產(chǎn)主要是利用“三系”法，即細(xì)胞質(zhì)雄性不育系、保持系和父本自交系配套的雜交制種技術(shù)。一般情況下，親本純合性越高，雜交種的優(yōu)勢(shì)越強(qiáng)。利用基因型為S（msms）的不育系為母本，與基因型為N/S（MsMs）的父本自交系雜交生產(chǎn)雜交種子，雜交種的基因型通常為S（Msms）。洋蔥雜交種商品化生產(chǎn)過(guò)程中，父本拔除不徹底、隔離措施不當(dāng)或者機(jī)械混雜等均有可能導(dǎo)致雜交種純度降低。而雜交種的遺傳真實(shí)性是種子質(zhì)量的重要標(biāo)志之一，種子純度是衡量種子質(zhì)量?jī)?yōu)劣的核心指標(biāo)，直接影響洋蔥的產(chǎn)量、商品性和品質(zhì)。因此，隨著洋蔥雜交種的廣泛應(yīng)用和種業(yè)市場(chǎng)的日趨成熟，種子純度快速檢驗(yàn)的重要性越來(lái)越突出。目前，AFLP、SSR、SRAP、In-Del、SNP等分子標(biāo)記技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于瓠瓜、茄子、大白菜、甜瓜、黃瓜及辣椒等蔬菜的雜交種純度鑒定中。本研究利用SCAR分子標(biāo)記對(duì)雜交種Ms位點(diǎn)的基因型做出判斷，進(jìn)行洋蔥雜交種的純度鑒定。采用CTAB法從1粒洋蔥干種子中提取的DNA可以擴(kuò)增出清晰明亮的條帶，根據(jù)條帶的遷移位置可以清楚區(qū)分洋蔥不同細(xì)胞核基因型之間的差異。PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示所檢測(cè)的洋蔥種子DNA均能擴(kuò)增出898 bp和621bp兩個(gè)片段，說(shuō)明檢測(cè)種子Ms位點(diǎn)的基因型為雜合的Msms，是真實(shí)的雜交種。

本研究確定了CTAB法為洋蔥干種子基因組總DNA提取的最佳方法，以1粒洋蔥干種子獲得的有效DNA完全可以滿足雜交種分子標(biāo)記鑒定的要求，且利用SCAR分子標(biāo)記技術(shù)鑒定洋蔥雜交種的純度，大大提高了檢測(cè)效率，具有廣泛的應(yīng)用前景和利用價(jià)值。