番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒核衣殼蛋白N的RT-LAMP檢測方法的建立

羅海燕 李恒 陸承聰 魏輝 鄭雪 陳勇

關(guān)鍵詞：番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒；核衣殼蛋白N;逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)；檢測

植物病毒病素有“植物癌癥”之稱，是導(dǎo)致作物減產(chǎn)和品質(zhì)下降的主要因素之一，全球每年因植物病毒病害造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)300億美元。在已報(bào)道的1484種植物病毒病害中，70%以上由媒介昆蟲傳播。番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒（Tomato zonate spot virus，TZSV）屬正番茄斑萎病毒屬（Orthotospovirus），于2005年在我國云南省被首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道，自然狀態(tài)下主要侵染番茄（So-lanum lycopersicum）、辣椒（Capsicum annuum）、煙草（Nicotiana tabacum）和馬鈴薯（Solanum tuberos-Mm）等20多種作物及雜草，主要由西花薊馬（Franilclinella occz，dentalis）、梳缺花薊馬（F．shcu-letzi）、棕櫚薊馬（Thrips palmi）等薊馬類昆蟲以持久增殖型方式傳播，也可通過機(jī)械摩擦傳播。近年來，除云南外，在北京、貴州及廣西的辣椒、番茄產(chǎn)區(qū)也檢測到該病毒病發(fā)生，危害有蔓延至周邊省份的趨勢(shì)。建立一種高效、特異、靈敏的檢測方法對(duì)TZSV的預(yù)警及發(fā)病規(guī)律研究具有重要意義。

逆轉(zhuǎn)尋環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（reverse tran-scription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP）是將環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相結(jié)合直接檢測RNA的方法，當(dāng)被檢RNA與反應(yīng)混合物中的pH指示劑耦合時(shí)，可通過顏色變化獲得檢測結(jié)果。RT-LAMP技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于糧食、果樹、蔬菜等農(nóng)作物病毒病的檢測。李戰(zhàn)彪等建立了基于TZSV RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase， RdRp）的RT-LAMP技術(shù)。但迄今國內(nèi)外未見有利用該技術(shù)檢測TZSV核衣殼蛋白N（nucleocapsid protein N）的報(bào)道。本研究根據(jù)TZSV核衣殼蛋白N的基因序列設(shè)計(jì)RT-LAMP引物，建立快速高效、特異靈敏的TZSV RT-LAMP檢測體系，以期為TZSV的鑒定及防控提供技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1供試病葉及病毒感染TZSV、番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）和煙草花葉病毒（Tobacco mosazicVLrUS，TMV）的辣椒葉片均由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所提供，經(jīng)RT-PCR檢測確定病毒種類后，-80℃保存?zhèn)溆?。攜帶TZSV-Ⅳ基因的質(zhì)粒pTOPO-TZSV-N由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所生物安全實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

1.1.2主要試劑TransZol Plant多糖植物總RNA提取試劑盒、EasyScript Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Trans2k Plus DNA Marker、dNTPs均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司：Bst DNA聚合酶、10xBst Reaction Buffer購自生工生物工程（上海）股份有限公司；SYBR Green I和甜菜堿購自北京索萊寶科技有限公司；Bst聚合酶、Mg-S04購自New England Biolabs（美國）；其他試劑均為常規(guī)分析純?cè)噭?/p>

1.1.3主要儀器Bio-rad TlOO PCR儀、MINI-PRATEA電泳儀、Bio Rad SYSTEM GelDocXR+凝膠成像系統(tǒng)均購自美國Bio -rad公司。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中TZSV-N基因序列（登錄號(hào)：MG656995.1），利用Primer Ex-plorer V4軟件設(shè)計(jì)RT-LAMP獷增引物，其中F3和B3為外引物、FIP和BIP為內(nèi)引物（表1），由福州尚亞生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2總RNA提取及cDNA合成按照TransZolPlant試劑盒操作說明提取病葉總RNA（終濃度1ug/uL），-80℃保存?zhèn)溆谩Ｒ訰NA為模板，利用EasyScript Reverse Transcriptase試劑盒合成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3RT-LAMP和RT-PCR反應(yīng)體系

25uLRT-LAMP反應(yīng)體系：8U/uL Bst 2.0 DNA聚合酶反應(yīng)條件：60℃1h，80℃5min。反應(yīng)結(jié)束后，加入2.0uL SYBRGreen I核酸染料，觀察顏色反應(yīng)；或取5uL擴(kuò)增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳后凝膠成像儀觀察、拍照。

1.2.4特異性及靈敏度檢測分別以感染TZSV、TSWV、TMV的辣椒葉片總RAN為模版，利用建立的反應(yīng)體系進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，與RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果對(duì)比，明確該方法的特異性。

將感染TZSV的總RNA用RNase-free H2010倍梯度稀釋（1.0x10-1～1.0x10-9），以稀釋后的RNA為模板，分別進(jìn)行RT-LAMP和RT-PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，比較兩者的靈敏度。

1.3RT-LAMP方法的應(yīng)用

秋冬季從云南省采集疑似感染TZSV的辣椒葉片，提取總RNA，利用本試驗(yàn)建立的RT-LAMP和普通RT-PCR體系擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物中加入2.0uLSYBR Green I核酸染料，陽性為綠色，陰性為橙色。

