基于DNA 條形碼的棕櫚裸蠓雄蟲的發(fā)現(xiàn)與描述

何澤華，李加慧，林曉丹

（海南大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院/熱帶農(nóng)林生物災(zāi)害綠色防控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海口 570228）

棕櫚裸蠓Atrichopogonpalmatus隸屬于蠓科Ceratopogonidae 鋏蠓亞科Forcipomyiinae 裸蠓屬Atrichopogon[1]，該種雌蟲于1962 年在日本被首次記述[2]，可根據(jù)其腹部第7～9 節(jié)腹面具有特殊的贅生物進(jìn)行鑒別。1990 年劉增加等[3]基于甘肅康縣的雌蟲標(biāo)本命名新種多刺裸蠓（Atrichopogon sentusYu and Qi, 1990），該種后被Liu 等[4]異名為棕櫚裸蠓，但棕櫚裸蠓的雄蟲迄今仍未發(fā)現(xiàn)。經(jīng)海南島裸蠓標(biāo)本整理鑒定發(fā)現(xiàn)了棕櫚裸蠓的雌蟲，形態(tài)學(xué)鑒定為棕櫚裸蠓，并利用DNA 條形碼技術(shù)對(duì)雌、雄個(gè)體進(jìn)行配對(duì)，首次發(fā)現(xiàn)了棕櫚裸蠓雄蟲，并對(duì)該種進(jìn)行描述。

1 材料與方法

研究樣本為2020—2021 年于海南島內(nèi)采集的所有棕櫚裸蠓成蟲酒精標(biāo)本，標(biāo)本處理參照吳小香的方法[5]，對(duì)所有總計(jì)12 頭標(biāo)本進(jìn)行無損形態(tài)DNA 提取，DNA 提取參照天根血液/細(xì)胞/組織基因組DNA 提取試劑盒方法，隨后制成玻片。

DNA 條形碼：以COI（細(xì)胞色素C 氧化酶亞基I）基因作為DNA 條形碼基因，通用引物為L(zhǎng)CO1490: 5′- GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG - 3′和HCO2198: 5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA -3′，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增[6]。擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序參考吳小香的方法[5]并進(jìn)行了一定的改動(dòng)，在原25 μL 體系中，DNA 模板由原來的2 μL 增加至3 μL，ddH2O 減少1μL，PCR 反應(yīng)循環(huán)由原來的35 個(gè)降至30 個(gè)。經(jīng)測(cè)序，最終獲得長(zhǎng)度為658 bp 序列11 條，目前已在 BOLD （http://www.boldsystems.org/index.php）上公開。選擇并下載已公開的5 種裸蠓COI 序列：①稀瘤裸蠓Atrichopogon oedemerarum, GenBank 登錄號(hào)：KJ767872.1；②溫勒裸蠓Atrichopogon winnertzi,GenBank 登錄號(hào)：KT278275.1；③棕色裸蠓Atrichopogon fusculus, GenBank 登錄號(hào)：HQ945252.1；④Atrichopogon infuscus, GenBank 登 錄 號(hào) ：KJ767868.1；⑤Atrichopogon hirtidorsum; Gen-Bank 登錄號(hào)：KT278273.1。利用 MEGA 7.0.14 采用Kimura 雙參數(shù)模型（Kimura-2-Parameter, K2P）計(jì)算種內(nèi)和種間遺傳距離[7]；選擇殘脂庫蠓Culicoides imicola（GenBank 登錄號(hào)：KT307823.1）和臺(tái)灣鋏蠓Forcipomyia taiwana（GenBank 登錄號(hào)：KF528691.1）作為外群，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（phylogenetic tree），并進(jìn)行自舉檢驗(yàn)（Bootstrap=2000）。

