靛藍提取物中靛藍和靛玉紅的分析方法比較

王成章, 顏洋洋,2, 周 昊, 劉丹陽, 商士斌, 張華興

(1.中國林業(yè)科學研究院 林產化學工業(yè)研究所;江蘇省生物質能源與材料重點實驗室;國家林業(yè)和草原局林產化學工程重點實驗室;林木生物質低碳高效利用國家工程研究中心,江蘇 南京 210042; 2.南京林業(yè)大學 江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京 210037; 3.凱里小生物科技有限公司,貴州 凱里 556000)

植物靛藍提取物(新型青黛)由馬藍、木蘭、蓼藍或菘藍的莖葉發(fā)酵后加工制得[1],富含吲哚生物堿類、核苷類、甾醇類和酚類化合物等物質,主要藥效成分為靛藍和靛玉紅,具有抗氧化、抗菌、消炎、抗病毒、抗癌等多種生物活性[2-3]。靛藍提取物近年來常用于調配復方中藥和治療疾病,具有清熱解毒、抗炎止血、抗衰老、抗癌等作用[4-6]。由于原料和加工工藝的不同,靛藍提取物化學成分種類和含量存在差異[7-8]?！吨腥A人民共和國藥典》[9-10]中關于靛藍含量分析方法有高錳酸鉀法、分光光度法、紫外分光光度法、高效液相色譜法;靛玉紅含量分析方法有薄層色譜法、高效液相色譜法。此外,文獻[11-16]還報道了雙波長紫外分光光度法、磺化-紫外分光光度法、一階導數(shù)紫外分光光度法、單掃描極譜法、循環(huán)伏安法等植物靛藍提取物的分析檢測方法。因此,為了篩選出合適的測定靛藍提取物中靛藍、靛玉紅含量方法,本研究采用鹽酸酸化、葡萄糖還原和乙酸乙酯提取純化分離得到3種靛藍提取物,選用高效液相色譜法、紫外可見分光光度法和雙波長紫外分光光度法3種常用的植物靛藍提取物的分析檢測方法對提取物進行測定,通過方法學考察與統(tǒng)計學分析,比較3種分析方法對3種靛藍提取物測定的差異性,并確定不同樣品的最佳分析方法,以期為不同靛藍含量提取物的快速測定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料、試劑與儀器

靛藍膏(含水量50%～60%)由貴州小生源有限公司提供,經80 ℃烘箱烘干12 h,過0.18 mm篩,制得靛藍粗提物(含水8.42%,靛藍2%～5%,靛玉紅0.034%,質量分數(shù),下同),備用。靛藍和靛玉紅標準品(HPLC≥98%)、甲醇(色譜純)均購于阿拉丁生化試劑有限公司;乙酸乙酯、氫氧化鈉、葡萄糖、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)均為分析純,購于國藥集團化學試劑有限公司;鹽酸(化學純),購于南京化學試劑有限公司。

CBM-10A VP Plus型高效液相色譜儀,日本島津公司;UV-1800型紫外可見分光光度計,上海美譜達有限公司;QUINTIX35-1CN PC型電子天平,德國賽多利斯公司;LXJ-IIB型低速離心機,海安亭科學儀器廠;RE-5LC型旋轉蒸發(fā)儀、DF-101S型恒溫加熱磁力攪拌器,河南省予華儀器有限公司;KH5200E型超聲波清洗器,昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司。

1.2 靛藍提取物的制備

1.2.1靛藍酸化物的制備 參考文獻[9]制備靛藍酸化物:取30 g靛藍粗提物于250 mL錐形瓶內,加入150 mL水,置于80 ℃的恒溫水浴鍋中攪拌均質10 min。然后緩慢分批滴加20%(質量分數(shù),下同)鹽酸水溶液直到反應液pH值為2～3,攪拌反應40 min。離心得下層固體用100 ℃水洗滌至中性并于80 ℃下烘干,即得靛藍酸化物(產率92.31%,含靛藍20.13%,靛玉紅0.26%)。