2結(jié)果與分析

2.1RT-LAMP引物篩選

以質(zhì)粒pTOPO-TZSV-N為模板，進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測表明，引物組I產(chǎn)生典型的LAMP梯狀條帶，擴(kuò)增效果最好，其余兩組無明顯的梯狀條帶（圖1A）；終止反應(yīng)后向反應(yīng)液中加入SYBR Green I，可見引物組I變?yōu)榫G色，其余兩組為橙色（圖1B）。因此，選擇第1組引物進(jìn)行特異性和靈敏度檢測。

2.2RT-LAMP的特異性檢測

以TZSV陽性樣本為陽性對(duì)照，健康植物樣本為陰性對(duì)照，對(duì)TMV和TSWV陽性樣本進(jìn)行RT-LAMP檢測。結(jié)果顯示，只有TZSV陽性樣品出現(xiàn)梯狀條帶，其它病毒和健康植物樣本中未產(chǎn)生梯狀條帶，與RT-PCR檢測結(jié)果相同（圖2），說明建立的TZSV

RT-LAMP檢測方法具有較強(qiáng)的特異性。

2.3RT-LAMP的靈敏度檢測

將1ug/uL的TZSV總RNA進(jìn)行10倍梯度稀釋，以不同濃度RNA為模板分別進(jìn)行RT-LAMP和RT-PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，RNA濃度被稀釋至0.01pg/uL（10-8）時(shí)，RT-LAMP方法仍能檢測出TZSV（圖3A），而RT-PCR只能檢測到RNA濃度稀釋至0.1pg/uL（10-7）的樣品（圖3B），表明RT-LAMP檢測方法的靈敏度是RT-PCR的10倍。

2.4RT-LAMP技術(shù)的田間檢測應(yīng)用

對(duì)采自云南省的疑似感染TZSV的辣椒葉片進(jìn)行RT-LAMP和RT-PCR檢測。結(jié)果顯示，6份樣品中利用RT-LAMP方法檢測出4份TZSV陽性樣品，與RT-PCR檢測結(jié)果一致。向RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物中加入SYBR Green I核酸熒光染料，陽性樣品迅速變?yōu)榫G色，陰性樣品為橙色，結(jié)果一致（圖4）。綜上，本研究建立的RT-LAMP檢測法可用于田間辣椒TZSV快速檢測。

3討論與結(jié)論

關(guān)于TZSV的檢測，目前已建立了血清學(xué)、電鏡觀察、分子生物學(xué)等技術(shù)。與血清學(xué)、電鏡觀察等手段相比，RT-PCR和RT-qPCR等分子生物學(xué)方法靈敏度較高、特異性較強(qiáng)，是TZSV檢測最常用的方法，但在日常病害診斷中耗時(shí)長、操作繁瑣且受限于高精度的實(shí)驗(yàn)儀器。本研究根據(jù)TZSV的核衣殼蛋白Ⅳ基因設(shè)計(jì)引物，建立了TZSV的RT-LAMP檢測技術(shù)，具有操作簡便、特異性和靈敏度高、反應(yīng)時(shí)間短、無需貴重儀器等優(yōu)點(diǎn)，擴(kuò)增產(chǎn)物既可凝膠電泳檢測，也可依據(jù)顏色變化可視化判定，為生產(chǎn)及科研單位快速診斷TZSV提供了技術(shù)支持。

特異性是檢測RT-LAMP技術(shù)最為重要的指標(biāo)之一。TZSV是茄科作物上的重要病原菌，與正番茄斑萎病毒屬（Orthotospovirus）代表種TSWV同為云南地區(qū)蔬菜上的優(yōu)勢(shì)病毒，常交替或同時(shí)發(fā)生。李戰(zhàn)彪等報(bào)道了基于TZSV-RdRp的RT-LAMP檢測方法，但未明確其是否能特異性區(qū)分TZSV與TSWV。本研究以TZSV-N為靶標(biāo)基因設(shè)計(jì)篩選了其RT-LAMP特異性引物，有效擴(kuò)增到TZSV，未擴(kuò)增到TSWV，表現(xiàn)出較高的特異性。

通常，RT-LAMP檢測的靈敏度要高于普通RT-PCR。本研究建立的TZSV RT-LAMP方法RNA濃度檢測下限為0.01 pg/uLL，是RT-PCR靈敏度的10倍，也略高于基于TZSV-RdRp的RT-LAMP方法。此外，由于TZSV侵染引起的病癥存在低溫隱癥現(xiàn)象，給病害的診斷造成一定困難。本研究對(duì)秋冬季采自云南的6份辣椒葉片疑似病樣進(jìn)行鑒定，檢測結(jié)果與RT-PCR一致，表明建立的RT-LAMP檢測技術(shù)對(duì)隱癥或病毒含量較低的樣品也可有效檢測。

綜上，本研究建立的TZSV-N基因的RT-LAMP檢測方法能夠特異擴(kuò)增TZSV，靈敏度為RT-PCR的10倍。在RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物中加入SYBR Green I核酸熒光染料用肉眼觀察即可判斷樣品是否感染TZSV．該結(jié)論可為TZSV的鑒定及防控提供技術(shù)支持。