形態(tài)學(xué)方法：使用奧林巴斯 SZX16 體視顯微鏡觀察酒精標(biāo)本，并連接CCD（DP72）對(duì)蟲體整體輪廓進(jìn)行拍攝。完成拍攝后，對(duì)蟲體進(jìn)行消化裂解，并在福斯德 XPZ-830BI 連續(xù)變倍體視顯微鏡下進(jìn)行解剖制成玻片標(biāo)本，最后使用生物顯微鏡XSP-12CA 和 CCD（YH5001）對(duì)玻片標(biāo)本進(jìn)行鑒定、測(cè)量和拍攝。利用 Adobe Illustrator CC 2018對(duì)雄性成蟲生殖器進(jìn)行繪制；利用 Photoshop 對(duì)繪圖和照片進(jìn)行排版。形態(tài)術(shù)語及測(cè)量依據(jù)遵循Borkent & Picado 和Felippe-Bauer 的方法，測(cè)量數(shù)據(jù)值在文中的表達(dá)形式為最小值至最大值（平均值，n為測(cè)量標(biāo)本數(shù)）[8 - 9]。

形態(tài)術(shù)語縮寫如下，觸角比（AR）：雄蟲觸角鞭節(jié)10 ～ 13 節(jié)總長(zhǎng)與1 ～ 9 節(jié)總長(zhǎng)的比值，雌蟲觸角鞭節(jié)9 ～ 13 節(jié)總長(zhǎng)與1 ～ 8 節(jié)總長(zhǎng)的比值；觸須比（PR）：觸須第3 節(jié)長(zhǎng)與其寬的比值；前緣脈比（CR）：從翅弓脈開始至前緣脈末端總長(zhǎng)與從弓脈至翅末端緣總長(zhǎng)的比值；跗節(jié)比（TR）：各足第1 跗節(jié)與第2 跗節(jié)的長(zhǎng)度比值，前足跗節(jié)比（TRI）、中足跗節(jié)比（TRⅡ）、后足跗節(jié)比（TRⅢ）。

2 結(jié)果與分析

2.1 棕櫚裸蠓雌、雄蟲的配對(duì)測(cè)序獲得雄性個(gè)體CO I 序列7 條，雌性個(gè)體CO I 序列4 條（GenBank 登錄號(hào)：OQ413720-OQ413730），序列長(zhǎng)度為658 bp，該種種內(nèi)遺傳距離為 0.000～0.005，平均遺傳距離為0.002，種間遺傳距離為0.148～0.206，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）與圖不一致顯示測(cè)序的所有個(gè)體聚為支持率100%的單系，說明雌雄同種，均為棕櫚裸蠓。

圖1 根據(jù)CO I 序列所建裸蠓屬系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 棕櫚裸蠓AtrichopogonpalmatusTokunaga,1962 （海南新紀(jì)錄）Atrichopogon palmatusTokunaga, 1962: 160; Liu et al. 2001: 136; Yu et al.2005: 455[1- 2,4]. 模式產(chǎn)地：日本（沖繩）

Atrichopogon sentusYu e Liut , 1990: （218）;Liu et al. 2001: 136[3-4]. 模式產(chǎn)地：中國(guó)（甘肅）

鑒別特征：中小型棕黃色蠓種；復(fù)眼遍布柔毛；小盾片后緣有粗鬃2 根；翅面無大毛；雄蟲爪尖分叉，雌蟲爪尖無分叉；雄蟲陽基側(cè)突拱橋狀，端部1/2 覆有縱皺的膜，頂端有延伸，陽莖中葉基部與陽基側(cè)突基部重合；雌蟲受精囊卵形或橢圓形，第7 腹板中央有1 個(gè)棕櫚樹狀突起，第8 腹節(jié)腹面有2 對(duì)翼狀突，第9 腹節(jié)兩側(cè)各有一長(zhǎng)辮狀突起。