1.2.2靛藍還原物的制備 參考文獻[11]制備靛藍還原物:取2 g靛藍酸化物置于250 mL錐形瓶,加入100 mL水和3 g氫氧化鈉,置于80 ℃恒溫水浴鍋中攪拌30 min。離心后將下層濾渣轉入錐形瓶中,再加入100 mL水、 3 g氫氧化鈉和2.5 g葡萄糖,瓶口用封口膜密封后于60 ℃恒溫水浴下攪拌反應50 min。反應后離心得上層液體,用氣泵通入空氣2 min,再滴加20%鹽酸至pH值為3～4,再次離心分離,下層沉淀用超純水洗滌至中性,沉淀于80 ℃下烘干,即得靛藍還原物(產率76.88%,含靛藍85%,靛玉紅0.86%)。

1.2.3乙酸乙酯提取物的制備 參考文獻[11]制備靛藍還原物:取20 g靛藍酸化物于500 mL燒杯中,加入200 mL乙酸乙酯超聲波處理30 min。過濾,濾渣用乙酸乙酯重復萃取2次,合并濾液,蒸發(fā)乙酸乙酯溶劑后,80 ℃烘干即得乙酸乙酯提取物(產率66.45%,含靛藍35%,靛玉紅23.16%)。

1.3 靛藍提取物成分及含量分析

1.3.1對照品溶液的制備 分別精確稱取靛藍標準品5 mg、靛玉紅標準品3 mg,置于100 mL棕色容量瓶中,加DMF至刻度線下3～4 cm,超聲波處理使其溶解后定容,作為標準品溶液。

1.3.2供試品溶液的制備 分別精確稱取靛藍酸化物15 mg、靛藍還原物5 mg、乙酸乙酯提取物5 mg置于100 mL棕色容量瓶中,加DMF至刻度線下3～4 cm,超聲波處理使其溶解后定容,作為供試品溶液。

1.3.3HPLC方法學考察 高效液相色譜條件:流動相為甲醇/水,體積比7∶3;色譜柱YMC-AC-ODSA(250 mm×4.6 mm,5 μm),5 000塔板數(shù)柱效;檢測波長600 nm;流速1 mL/min。

線性關系考察:分別精確吸取1、 2、 4、 6、 8 mL靛藍、靛玉紅標準品溶液至10 mL棕色容量瓶中,加DMF稀釋至刻度搖勻。按色譜條件分別進樣,記錄 HPLC 色譜圖。

穩(wěn)定性試驗:分別取靛藍酸化物、靛藍還原物、乙酸乙酯提取物樣品溶液,避光放置。在0、 2、 4、 8、 12、 24 h按色譜條件,分別測試其靛藍、靛玉紅含量。精密度試驗:取20 mg/L靛藍和18 mg/L靛玉紅標準品溶液,分別測定標準品溶液中靛藍、靛玉紅濃度,連續(xù)進樣6次。重復性試驗:取同一種供試品粉末精確稱量,共6份,制備供試品溶液,分別測試其靛藍、靛玉紅含量。加樣回收率試驗:取已知含量靛藍酸化物、靛藍還原物、乙酸乙酯提取物樣品各6份,精確稱取,置于100 mL棕色容量瓶中,分別精確加入0.05 g/L靛藍標準品溶液5 mL,乙酸乙酯提取物樣品再加入0.05 g/L靛玉紅標準品溶液5 mL,加DMF至刻度線下3～4 cm,超聲波處理使其溶解,并用DMF定容。計算靛藍、靛玉紅加樣回收率。

1.3.4紫外可見分光光度法方法學考察 紫外可見分光光度法條件:DMF為空白,在200～800 nm的波段掃描。

線性關系考察:以DMF為空白, 將不同濃度靛藍、靛玉紅標準溶液用分光光度計在200～800 nm的波段進行掃描,由圖譜確定靛藍、靛玉紅最大吸收波長(610 nm和545 nm)。以靛藍、靛玉紅溶液的濃度為橫坐標,靛藍、靛玉紅在其最大吸收波長處吸光度為縱坐標擬合出回歸方程。以DMF為空白,在200～800 nm的波段測定待測樣品溶液的吸收光譜,將兩個最大吸收波長處吸光度值代入回歸方程,分別計算出待測樣溶液中靛藍、靛玉紅的含量。

