高分辨率基因組對家禽現(xiàn)代育種的挑戰(zhàn)

郭其新，胡亦舟，白 皓，常國斌

（揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚州 225009）

在過去的幾十年里，動物基因組學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)從一門尋求首次了解生命之樹基因組序列的學(xué)科轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€致力解釋組裝全球所有生物的基因組序列，同時從一個只要求全力解決動物線性基因組的方法發(fā)展為從多維度解決基因組序列間的空間關(guān)系。第一個動物基因組序列于25 年前發(fā)表[1]。97Mb 的秀麗隱桿線蟲基因組組裝開創(chuàng)了動物基因組生物學(xué)的新時代，可以在基因組規(guī)模上研究遺傳模式和過程，并于2004 年完成人類第一個基因組組裝。隨著越來越多樣化的物種基因組組裝不斷積累，我們對基因組如何變化和塑造地球生物多樣性的了解也越來越豐富[2]?；蚪M質(zhì)量的重大轉(zhuǎn)變是由兩個關(guān)鍵事件推動的。首先，高通量（一次對幾十萬到幾百萬條核酸分子進行序列測定）、短讀長（每條read 的長度在35～700bp）測序的發(fā)明提供了一種經(jīng)濟手段，為任何可以獲得足夠DNA 的物種生成數(shù)百萬個讀長，這些約100bp 的短讀段可以組裝成有用的（盡管是碎片化的）基因組組件[3]。其次，長讀長測序的興起使得在同樣花費的基礎(chǔ)上增加讀長成為可能，這些讀長通常比短讀長長幾個數(shù)量級，從而產(chǎn)生更加連續(xù)的基因組組裝。截至2021 年6月，已對3278 種動物的核基因組進行了測序，并在美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）Gen-Bank 數(shù)據(jù)庫中公開了組裝結(jié)果[4,5]。家禽作為全球重要的肉類和蛋類來源，對家禽基因組進行測序可能有益于家禽生產(chǎn)實踐、家禽健康和福利，也有利于我們了解動物不同表型的遺傳基礎(chǔ)，同時進一步加速了家禽育種目標(biāo)的實現(xiàn)。除了這些更具應(yīng)用性的研究領(lǐng)域之外，基因組測序還讓我們了解了這些物種和相關(guān)物種的進化途徑。近年來，隨著高分辨率基因組的組裝，從多維度解析家禽表型的遺傳基礎(chǔ)成為可能，但同樣對家禽的現(xiàn)代育種技術(shù)提出了新的挑戰(zhàn)。