雄成蟲（圖2-A）翅長(zhǎng)1.02～1.14（1.08，n=6）mm；翅寬0.38～0.40（0.39，n=6）mm

圖2 棕櫚裸蠓 Atrichopogon palmatus Tokunaga, 1962 ♂

頭：棕黃色（圖2-B）。頭寬與喙長(zhǎng)比為2.22～2.55（2.38，n=7）。兩復(fù)眼間距與小眼直徑近乎相等（圖2-C），小眼面間柔毛遍布整個(gè)復(fù)眼。觸角棕色，鞭節(jié)2～10 節(jié)上著生輪毛；鞭節(jié)第10～13 節(jié)延長(zhǎng)，第10 節(jié)延長(zhǎng)程度最低；第13 節(jié)延長(zhǎng)程度最高，端突明顯，觸角比（AR）0.87～1.03（0.95，n=7 ）。觸須5 節(jié)，棕色，第3 節(jié)最長(zhǎng)，呈柱狀，中部有感覺器窩；第5 節(jié)呈錐狀，端鈍，觸須比（PR）2.42～2.77（2.56，n=7）。

胸：中胸背板棕黃色，鬃毛稀疏，肩部及兩側(cè)緣色淡，中間有兩條平行淡色帶從端部向基部延伸，基部有兩個(gè)對(duì)稱淡色斑，呈“八”字；側(cè)面色淡，側(cè)背片具1 根剛毛；小盾片黃色，具2 根鬃毛，2～5 根剛毛；后小盾片較小盾片顏色略深。翅面無大毛分布，中脈叉有柄；第2 徑室長(zhǎng)/第1 徑室長(zhǎng)為1.14～1.81（1.45，n=6）；CR 0.60～0.62（0.61，n=6）（圖2-D）。平衡棒淺棕色。各足均為淺棕色，TRI 3.14～3.84（3.49，n=7）； TRⅡ 2.91～3.25（3.12，n=7）；TRⅢ 2.70～2.97（2.85，n=7），后足脛端鬃7～8 根，爪端分叉。

腹：淺棕色。背板顏色較腹板深。尾器（圖2-E）：第9 背板后緣弧形，尾須耳狀，著生于第9 背板腹面兩側(cè)，不超出第9 背板；第9 腹板后緣兩側(cè)與抱握基節(jié)銜接處呈弧形淺凹，中間則呈半圓形凹陷，沿中間凹緣有一列弧形排布的鬃毛。抱握基節(jié)細(xì)長(zhǎng)，長(zhǎng)于第9 背板，基部?jī)?nèi)側(cè)有三角形腹踝，與陽基側(cè)突基部接近，踝突短小，呈倒錐狀，抱握端節(jié)基部2/3 寬而端部1/3 細(xì)（圖2-F）。陽基側(cè)突拱橋狀，表面覆有一層布有縱紋的膜結(jié)構(gòu)，外緣折疊且硬化，端鈍且硬化程度略低，上著有一層透明片狀結(jié)構(gòu)；陽莖中葉與陽基側(cè)突基部愈合，腹面近端部有開口，中突指狀，背面中部縱向開口。（圖2-G）。

雌成蟲（圖3-A）， 翅長(zhǎng) 0.95～1.11（1.01，n=5）mm；翅寬 0.42～0.47（0.44，n=5）mm。 體型及顏色與雄蟲相似。頭寬與喙長(zhǎng)比為 1.77～2.00（1.90，n=5）（圖3-B）。觸角棕色，鞭節(jié)1～8 節(jié)近乎球形，鞭節(jié)9～13 節(jié)為延長(zhǎng)節(jié)；端節(jié)末端端突明顯，呈劍狀，AR 1.62～1.78（1.68，n=5）。觸須PR 2.31～2.69（2.56，n=4）。大顎發(fā)達(dá)，大顎齒11～14 枚。小盾片上的剛毛數(shù)為2～7 根。翅較雄蟲寬，翅面無大毛；第2 徑室長(zhǎng)/第1 徑室長(zhǎng)為 1.83～2.25（2.13n=5）；CR 0.65～0.68（0.66n= 5）（圖3-C）。各足顏色與雄蟲一致，TRI 2.93～3.52 （3.23n=5）；TRⅡ 3.25～3.59（3.44n=5）；TRⅢ 2.70～3.19（2.94n=5），后足脛端鬃7～9 根，爪端無分叉。腹部顏色與雄蟲相似，受精囊1 個(gè)，橢圓形 （0.06～0.09）mm×（0.05～0.06） mm，有頸，基部有刻點(diǎn)（圖3-E）。第7 腹板中央有1 個(gè)棕櫚樹狀突起，其上有約20 條枝突，第8 腹節(jié)腹板有2 對(duì)翼狀突，靠側(cè)緣的翼狀突基部有若干鬃毛，中間的翼狀突由4～5 根粗刺由長(zhǎng)至短并排組成，第9 腹節(jié)兩側(cè)各有1 個(gè)長(zhǎng)辮狀突起（圖3-D）。