穩(wěn)定性試驗:以DMF為空白對照,在0、 2、 4、 8、 12、 24 h用紫外分光光度計分別于靛藍、靛玉紅最大吸收波長處測定靛藍酸化物、靛藍還原物、乙酸乙酯提取物樣品溶液,計算得其靛藍、靛玉紅含量。精密度試驗:以DMF為空白,對20 mg/L靛藍和18 mg/L靛玉紅標準品溶液用紫外分光光度計掃描圖譜,重復6次。重復性試驗:取同一種供試品粉末精確稱量,共6份,制備供試品溶液,分別測試其靛藍、靛玉紅含量。加樣回收率試驗:按1.3.3節(jié)中描述的方法進行加樣,用分光光度法測定紫外圖譜,計算回收率。

1.3.5雙波長紫外分光光度法方法學考察 雙波長紫外分光光度法條件與紫外可見分光光度法相同。

線性關系考察:以DMF為空白, 將不同濃度靛藍、靛玉紅標準溶液用分光光度計在200～800 nm的波段進行掃描,由圖譜確定靛藍、靛玉紅最大吸收波長(610 nm和545 nm)。以靛藍、靛玉紅溶液的濃度(c)為橫坐標,靛藍、靛玉紅在波長610 nm或545 nm處吸光度(A)為縱坐標繪制4個標準曲線。根據(jù)Lambert-beer定律:A=Ec[13],由標準曲線得到4個吸光系數(shù)(E)。由于靛藍、靛玉紅的光譜相互重疊,根據(jù)吸光度加和性原理[17]聯(lián)立方程(見式(1)和式(2)),擬合出二元一次方程。

A1=E1c1+E3c2

(1)

A2=E2c1+E4c2

(2)

式中:A1—溶液在靛藍最大吸收波長(610 nm)處的吸光度;c1—靛藍在待測溶液中的質量濃度,mg/L;c2—靛玉紅在待測溶液中的質量濃度,mg/L;A2—溶液在靛玉紅最大吸收波長(545 nm)處的吸光度;E1、E3—靛藍、靛玉紅溶液分別在靛藍最大吸收波長處的吸光系數(shù);E2、E4—靛藍、靛玉紅溶液分別在靛玉紅最大吸收波長處的吸光系數(shù)。

以DMF為空白,在200～800 nm的波段測定待測樣品溶液的吸收光譜,將2個最大吸收波長處吸光度值代入上述二元一次方程,計算出待測樣溶液中靛藍、靛玉紅的含量。

穩(wěn)定性試驗、精密度試驗、重復性試驗和加樣回收率試驗操作均同1.3.4節(jié)。

1.4 分析方法

1.4.1灰分分析 參照2020年版《中華人民共和國藥典》[8]中灰分測定的方法測定靛藍提取物。

1.4.2統(tǒng)計學分析 利用Kolmogorov-Smirnov法[18]檢驗樣品的正態(tài)分布,如果符合正態(tài)分布,測定誤差屬于隨機誤差,用t檢驗[19]考察3種分析方法中兩兩檢測值的差異是否顯著,并利用Bland-Altman偏差圖[20]比較測定結果值的高低,以及通過Spearman法[21]檢驗3種分析方法兩兩測定結果的相關性。

2 結果與討論

2.1 灰分分析

各樣品含灰分及酸不溶灰分如表1所示。由表1可知,靛藍粗提物含灰分49.53%,酸不溶灰分10.58%,兩種灰分差值較大,說明靛藍粗提物中存在大量的CaCO3、Ca(OH)2、石灰等,酸不溶灰分是非石灰類雜質,如SiO2;靛藍酸化物含灰分13.35%,酸不溶灰分5.84%,說明靛藍粗提物經酸化處理后仍有較多無機物雜質;乙酸乙酯提取物含灰分3.93%,酸不溶灰分2.73%,說明乙酸乙酯提取物中無機物含量較少,有機物含量較高。靛藍還原物含灰分僅為1.7%,且酸不溶灰分為1.59%,說明靛藍還原物的主要成分為有機成分,且石灰類雜質已基本除盡。以上數(shù)據(jù)說明靛藍粗提物中大部分成分是灰分,還原法和乙酸乙酯提取法能去除靛藍提取物中絕大部分灰分,且效果較好。

