香蕉枯萎病菌候選效應(yīng)蛋白FoSSP20 的鑒定和功能初探

王 田，符俐盈，趙 陽(yáng)，劉 爽，張玉芳，陳代朋，鄭 麗

（海南大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院/熱帶農(nóng)林生物災(zāi)害綠色防控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?570228）

香蕉（Musaspp.）在亞非拉等不發(fā)達(dá)地區(qū)不僅是主要食物來(lái)源，而且是重要的經(jīng)濟(jì)支柱[1]。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織統(tǒng)計(jì)，我國(guó)香蕉產(chǎn)量占全球總產(chǎn)量的10%左右，僅次于印度[2]。由香蕉枯萎病菌（Fusariumoxysporumf. sp.cubense,Foc）引起的香蕉枯萎病是一種嚴(yán)重危害香蕉生產(chǎn)的土傳病害。根據(jù)Foc菌株對(duì)宿主的毒力差異，F(xiàn)oc可分為4 個(gè)生理小種，F(xiàn)ocrace1、Focrace2、Focrace3 和Focrace4（Foc1,Foc2,Foc3andFoc4），其中Foc4可細(xì)分為FocTR4（tropical race 4）和FocSTR4（subtropical race 4）[3]。Foc1能侵染大多數(shù)三倍體香蕉（Musaspp., AAA 和Musaspp., AAB），如栽培品種“Gros Michel”等[4]。20 世紀(jì)50 年代，由Foc1引起的香蕉枯萎病大面積爆發(fā)，使“Cros Michel”香蕉（Musaspp., AAA）大量死亡，種植園絕收，對(duì)當(dāng)時(shí)的香蕉產(chǎn)業(yè)造成了毀滅性的打擊[5]。“Cavendish”香蕉開(kāi)始替代“Cros Michel”香蕉，貢獻(xiàn)了50%全球產(chǎn)量和99%的出口市場(chǎng)，而毒性更強(qiáng)的FocTR4 能侵染“Cavendish”香蕉和大多數(shù)重要的栽培品種，并在世界各地廣泛傳播，對(duì)現(xiàn)在的香蕉產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重破壞[6]。

在植物與病原菌長(zhǎng)期的協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中，植物建立起了能有效抵御病原微生物的先天免疫系統(tǒng)（innate immune system），當(dāng)植物遭受病原菌侵染時(shí)，免疫系統(tǒng)能特異識(shí)別信號(hào)分子從而激活植物自身免疫應(yīng)答[7]。先天免疫系統(tǒng)包括2 個(gè)不同的層面。第1 層免疫系統(tǒng)是由位于植物細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors, PRRs）識(shí)別并結(jié)合病原微生物的病原或微生物相關(guān)分子模式（pathogen or microbial-associated molecular patterns, PAMPs or MAMPs）誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)，稱為PTI（PAMP-triggered immunity）[8 - 9]。第二層免疫系統(tǒng)中，一些病原微生物分泌的效應(yīng)蛋白直接或間接被植物中的抗?。╮esistance, R）蛋白識(shí)別，如核苷酸結(jié)合富亮氨酸重復(fù)序列（nucleotidebinding leucine-rich repeat, NLR）蛋白，隨后誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)，稱為ETI（effector-triggered immunity）[10]。在免疫反應(yīng)中，ETI 相比PTI 免疫反應(yīng)更劇烈，通常會(huì)導(dǎo)致植物局部細(xì)胞死亡，稱為過(guò)敏性壞死反應(yīng)（hypersensitive response, HR）[11]。病原微生物為了更好地侵染寄主植物會(huì)分泌效應(yīng)蛋白干擾PTI[12]。研究結(jié)果表明，香蕉中過(guò)表達(dá)細(xì)胞凋亡基因或PCD 相關(guān)基因可以提高香蕉對(duì)Foc的抗病性，說(shuō)明香蕉細(xì)胞HR 反應(yīng)也是香蕉抗枯萎病的重要抗病機(jī)制[13 - 14]。

效應(yīng)蛋白被證明在Foc的侵染過(guò)程中發(fā)揮作用。Foc的全基因組測(cè)序已經(jīng)完成，利用基因組測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)分析在FocTR4 中預(yù)測(cè)了大量的候選效應(yīng)蛋白[15-16]。然而，許多候選效應(yīng)蛋白的毒力功能并不清楚。因此，F(xiàn)oc中的候選效應(yīng)蛋白的鑒定和毒力分析對(duì)于研究Foc的致病機(jī)制和其與宿主間相互作用至關(guān)重要。

煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于鑒定各種病原菌候選效應(yīng)蛋白的功能[17]。BAX 蛋白是Bcl-2 蛋白家族中的一種能誘導(dǎo)細(xì)胞壞死的蛋白，將其構(gòu)建在煙草花葉病毒載體（tobacco mosaic virus vector）中在本氏煙（Nicotiana benthamiana）中瞬時(shí)表達(dá)時(shí)，可以作為陽(yáng)性對(duì)照誘導(dǎo)本氏煙葉片的細(xì)胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）[18-19]。蘋果炭疽菌（Colletotrichum fructicola）中的候選效應(yīng)蛋白CfEC92 被驗(yàn)證可以抑制由BAX 誘導(dǎo)的PCD[20]。激發(fā)子INF1 是一種毒力因子，可以誘導(dǎo)本氏煙葉片的過(guò)敏性壞死（hypersensitive response,HR）反應(yīng)[21]。另外，17 種葡萄霜霉菌（Plasmopara viticola）PvRXLR 候選效應(yīng)蛋白可以完全抑制由BAX 和INF1 誘導(dǎo)的PCD，并且PvRXLR159 在本氏煙中的瞬時(shí)表達(dá)可以抑制本氏煙對(duì)葡萄霜霉菌的抗性[22-23]。本研究從課題組前期在Foc4基因組中篩選出的80 個(gè)候選效應(yīng)蛋白（FoSSP1-FoSSP80）中選取FoSSP20 為研究對(duì)象，通過(guò)生物信息學(xué)分析其結(jié)構(gòu)，并通過(guò)信號(hào)肽分泌實(shí)驗(yàn)、亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)、煙草瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)和qRT-PCR 初步分析其功能，以鑒定FoSSP20 的毒力功能，從而為研究FoSSP20 在Foc4與香蕉的相互作用中的分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和植物真菌菌株：尖孢鐮刀菌古巴?；? 號(hào)生理小種（Fusarium oxysporumf. sp.cubenserace 4,Foc4）；根瘤農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株GV3101；大腸桿菌（Escherichia coli）菌株DH5α；酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌株YTK12。以上菌株由海南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院真菌病毒與植物免疫實(shí)驗(yàn)室保存并提供，感受態(tài)購(gòu)自Takara 生物公司.

本試驗(yàn)接種香蕉品種為巴西蕉（MusaAAACavendishvar.Brazilian），購(gòu)自海南熱作兩院種業(yè)科技有限公司。本氏煙（Nicotiana benthamiana）由海南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院真菌病毒與植物免疫實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試驗(yàn)試劑DNA 聚合酶：TaKaRaTaqTM（Takara Biotech）； 2×TaqPCR Mix（TianGen Biotech）；Phusion High-Fidelity DNA Polymerase（Thermo Fisher Scientific）； Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（Vazyme Biotech）； 2 ×KeyPo Master Mix（Vazyme Biotech）；2 × Phanta Max Master Mix（Vazyme Biotech）。限制性內(nèi)切酶：Restriction Endonucleases（New England Biolabs,NEB）。試劑盒：Cycle Pure Kit 純化試劑盒與 Gel Extraction Kit 純化試劑盒（Omega Biotech）；Hi-DNAsecure Plant Kit 高效植物基因組DNA 提取試劑盒（TianGen Biotech）；Eastep R Super Total RNA Extraction Kit 總RNA 提取試劑盒（Promega Biotech）； RevertAid First Stand cDNA Synthesis Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo Fisher Scientific）；SuperReal PreMix Plus 熒光定量試劑盒（TianGen Biotech）； ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit（Vazyme Biotech）；經(jīng)典酵母轉(zhuǎn)化試劑盒（Coolaber Biotech）；12.5% SDS-PAGE 變性丙烯酰胺彩色凝膠快速制備試劑盒（Sangon Biotech）。PDA/PDB、LB/LBA、YPDA、CMD-W 以及YPRAA培養(yǎng)基均參考常規(guī)方法配制。