圖3 棕櫚裸蠓 Atrichopogon palmatus Tokunaga, 1962♀

檢視標(biāo)本：標(biāo)本7♂4♀來自海南省瓊中縣黎母山國(guó)家森林公園，其中，2♀2♂，黎母山林間（19.1731°N/109.7310°E，H 663 m），為吳小香、何澤華于2020-11-20 燈誘獲得，標(biāo)本編號(hào)：Atr143、Atr143-1、Atr146、Atr146-1；1♂，黎母山村落溪水邊（19.1743°N/109.7324°E，H 686 m），為吳小香、何澤華于2020-11-20 燈誘獲得，標(biāo)本編號(hào)：Atr31；1♀，黎母山主峰路口（19.1753°N/109.7427°E，H 647 m），為吳小香、何澤華于2020-11-20 燈誘獲得，標(biāo)本編號(hào)：Atr93；1♀，黎母山（19.1742°N/109.7431°E，H 646 m），為何澤華于2020-11-19 燈誘獲得，標(biāo)本編號(hào)：Atr136；4♂，黎母山森林公園（19.1774°N/109.7427°E，H 686 m），為吳小香、何澤華于2020-11-21 燈誘獲得，標(biāo)本編號(hào)：Atr113、Atr113-1、Atr113-2、Atr114。標(biāo)本1♀來自海南省文昌市八門灣上圮村紅樹林內(nèi)（19.4527°N/110.7440°E，H 5 m），為鄧斌于2021-11-18 網(wǎng)捕獲得，標(biāo)本編號(hào)：Atr221。

國(guó)外分布：日本[2]

國(guó)內(nèi)分布：甘肅[3]、海南。

3 討 論

棕櫚裸蠓隸屬于裸蠓屬多贅（Psilokempia）類群[10-11]，雄蟲與琴形裸蠓Atrichopogon lyratusYu et Yan, 2005 的尾器形態(tài)特征相似[1]，但棕櫚裸蠓第9 背板后緣呈弧形、尾須的著生位置以及復(fù)眼相離可區(qū)別于琴形裸蠓。

棕櫚裸蠓雌蟲腹部具有特殊的贅生物，而雄蟲缺少上述特征，僅通過形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行雌、雄配對(duì)較為困難?；贑O I 條形碼，棕櫚裸蠓的種內(nèi)遺傳距離為0.000～0.012，符合蠓科種內(nèi)差異范圍0.000～0.040[12-13]，遠(yuǎn)小于裸蠓種間遺傳距離0.148。通過DNA 條形碼技術(shù)實(shí)現(xiàn)了棕櫚裸蠓雌、雄個(gè)體的配對(duì)，首次描述了棕櫚裸蠓的雄性個(gè)體。

全世界目前已記錄裸蠓513 現(xiàn)生種[14]，中國(guó)記錄92 種[1,15 -20]，而有相當(dāng)一部分種類是僅有雌蟲或雄蟲的記錄。DNA 條形碼技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)不同性別個(gè)體配對(duì)，有助于加速單性別的裸蠓物種缺失性別的發(fā)現(xiàn)。

致謝：感謝吳小香在繪圖及排版方面給予幫助。