表1 各樣品灰分及酸不溶灰分測定結果

2.2 方法學考察結果分析

2.2.1線性關系 在HPLC法、紫外可見分光光度法、雙波長紫外分光光度法下靛藍和靛玉紅標準品的回歸方程、相關系數(shù)和線性范圍見表2。表2結果顯示,所有回歸方程的相關系數(shù)都不小于0.992,表明這3種方法中靛藍和靛玉紅在所測濃度范圍內進樣濃度(X)與峰面積(Y)呈良好的線性關系。

表2 各成分的線性關系

由表2可知,靛藍在610 nm和545 nm處的吸光系數(shù)分別為68.31和24.50,靛玉紅的則為5.90和38.21,依據(jù)式(1)和式(2)得到雙波長紫外分光光度法測定溶液在610 nm處的吸光度的計算公式:A610=68.31c1+5.90c2,溶液在545 nm處的吸光度的計算公式:A545=24.50c1+38.21c2。

2.2.2精密度 HPLC法測靛藍含量相對標準偏差(RSD)平均值為0.49%,靛玉紅含量RSD平均值為0.44%,表明HPLC法儀器精密度良好;紫外分光光度法測靛藍含量RSD平均值為0.30%,靛玉紅含量RSD平均值為0.37%,表明紫外可見分光光度法儀器精密度良好;雙波長紫外分光光度法測靛藍含量RSD平均值為0.38%,靛玉紅含量RSD平均值為0.32%,表明雙波長紫外分光光度法儀器精密度良好。

2.2.3穩(wěn)定性 用高效液相色譜法測定靛藍、靛玉紅含量時,發(fā)現(xiàn)12 h內靛藍酸化物、靛藍還原物、乙酸乙酯提取物中靛藍質量分數(shù)的RSD分別為1.96%、 0.56%和1.15%,乙酸乙酯提取物中靛玉紅質量分數(shù)的RSD為2.92%。

用紫外可見分光光度法測定靛藍、靛玉紅含量時,發(fā)現(xiàn)12 h內靛藍酸化物、靛藍還原物、乙酸乙酯提取物中靛藍質量分數(shù)的RSD分別為2.05%、 0.73%和0.17%,乙酸乙酯提取物中靛玉紅質量分數(shù)的RSD為0.09%。

用雙波長紫外分光光度法測定靛藍、靛玉紅含量時,發(fā)現(xiàn)12 h內靛藍酸化物、靛藍還原物、乙酸乙酯提取物中靛藍質量分數(shù)的RSD分別為1.95%、 0.54%和0.17%,乙酸乙酯提取物中靛玉紅質量分數(shù)的RSD為0.09%。

以上數(shù)據(jù)表明:樣品溶液在3種分析方法下12 h內穩(wěn)定性良好。

2.2.4重復性 用高效液相色譜法測定靛藍、靛玉紅含量時,靛藍酸化物、靛藍還原物、乙酸乙酯提取物中靛藍質量分數(shù)的RSD分別為2.37%、 0.90%和0.53%,乙酸乙酯提取物中靛玉紅質量分數(shù)的RSD為1.88%。

用紫外可見分光光度法測定靛藍、靛玉紅含量時,靛藍酸化物、靛藍還原物、乙酸乙酯提取物中靛藍質量分數(shù)的RSD分別為1.36%、 1.05%和5.45%,乙酸乙酯提取物中靛玉紅質量分數(shù)的RSD為1.58%。

用雙波長紫外分光光度法測定靛藍、靛玉紅含量時,靛藍酸化物、靛藍還原物、乙酸乙酯提取物中靛藍質量分數(shù)的RSD分別為1.15%、 1.16%和5.21%,乙酸乙酯提取物中靛玉紅質量分數(shù)的RSD為4.29%。

以上分析表明:靛藍酸化物、靛藍還原物中靛藍和乙酸乙酯提取物中靛玉紅在3種分析方法下重復性較好(RSD≤2%),乙酸乙酯提取物中靛藍在3種分析方法下重復性較差(RSD>5%)。