1 測序技術(shù)的革命性發(fā)展促使基因組質(zhì)量提高

1.1 線性基因組

DNA 測序是一個快速發(fā)展的領(lǐng)域，技術(shù)和平臺正在以驚人的速度更新。Sanger 和哈佛大學(xué)科學(xué)家Allan Maxam 和Walter Gilbert 獨立推出了自己的DNA 測序方法，徹底改變并促進了基因組學(xué)發(fā)展[6]。其主要采用DNA 復(fù)制原理。Sanger 測序反應(yīng)體系中包括目標(biāo)DNA 片段、脫氧三磷酸核苷酸（dNTP）、雙脫氧三磷酸核苷酸（ddNTP）、測序引物及DNA 聚合酶等。測序反應(yīng)的核心就是其使用的ddNTP：由于缺少3'-OH基團，不具有與另一個dNTP 連接形成磷酸二酯鍵的能力，這些ddNTP 可用來中止DNA 鏈的延伸。此外，這些ddNTP 上連接有放射性同位素或熒光標(biāo)記基團，因此可以被自動化的儀器或凝膠成像系統(tǒng)所檢測到。此后，該測序手段用于人類的第一個基因組序列以及人類健康關(guān)鍵模型（如大鼠和小鼠）的高質(zhì)量基因組草圖[7,8]，同時也完成小鼠基因組計劃近交實驗室C57BL/J6 品系測序。然而，該測序方法仍然是一個昂貴的工作（每兆堿基序列約1000 美元）。新的短讀長測序技術(shù)（SRS）和平臺不斷發(fā)展，包括ABI SOLiD[9]、Roche 454[10]和Illumina[11]。這些技術(shù)在成本、樣本輸入、讀取長度和錯誤率方面都有其優(yōu)缺點。隨后，Illumina 利用雙端測序方法完成了狗[12]、馬[13]、牛[14]、獼猴[15]、負(fù)鼠[16]和雞[17]等物種基因組序列組裝。雖然這些基因組極大促進了這些物種的發(fā)展，但這些物種的基因組中存在大量的空白序列無法組裝，這主要是由于測序讀長較短和連續(xù)性較低導(dǎo)致。認(rèn)識到長讀長和連續(xù)性對基因組草圖的重要性。基因組組裝的新技術(shù)[18]（如Dovetail 的鄰近連接）和長讀長測序技術(shù)（long-read sequencing，LRS），如PacBio 的單分子實時（single molecule real time sequencing，SMRT）[19]、Chromium 10x[20]、Oxford Nanopore技術(shù)[21]和Bionano 基因組作圖技術(shù)[22]的發(fā)展。為了進一步獲得高質(zhì)量的基因組，通過分別組合SRS 和LRS 以及組裝工具生成不同的組裝策略對當(dāng)時黃金標(biāo)準(zhǔn)基因組的改進，如人類構(gòu)建的GRCh38 使用Bionano 等光學(xué)繪圖儀來確認(rèn)組裝和細(xì)化單倍型[23]；此外，高覆蓋度虎皮鸚鵡（Melopsittacus undulatus）基因組是使用多種測序技術(shù)生成的[24]，包括SRS（Roche 454 和Illumina）和LRS（PacBio）及類似的de novo 山羊（Capra hircus）參考基因組是結(jié)合PacBio、Illumina 和Bionano 方法生成了迄今為止最連續(xù)的哺乳動物基因組之一，但依然缺乏類似于著絲粒等復(fù)雜區(qū)域的序列信息。為了填補基因組中缺乏的著絲粒等位置的序列，科學(xué)家們設(shè)計了一種基于轉(zhuǎn)座酶結(jié)合BAC 文庫的方案，使用納米孔測序（MinION 測序技術(shù)）產(chǎn)生BAC 文庫DNA 的高讀數(shù)覆蓋。如在轉(zhuǎn)座酶中用單個切割位點線性化圓形BAC 并添加測序接頭，從而實現(xiàn)整個插入片段的完整、端到端序列覆蓋，這使得完整測序著絲粒序列成為可能。在此基礎(chǔ)上，科學(xué)家們近年來完成了人[25-27]、雞[28]以及魚[29]等動植物的完整端粒到端粒的完整基因組（T2T）。

1.2 泛基因組

隨著大規(guī)?；蚪M研究的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)單一參考基因組模式無法代表物種水平的遺傳多樣性。畜禽往往具有復(fù)雜的起源和遷徙路線，這表明當(dāng)前參考基因組中可能遺漏了一些種群特異性序列。相反，泛基因組是一個物種所有DNA 序列的集合，包含所有個體共享的序列（核心基因組），并且還能顯示每個個體獨有的序列信息（可變基因組）。人類、植物和家畜泛基因組研究進展表明，通過泛基因組研究可以探索缺失的遺傳成分和大結(jié)構(gòu)變異（SV）的識別。許多個體特異性序列已被證明與生物適應(yīng)性、表型和重要的經(jīng)濟性狀相關(guān)。泛基因組可以在分析單個參考基因組的基礎(chǔ)上補充缺失的遺傳信息，挖掘隱藏的遺傳變異，展示物種水平上真正的遺傳多樣性[30-32]。此外，許多研究表明，以泛基因組為參考，可以顯著提高讀段映射率、轉(zhuǎn)錄組比對效率以及一些罕見和大變異的檢出率[32-34]。此外，泛基因組研究的一個重要組成部分是檢查新發(fā)現(xiàn)的基因的生物學(xué)功能。泛基因組可以識別通常屬于非核心基因組的非參考序列，并且可能對生物體的適應(yīng)性產(chǎn)生重要影響[35]。因此，分析它們在個體中的分布以及所包含基因的功能可以更好地了解物種對極端環(huán)境的適應(yīng)。構(gòu)建真核生物的全基因組必須考慮基因組內(nèi)的所有DNA 序列，才能真正發(fā)揮全基因組的參考對象作用。由于測序技術(shù)、成本和基因組復(fù)雜性等限制，真核全基因組研究起步晚于原核全基因組。直到2009 年，基于人類基因組計劃[36]和多個參考基因組組裝完成[37-39]，泛基因組才被應(yīng)用于人類基因組學(xué)研究。動植物泛基因組研究從2013 年才逐步開展。最近有兩個關(guān)于雞泛基因組的研究，第一個是使用迭代作圖和組裝方法構(gòu)建的，使用了664 個個體的WGS 數(shù)據(jù)和參考基因組構(gòu)建的泛基因組，基于該泛基因組鑒定了參考基因組(GRCg6a)中不存在的約66.5Mb 編碼4063 個高可信度基因序列，通過鑒定了大量的存在/ 不存在變異（PAV）變異，基于PAV 的全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)了許多與生長、胴體成分、肉質(zhì)或生理性狀相關(guān)的候選突變。其中，IGF2BP1 啟動子區(qū)域的缺失影響雞體大小[40]；另外一個是通過組裝世界范圍內(nèi)20 個代表物種的基因組構(gòu)建的一個雞的泛基因組，該泛基因組主要利用20 個高測序深度從頭組裝的基因組構(gòu)建了來自世界范圍內(nèi)的雞泛基因組，并鑒定了GRCg6a 中未發(fā)現(xiàn)的1,335 個蛋白質(zhì)編碼基因和3011 個長非編碼RNA[41]。這些研究挖掘了一些新的遺傳變異，為解析表型提供了新的思路，在一定程度上為家禽育種提供了一些新的見解。