1.3 試驗(yàn)引物本研究所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 本研究所用引物

1.4 菌株及植物培養(yǎng)WT-Foc4在PDA 或PDB培養(yǎng)基中28 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)。DH5a 和GV3101分別于37 ℃和28 ℃的條件下在LB 培養(yǎng)基中恒溫黑暗培養(yǎng)。YTK12 在YPDA 培養(yǎng)基中30 ℃恒溫暗培養(yǎng)。本氏煙在培養(yǎng)箱中24 ℃晝夜（16 h/8 h）交替培養(yǎng)。選取5～6 片葉的巴西蕉苗在（28±2） ℃的溫室中晝夜交替培養(yǎng)。

1.5 生物信息學(xué)分析FoSSP20（FOIG_10940；Genomic Sequence: NW_022158703.1）的序列信息從NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)下載。將FoSSP20 的氨基酸序列通過(guò)BlastP 在線比對(duì)NCBI NR 和Ensemble Fungi數(shù)據(jù)庫(kù)獲得同源蛋白的序列。利用MEGA11軟件采用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[24]。利用Clustal W 軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，GeneDoc 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析[25]。利用在線軟件SignalP 5.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?Sig nalP-5.0）和TMHMM 2.0 （https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0）對(duì)FoSSP20 的氨基酸序列進(jìn)行分析[26 - 27]。

1.6 酵母表達(dá)載體構(gòu)建pSUC2、pSUC2-Avr1b和pSUC2-Mg87載體由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。將pSUC2 載體用EcoRI 和XhoI 限制性內(nèi)切酶酶切，用Cycle Pure Kit 純化試劑盒純化回收。用FoSSP20SP-F/FoSSP20SP-R 引物KeyPo Master Mix聚合酶擴(kuò)增FoSSP20 的信號(hào)肽全長(zhǎng)，Gel Extraction Kit 純化試劑盒純化回收。用ClonExpress ⅡOne Step Cloning Kit 將純化后的SP 片段克隆到pSUC2 載體中得到pSUC2-FoSSP20SP酵母分泌載體。操作方法和反應(yīng)體系均參考產(chǎn)品使用說(shuō)明書。所有載體均通過(guò)PCR 檢測(cè)和上海生工測(cè)序驗(yàn)證其準(zhǔn)確性。

1.7 植物表達(dá)載體構(gòu)建用Eastep R Super total RNA Extraction Kit 總RNA 提取試劑盒（Promega Biotech）提取Foc4的總RNA。用RevertAid First Stand cDNA Synthesis Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo Fisher Scientific）將總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。將pGR107-GFP載體用ClaⅠ限制性內(nèi)切酶酶切，用Cycle Pure Kit 純化試劑盒純化回收。以Foc4的cDNA 為模板，用pGR107-GFP-FoSSP20-F、 pGR107-GFP-FoSSP20ΔSP-F 分別與 pGR107-GFP-FoSSP20-R 引物擴(kuò)增FoSSP20 全長(zhǎng)、FoSSP-20ΔSP片段。用ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit 將純化后的片段分別克隆到pGR107-GFP載體中得到pGR107-FoSSP20-GFP、 pGR107-Fo-SSP20ΔSP-GFP植物表達(dá)載體。將pBin-eGFP載體用KpnⅠ限制性內(nèi)切酶酶切，用Cycle Pure Kit 純化試劑盒純化回收。用pBin-FoSSP20-F、pBin-FoSSP20ΔSP-F 分別與pBin-FoSSP20-R 引物擴(kuò)增FoSSP20 全長(zhǎng)、FoSSP20ΔSP片段。用ClonExpress ⅡOne Step Cloning Kit 將純化后的片段分別克隆到pBin-eGFP載體中得到 pBin-FoSSP20-eGFP、pBin-FoSSP20ΔSP-eGFP植物表達(dá)載體。pGR107-GFP、pBin-eGFP載體由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存并提供。用Phanta Max Super- Fidelity DNA 聚合酶擴(kuò)增目的基因。操作方法和反應(yīng)體系均參考產(chǎn)品使用說(shuō)明書。所有載體均通過(guò)PCR 檢測(cè)和上海生工測(cè)序驗(yàn)證其準(zhǔn)確性。