2.2.5加樣回收率 用高效液相色譜法測定靛藍、靛玉紅含量的加樣回收率,靛藍酸化物、靛藍還原物、乙酸乙酯提取物中靛藍平均加樣回收率及其RSD分別為98.45%、 98.45%、 106.14%和4.64%、 1.04%、 2.73%,乙酸乙酯提取物中靛玉紅平均加樣回收率及其RSD分別為95.7%和1.08%。 數(shù)據(jù)表明:靛藍酸化物中靛藍平均加樣回收率一般,靛藍還原物、乙酸乙酯提取物中靛藍平均加樣回收率和乙酸乙酯提取物中靛玉紅平均加樣回收率較好。

用紫外可見分光光度法測定靛藍、靛玉紅含量的加樣回收率,靛藍酸化物、靛藍還原物、乙酸乙酯提取物中靛藍平均加樣回收率及其RSD分別為99.03%、 95.44%、 96.93%和2.90%、 2.51%、 2.27%,乙酸乙酯提取物中靛玉紅平均加樣回收率及其RSD分別為95.43%和2.51%。數(shù)據(jù)表明: 3種樣品溶液中靛藍和乙酸乙酯提取物中靛玉紅平均加樣回收率均較好。

用雙波長紫外分光光度法測定靛藍、靛玉紅含量的加樣回收率,靛藍酸化物、靛藍還原物、乙酸乙酯提取物中靛藍平均加樣回收率及其RSD分別為102.93%、 96.14%、 94.19%和4.09%、 2.12%、 1.71%,乙酸乙酯提取物中靛玉紅平均加樣回收率及其RSD分別為98.18%和3.45%。數(shù)據(jù)表明:靛藍酸化物中靛藍平均加樣回收率和乙酸乙酯提取物中靛玉紅平均加樣回收率一般,靛藍還原物和乙酸乙酯提取物中靛藍平均加樣回收率較好。

2.3 統(tǒng)計學試驗結果分析

2.3.1靛藍酸化物數(shù)據(jù)分析 通過3種分析方法分析不同靛藍酸化物中靛藍含量,經Kolmogorov-Smirnov檢驗,HPLC法、紫外可見分光光度(UV)法和雙波長紫外分光光度(dW-UV)法的置信概率(P)分別為0.31、 0.37、 0.11,這3組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布。兩兩比較的差值配對t檢驗結果為PHPLC vs UV<0.01,PHPLC vs dW-UV<0.01,PUV vs dW-UV<0.01,數(shù)據(jù)表明這3種分析方法兩兩之間存在顯著差別。通過Bland-Altman偏差圖比較兩種分析方法測定結果的均值(圖1),結果顯示:UV法較HPLC法高1.44%(差值的平均值與差值的95%置信區(qū)間(95%CI):-2.83%～-0.045%);dW-UV法較HPLC法高5.73%(95%CI:-13.64%～2.19%);UV法較dW-UV法低4.29%(95%CI:-11.54%～2.96%)。

a.HPLC vs UV; b.HPLC vs dW-UV; c. UV vs dW-UV

Spearman檢驗考察兩兩不同方法測定結果的相關性:YUV=1.043XHPLC+0.413(R=0.989,P<0.001);YdW-UV=1.26XHPLC-0.519(R=0.899,P<0.001);YdW-UV=1.21XUV-1.509(R=0.890,P<0.001)。

Bland-Altman和Spearman檢驗結果說明:靛藍酸化物的HPLC法和UV法測量數(shù)據(jù)兩兩之間存在不一致性(不是所有測量數(shù)據(jù)均介于95%置信區(qū)間范圍內),HPLC法和dW-UV法測量數(shù)據(jù)兩兩之間具有一致性,UV法和dW-UV法測量數(shù)據(jù)兩兩之間具有一致性。

2.3.2靛藍還原物數(shù)據(jù)分析 通過3種分析方法分析不同靛藍還原物中靛藍含量,經Kolmogorov- Smirnov檢驗,HPLC法、UV法和dW-UV法的P分別為0.16、 0.20和0.10, 3組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布。兩兩比較的差值配對t檢驗結果(PHPLC vs UV<0.01,PHPLC vs UV<0.01,PUV vs dW-UV<0.01)表明3種分析方法兩兩之間存在顯著差別。利用Bland-Altman偏差圖比較兩種方法測定結果均值的高低(圖2),結果顯示:UV法較HPLC法低1.17%(95%CI:-3.20%～5.54%);dW-UV法較HPLC法高2.46%(95%CI:-6.74%～2.18%);UV法較dW-UV法低3.63%(95%CI:-6.16%～-1.11%)。

a.HPLC vs UV; b.HPLC vs dW-UV; c.UV vs dW-UV

Spearman檢驗考察兩兩不同方法測定結果的相關性:YUV=1.053XHPLC-4.919(R=0.907,P<0.001);YdW-UV=1.065XHPLC-2.089(R=0.941,P<0.001);YdW-UV=1.007XUV+3.157(R=0.971,P<0.001)。