1.3 3D 基因組

3D 基因組是指基因組在空間和時間上的折疊方式，這是一個在生物學(xué)領(lǐng)域備受關(guān)注的問題。通過開發(fā)一系列前所未有的高分辨率方法，如染色質(zhì)構(gòu)象捕獲、高分辨率光學(xué)和電子顯微鏡等技術(shù)，我們對基因組架構(gòu)和功能有了全新的認(rèn)識。眾所周知，人類DNA 長2m，這種DNA 如何經(jīng)歷巨大的壓縮以適應(yīng)細(xì)胞核的微小空間（直徑約20μm）一直是細(xì)胞生物學(xué)的主要謎團之一。核小體的重復(fù)單元（146bp 的DNA 包裹在組蛋白核心八聚體周圍）組織成10nm 的 “串珠”[42]。然而，需要進一步壓縮以使DNA 適合細(xì)胞核。長期存在的模型假設(shè)染色質(zhì)以分層方式折疊成更高階的結(jié)構(gòu)，其中包括通過連接組蛋白H1 將10nm 纖維折疊成30nm 纖維，然后折疊成更大的結(jié)構(gòu)[43,44]。組蛋白除了壓縮DNA 之外，還可以通過對其尾部進行翻譯后修飾來主動控制基因表達，從而共同生成表觀遺傳 “組蛋白密碼”[45]。特定的組蛋白 “標(biāo)記” 與基因組的活躍區(qū)域和沉默區(qū)域相關(guān)，因此被認(rèn)為會產(chǎn)生不同水平的染色質(zhì)壓縮和高階結(jié)構(gòu)。也就是說，基因組的一部分似乎包含未修飾的組蛋白[46,47]，并且抑制性組蛋白標(biāo)記有時也可以在活性啟動子中找到[48]，強調(diào)需要更好的工具來可視化和繪制組蛋白標(biāo)記、基因組之間的精確關(guān)系、結(jié)構(gòu)和功能。常染色質(zhì)、異染色質(zhì)和細(xì)胞核中個體染色體區(qū)域的假說的重提[49,50]以及熒光原位雜交（FISH）的新型成像技術(shù)的發(fā)展使得染色體區(qū)域假說最終得到驗證。隨著新的成像和基因組技術(shù)的出現(xiàn)，推動了核結(jié)構(gòu)研究[51-53]。同時，F(xiàn)ISH 方法證明了染色體區(qū)域和區(qū)域邊緣染色體混合的存在，也表明富含活性基因的染色體區(qū)域主要位于核內(nèi)部，而富含非活性基因的染色體區(qū)域主要位于核外圍[54-63]。在此基礎(chǔ)上，綜合全基因組測序（Whole Genome Sequencing，WGS）、RNA-seq、Hi-C 等技術(shù)，解析北京鴨的三維基因組空間構(gòu)象[64]以及利用Hi-C 技術(shù)對水稻染色質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)進行了全基因組解析[65,66]。3D基因組揭示了基因組在超分辨率和活細(xì)胞成像下的組織結(jié)構(gòu)，為我們提供了基因組功能的新視角，發(fā)現(xiàn)一些以前沒有發(fā)現(xiàn)的基因組空間結(jié)構(gòu)層次的變異。同時，這種高分辨率成像也挑戰(zhàn)了我們對基因組的傳統(tǒng)理解，推動了科學(xué)界對基因組認(rèn)識的深化，也為育種技術(shù)提出了新的挑戰(zhàn)。