1.8 酵母分泌實(shí)驗(yàn)用酵母分泌系統(tǒng)對(duì)FoSSP-20 的信號(hào)肽功能進(jìn)行驗(yàn)證[28]。將YTK12 菌株接種在YPDA 平板上劃線培養(yǎng)，挑取單菌落接種到Y(jié)PDA 液體培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。取適當(dāng)菌液接種于新的YPDA 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600=0.4～0.5。將菌液3 000 r·min-1離心5 min 去除上清，并用滅菌的ddH2O 重新懸浮后用3 000 r·min-1離心5 min 去上清。將菌體用1.5 mL 1 mol·L-1LiAc 重新懸浮后用3 000 r·min-1離心5 min 去上清，最后用1 mL 1 mol·L -1 LiAc 懸浮得到Y(jié)TK12 感受態(tài)。將pSUC2、pSUC2-Avr1b、pSUC2-Mg87和pSUC2-FoSSP20SP載體用經(jīng)典酵母轉(zhuǎn)化試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)化得到含有相應(yīng)載體的酵母菌株，操作步驟參考使用說(shuō)明書。將含有不同載體的酵母菌株分別接種在CMD-W 和YPRAA 培養(yǎng)基的平板上，以驗(yàn)證YTK12 是否含有轉(zhuǎn)化酶的活性。轉(zhuǎn)化酶可將TTC（2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride）還原為TPF（1,3,5-Triphenylformazan）形成不可溶性紅色沉淀，可以進(jìn)一步驗(yàn)證信號(hào)肽的功能。含有pSUC2-Avr1b、pSUC2-Mg87和pSUC2的YTK12分別作為陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照，實(shí)驗(yàn)設(shè)3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3 個(gè)機(jī)械重復(fù)。

1.9 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草的瞬時(shí)表達(dá)將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體通過(guò)電擊法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101 的感受態(tài)中。在含有50 μg·mg-1卡那霉素（kanamycin）和25 μg·mg-1利福平（rifampicnic）的LB 培養(yǎng)基中28 ℃振蕩培養(yǎng)。反復(fù)離心（5000 r·min-1,5 min）懸浮菌液，待培養(yǎng)基洗凈后用接種緩沖液重新懸浮，并將OD600調(diào)至0.6，室溫靜止2 h 后用注射器將菌液接種在4～6 周的本氏煙葉片背部。實(shí)驗(yàn)設(shè)3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3 個(gè)機(jī)械重復(fù)，pGR107-BAX和pGR107-GFP分別作為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，注射后5 d 用UV 燈觀察并拍照記錄。注射緩沖液配方：10 mmol·L-1MgCl2、5 mmol·L-1MES（pH 5.6）和150 μmol·L-1AS（acetosyringone）。

1.10 共聚焦顯微鏡觀察利用共聚焦顯微鏡對(duì)FoSSP20 的亞細(xì)胞定位進(jìn)行測(cè)定，在5 周大的本氏煙中分別注射含有pBin-eGFP、pBin-FoSSP20-eGFP、pBin-FoSSP20ΔSP-eGFP的農(nóng)桿菌，OD600=0.01。在注射后36 h 利用激光共聚焦顯微鏡（Olympus microscope TH4-200, Tokyo, Japan）觀察融合蛋白的綠色熒光并拍照記錄，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，接受波長(zhǎng)為505～530 nm。

1.11 FoSSP20 的亞細(xì)胞定位(western blot)收集本氏煙葉片樣品，液氮速凍，用研磨儀研磨后加入植物總蛋白裂解緩沖液（Sangon Biotech），按說(shuō)明書操作提取本氏煙葉片的總蛋白。將與蛋白loading buffer 混合的蛋白樣品煮沸5 min 后加入用12.5% SDS-PAGE 變性丙烯酰胺彩色凝膠快速制備試劑盒制備12.5% SDS-PAGE 蛋白膠中，電泳完成后用轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移到0.22 μm 的PVDF 膜中。用一抗Rabbit anti-GFP pAb 和二抗HRP Goat anti-rabbit IgG （Abclonal, Biotech）對(duì)蛋白進(jìn)行雜交，用ECL 檢測(cè)試劑盒（KeyGEN Biotech）進(jìn)行檢測(cè)。操作步驟參考使用說(shuō)明書。