Bland-Altman和Spearman檢驗結果說明:靛藍還原物的HPLC法和UV法測量數(shù)據(jù)兩兩之間存在不一致性,HPLC法和dW-UV法測量數(shù)據(jù)兩兩之間具有良好的一致性,UV法和dW-UV法測量數(shù)據(jù)兩兩之間具有不一致性。

2.3.3乙酸乙酯提取物數(shù)據(jù)分析

2.3.3.1靛藍 通過3種分析方法分析不同乙酸乙酯提取物中靛藍含量,經Kolmogorov-Smirnov檢驗,HPLC法、UV法和dW-UV法的P分別為0.20、 0.20和0.20,3組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布。兩兩比較的差值配對t檢驗結果(PHPLC vs UV=0.476,PHPLC vs dW-UV=0.215,PUV vs dW-UV=0.699)表明3種分析方法兩兩之間無顯著差別。利用Bland-Altman偏差圖比較兩種方法測定結果均值的高低(圖3),結果顯示:UV法較HPLC法高0.23%(95%CI:-2.94%～2.49%);dW-UV法較HPLC法高0.30%(95%CI:-2.32%～1.73%);UV法較dW-UV法低0.07%(95%CI:-1.65%～1.51%)。

a.HPLC vs UV; b.HPLC vs dW-UV; c.UV vs dW-UV

Spearman檢驗考察兩兩不同方法測定結果的相關性:YUV=0.973XHPLC+0.541(R=0.967,P<0.001);YdW-UV=1.028XHPLC-0.031(R=0.983,P<0.001);YdW-UV=1.032XUV-0.307(R=0.975,P<0.001)。

Bland-Altman和Spearman檢驗結果說明:乙酸乙酯提取物的HPLC法和UV法測量數(shù)據(jù)兩兩之間、HPLC法和dW-UV法測量數(shù)據(jù)兩兩之間均具有不一致性,UV法和dW-UV法測量數(shù)據(jù)兩兩之間具有良好的一致性。

2.3.3.2靛玉紅 通過3種分析方法分析不同乙酸乙酯提取物中靛玉紅含量,經Kolmogorov-Smirnov檢驗HPLC法、UV法和dW-UV法的P分別為0.20、 0.20和0.20, 3組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布。兩兩比較的差值配對t檢驗結果(PHPLC vs UV<0.01,PHPLC vs dW-UV<0.01,PUV vs dW-UV<0.01)表明3種分析方法兩兩之間存在顯著差別。利用Bland-Altman偏差圖比較兩種方法測定結果均值的高低(圖4),結果顯示:UV法較HPLC法高7.16%(95%CI:-15.61%～1.28%);dW-UV法較HPLC法高1.98%(95%CI:-4.25%～0.29%);UV法較dW-UV法高5.18%(95%CI:-1.37%～11.73%)。

a.HPLC vs UV; b.HPLC vs dW-UV; c.UV vs dW-UV

Spearman檢驗考察兩兩不同方法測定結果的相關性:YUV=1.297XHPLC-1.493(R=0.907,P<0.001);YdW-UV=1.078XHPLC-0.281(R=0.941,P<0.001);YdW-UV=0.824XUV+1.195(R=0.971,P<0.001)。

Bland-Altman和Spearman檢驗結果說明:乙酸乙酯提取物的HPLC法和UV法測量數(shù)據(jù)兩兩之間、HPLC法和dW-UV法測量數(shù)據(jù)兩兩之間、UV法和dW-UV法測量數(shù)據(jù)兩兩之間均具有不一致性。