2 家禽現(xiàn)代育種發(fā)展現(xiàn)狀

2.1 基因組選擇在現(xiàn)代育種中的應(yīng)用現(xiàn)狀

育種是指人類驅(qū)動的培育和增強動物物種的過程，其中涉及干預(yù)其生物進化。在過去的一個世紀(jì)里，育種方法不斷從傳統(tǒng)方法向現(xiàn)代方法發(fā)展以滿足人類的需求。動物馴化始于大約幾千年前，標(biāo)志著動物育種的開始。在這個階段，人們通過目視評估野生動物的表型性狀，并根據(jù)需要對其進行馴化。1865 年，孟德爾遺傳定律的發(fā)現(xiàn)標(biāo)志著動物育種傳統(tǒng)時代的開始，當(dāng)時主要的育種技術(shù)是雜交育種等。這一時期的動物育種研究主要集中在雜交和統(tǒng)計分析上，且耗時較長。傳統(tǒng)育種技術(shù)無法精確操縱和選擇特定基因從而導(dǎo)致選育效果較差。分子生物學(xué)的快速進步促進了分子標(biāo)記輔助育種的發(fā)展，它利用分子標(biāo)記來反映個體或群體之間的變異或多態(tài)性。利用這些標(biāo)記來識別雜交后代中的目標(biāo)基因，可以最大限度地減少育種過程中的人類和環(huán)境干擾，并加速整個育種進程。標(biāo)記輔助育種可以同時檢測多個或連鎖基因。但這項技術(shù)需要大量的高質(zhì)量DNA，且價格昂貴。2001 年，Meuwissen 等[67]引入了基因組選擇（GS）。使用訓(xùn)練群體的基因型和表型數(shù)據(jù)構(gòu)建基因組預(yù)測模型，然后利用已知的基因型和表型數(shù)據(jù)預(yù)測候選個體的基因組估計育種值（GEBV）。GS 技術(shù)同時評估多個全基因組標(biāo)記在由基因分型和表型個體組成的訓(xùn)練群體中的作用，從而顯著提高選擇效率。因此，基于GS 的育種仍然是一項具有很大發(fā)展?jié)摿Φ拈_創(chuàng)性技術(shù)。近年來，在牛等動物中開展了一系列開展基因組選擇的報道，如肉牛[68]、奶牛[69]、豬[70]和雞等[71]。對于肉雞，同樣也使用不同模型（如PBLUP、GBLUP 和ssGBLUP）的預(yù)測準(zhǔn)確性和遺傳參數(shù)進行了估計[72-75]。

2.2 基因組編輯技術(shù)在育種中的現(xiàn)狀

過去幾十年內(nèi)，隨著基因組編輯技術(shù)的發(fā)展，使其能對基因組進行精確編輯?；蚪M編輯技術(shù)在家禽業(yè)及整個畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用在過去十年中得到了改善[76]。3 種常用的基因組編輯技術(shù)用于家禽生產(chǎn)，如鋅指核酸酶（ZFN）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶（TALEN）以及成簇規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR）相關(guān)蛋白 9（CRISPR/Cas9）是最常見且最先進的基因組編輯技術(shù)，其中，CRISPR/Cas9 技術(shù)在雞和鵪鶉中的應(yīng)用取得了實質(zhì)性進展，例如，最近的一個研究通過對雞的ANP32 蛋白家族的ANP32A 基因中的N129I 和D130N 氨基酸基因編輯，消除了甲型流感病毒(IAV)的感染和傳播[77]；此外，通過對雞DF-1 細(xì)胞的NHE1 基因的關(guān)鍵氨基酸殘基進行編輯，使得該細(xì)胞獲得對ALV-J 感染的獲得性抗性[78]；與此同時，日本鵪鶉MSTN 中的非移碼突變導(dǎo)致體重和肌肉質(zhì)量顯著增加。使用CRISPR/Cas9 通過基因突變破壞或去除MSTN 會抑制其抗生肌功能，從而導(dǎo)致MSTN 敲除雞的肌肉質(zhì)量增加[79]。CRISPR 技術(shù)并非旨在取代傳統(tǒng)育種系統(tǒng)，而是為育種者提供更多可供選擇的遺傳變異，因為使用傳統(tǒng)育種獲得遺傳增益在向特定種群內(nèi)引入遺傳變異方面存在局限性，使用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)引入遺傳變異可用于改善家禽的性能，在一定程度上加速了育種的進程，實現(xiàn)更高的遺傳進展。