2.4 分析方法的準確性與實用性評價

2.4.1靛藍酸化物分析方法評價 通過方法學考察與t檢驗結果可知,用于分析靛藍酸化物的3種方法兩兩之間存在顯著差別,HPLC法測量靛藍酸化物重復性一般,RSD為2.37%,加樣回收率一般,加樣回收率范圍在95.04%～110.14%,RSD為4.64%;dW-UV法測量靛藍酸化物,回收率在96.36%～106.08%之間,RSD為4.09%,回收率一般,而UV法測量靛藍酸化物樣品,雖然加樣回收率一般,加樣回收率范圍為95.71%～107.64%,RSD為2.90%,但其精密度、重復性、穩(wěn)定性均良好。因此,針對靛藍酸化物,由于樣品中含有未中和的碳酸鈣等無機雜質,靛藍含量低,采用UV法比dW-UV法和HPLC法更快捷和穩(wěn)定。

2.4.2靛藍還原物分析方法評價 通過方法學考察與t檢驗結果可知,3種方法測量靛藍還原物,精密度、重復性、穩(wěn)定性均良好。HPLC法加樣回收率良好,靛藍加樣回收率在96.88%～99.76%,RSD為1.04%;UV法加樣回收率一般,加樣回收率范圍為:95.71%～107.64%,RSD為2.51%;dW-UV法加樣回收率一般,加樣回收率范圍為:93.51%～99.78%,RSD為2.12%;靛藍還原物中靛藍含量明顯高于靛藍酸化物,碳酸鈣等無機雜質減少,因此,采用HPLC法分析最精準;采用UV法、dW-UV法較為準確,3種方法均可用于分析靛藍還原物中靛藍含量。由于UV法更加便捷快速,所以分析靛藍還原物中靛藍最佳方法為UV法。

2.4.3乙酸乙酯提取物分析方法評價 通過方法學考察與t檢驗結果可知,用于分析乙酸乙酯提取物的3種方法兩兩之間存在顯著差別,HPLC法測量乙酸乙酯提取物中靛藍含量,其精密度、重復性、穩(wěn)定性均良好,加樣回收率一般,加樣回收率范圍為101.20%～109.74%,RSD為2.73%;UV法、dW-UV法精密度、穩(wěn)定性良好,但重復性較差,其RSD分別為5.45%、 5.21%。很明顯,乙酸乙酯提取物中碳酸鈣等無機雜質更少,有機物增多,靛藍含量高。因此,采用HPLC法較好,而UV法、dW-UV法重復性差、不適用。

HPLC法測量乙酸乙酯提取物中靛玉紅含量,其精密度、重復性、加樣回收率均良好。穩(wěn)定性一般,RSD為2.92%;UV法、dW-UV法精密度、穩(wěn)定性均良好,但dW-UV法的重復性較差,其RSD為4.29%,UV法的加樣回收率一般,加樣回收率范圍為90.78%～99.15%,RSD為2.51%。

乙酸乙酯提取物中靛玉紅含量分析適合用HPLC法和UV法。綜合結果可知,分析乙酸乙酯提取物中靛藍、靛玉紅含量的最佳方法為HPLC法。

3 結 論

3.1建立了靛藍酸化物、靛藍還原物以及乙酸乙酯提取物中成分含量的HPLC法、紫外可見分光光度法、雙波長紫外分光光度法3種分析方法,方法學考察結果表明:所建立的3種分析方法的線性關系良好、靈敏度高、穩(wěn)定性好、重復性好、準確度好,是3種可靠的靛藍提取物成分含量分析方法。

3.2通過經Kolmogorov-Smirnov法、t檢驗、Bland-Altman偏差圖和Spearman法等統(tǒng)計學方法對3種靛藍提取物分析方法進行分析,結果表明:HPLC法準確性更高,但是相較于紫外可見分光光度法與雙波長紫外分光光度法耗時更長,更繁瑣;靛藍酸化物中靛藍含量不高,含有較多的碳酸鈣等無機雜質,采用紫外可見分光光度法比雙波長紫外分光光度法和HPLC法更加快捷和穩(wěn)定;3種分析方法均可用于靛藍還原物中靛藍含量的分析,由于靛藍還原物中靛藍含量較高,雜質對靛藍含量分析影響較小,故紫外可見分光光度法更便捷快速;乙酸乙酯提取物中碳酸鈣等無機雜質少,有機物增多,靛玉紅含量高,采用HPLC法較好。