3 家禽高分辨率基因組下現(xiàn)代育種的優(yōu)勢和挑戰(zhàn)

3.1 家禽高分辨率基因組為現(xiàn)代育種帶來的優(yōu)勢

基因組測序計劃完成開啟了遺傳育種研究的新紀(jì)元，但占基因組98%的非編碼區(qū)域功能研究很少，調(diào)控元件注釋也尚不清晰，這嚴(yán)重制約了經(jīng)濟性狀分子機理解析及基因組育種技術(shù)創(chuàng)新。隨著高分辨率基因組組裝以及泛基因組組裝，可以很大程度上促進從多水平（基因組、表觀修飾、轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白等）解析性狀發(fā)生的分子調(diào)控機制和致因基因/ 變異。最近有研究發(fā)現(xiàn)，通過結(jié)合數(shù)量表觀遺傳學(xué)和群體表觀遺傳學(xué)等表觀信息開展基因組選擇發(fā)現(xiàn)表觀遺傳變異能夠解釋65%的表型變異。此外，基于鑒定SNPs 是否位于表觀功能基因組區(qū)域進行分類，將表觀基因組信息引入GFBLUP（genomic feature best linear unbiased prediction）模型，其預(yù)測準(zhǔn)確性相比傳統(tǒng)GBLUP 有所提高。此外，隨著新的成像和基因組測序以及組裝技術(shù)的出現(xiàn)，基因組正以前所未有的細(xì)節(jié)水平可視化，同時結(jié)合基因組選擇，可以最大程度提高育種值估計準(zhǔn)確性。此外通過結(jié)合高分辨率基因組和泛基因組，可以為精確的設(shè)計育種提供更精確的位點調(diào)控信息，為基于基因組編輯技術(shù)構(gòu)建的設(shè)計育種提供幫助。

3.2 家禽高分辨率基因組下現(xiàn)代育種面臨的挑戰(zhàn)

隨著越來越多物種的高分辨率基因組的組裝，在一定程度上為現(xiàn)代育種提供了一定的幫助。但是也為現(xiàn)代育種技術(shù)提出了新的挑戰(zhàn)，主要分為以下幾個方面：①多組學(xué)水平復(fù)雜性狀的解析。雖然目前的高分辨率基因組已經(jīng)可以解釋大多數(shù)性狀的調(diào)控發(fā)生機制以及致因突變，但是目前用于基因組選擇的組學(xué)數(shù)據(jù)均是在組織水平進行。隨著單細(xì)胞和空間表觀組測序發(fā)展，從單細(xì)胞時空水平解析表型的發(fā)生調(diào)控機制和致因突變成為新的方法，但是這也導(dǎo)致從多尺度解析表型發(fā)生機制更為復(fù)雜，如何在多組學(xué)水平解析表型發(fā)生的致因突變是目前現(xiàn)代育種中面臨的新一輪挑戰(zhàn)；②新算法的開發(fā)。在現(xiàn)代高分辨率基因組下，多個尺度（基因組、表觀調(diào)控水平、轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平和蛋白水平）調(diào)控表型形成的變異信息被鑒定，導(dǎo)致需要更強大的算力要求，因此需要開發(fā)一些在不損害準(zhǔn)確性的情況下的壓縮算法，減少算力的消耗，降低計算的時間。此外，隨著越來越多變異信息的加入，目前的算法可能不太適用于多尺度的計算，為了引入更多的基因組信息，為每個水平變異設(shè)置權(quán)重（基于其對表型發(fā)生的貢獻率）可以更高水平的提高現(xiàn)代育種的準(zhǔn)確率。

4 總結(jié)與展望

綜上所述，高分辨率基因組在家禽育種中的研究和應(yīng)用尚處于起步和發(fā)展階段，還有許多挑戰(zhàn)和領(lǐng)域中有待探索和解決的問題，但是已有的研究方法和初步成果為現(xiàn)代家禽育種提出了廣闊的發(fā)展前景。同時隨著家禽高分辨率基因組的不斷完善，家禽重要經(jīng)濟性狀的基因組候選區(qū)域和致因變異為開展家禽現(xiàn)代設(shè)計育種提供了重要的支持。