1.12 FoSSP20 的表達(dá)模式用PDB 培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)Foc45 d，過(guò)濾菌絲得到孢子懸浮液，將孢子懸浮液調(diào)到1 × 107個(gè)·mL-1。選取長(zhǎng)勢(shì)良好根系發(fā)達(dá)的水培香蕉，對(duì)根系進(jìn)行傷根處理后浸泡于Foc4的孢子懸浮液中2 h，清洗根部后重新移栽到花盆中，在溫室中進(jìn)行培養(yǎng)。收集Foc4接種后12、24、48 和72 h 的香蕉苗根部和Foc4 的菌絲和分生孢子，用Eastep R Super total RNA Extraction Kit 總RNA 提取試劑盒（Promega Biotech）提取所有樣品的總RNA。用RevertAid First Stand cDNA Synthesis Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo Fisher Scientific）將總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。香蕉的Actin 基因作為內(nèi)參，使用QuantStudioTM5 Real-Time PCR 儀器（Thermo Fisher Scientific）和Super-Real PreMix Plus 熒光定量試劑盒（TianGen Biotech）進(jìn)行qRT-PCR 檢測(cè)，利用QuantStudioTMDesign&Analysis Software v1.5.2 軟件對(duì)基因表達(dá)量進(jìn)行分析。操作方法參考使用說(shuō)明書。

2 結(jié)果與分析

2.1 FoSSP20 蛋白結(jié)構(gòu)分析FoSSP20（FOIG_10940）基因全長(zhǎng)1 086 bp，編碼1 個(gè)含82 個(gè)氨基酸的假定蛋白，序列登錄號(hào)：NW_022158705.1。生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)FoSSP20 的N 端含有1 個(gè)19 個(gè)氨基酸的信號(hào)肽（Signal peptide, SP），無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域。將FoSSP20 的氨基酸序列通過(guò)BlastP對(duì)NCBI 和Ensemble Fungi 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)FoSSP20 在其他鐮刀菌屬（Fusarium）的真菌中比對(duì)出大量同源蛋白（圖1-a），這些蛋白的氨基酸序列具有高度相似性（圖1-b）。

圖1 FoSSP20 及其同源物的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和氨基酸比對(duì)

2.2 FoSSP20 信號(hào)肽功能驗(yàn)證生物信息學(xué)分析表明，F(xiàn)oSSP20 可能是N 端具有SP 的經(jīng)典分泌蛋白。為了驗(yàn)證其SP 具有分泌活性，我們利用酵母分泌系統(tǒng)來(lái)驗(yàn)證FoSSP20 的SP 功能。FoSSP20的SP 全長(zhǎng)含有19 個(gè)氨基酸，我們將SP 的全長(zhǎng)克隆到pSUC2 載體中，得到信號(hào)肽分泌載體pSUC2-FoSSP20SP，并將pSUC2-FoSSP20SP轉(zhuǎn)入釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）YTK12 中，Mg87 作為陰性對(duì)照為含有稻瘟菌（Magnaporthe oryzae）Mg87 蛋白的SP 的pSUC2 載體的YTK12；Avr1b作為陽(yáng)性對(duì)照為含有大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）Avr1b 蛋白的SP 的pSUC2 載體的YTK12。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)oSSP20 的SP 可以使YTK12 分泌轉(zhuǎn)化酶使得酵母菌株在YPRAA 平板上生長(zhǎng)，并可以將TTC（2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride）還原為TPF（1,3,5-Triphenylformazan）形成不可溶解的紅色沉淀（圖2）。綜上所述，F(xiàn)oSSP20 是一種經(jīng)典分泌蛋白，其SP 具有分泌功能。

圖2 通過(guò)酵母分泌系統(tǒng)驗(yàn)證FoSSP20 的分泌功能

2.3 FoSSP20 的亞細(xì)胞定位為了驗(yàn)證FoSSP20在植物細(xì)胞內(nèi)的定位，對(duì)FoSSP20 進(jìn)行亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)。將FoSSP20 和FoSSP20ΔSP克隆到pBineGFP 植物表達(dá)載體中，成功構(gòu)建pBin-FoSSP20-eGFP 和pBin-FoSSP20ΔSP-eGFP 綠色熒光表達(dá)載體并將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，并將攜帶載體的農(nóng)桿菌注射到煙草葉片中（GFP 作為對(duì)照）。注射2 d 后，用激光共聚焦顯微鏡觀察eGFP 融合蛋白的定位情況，結(jié)果表明FoSSP20:eGFP 和 FoSSP20ΔSP:eGFP 均定位于煙草細(xì)胞的細(xì)胞核和質(zhì)膜上（圖3-a）。為了驗(yàn)證煙草葉片中蛋白的表達(dá)情況，提取了葉片的總蛋白，利用Western blot 免疫雜交檢測(cè)到FoSSP20: eGFP 、 FoSSP20ΔSP: eGFP 蛋白的表達(dá)（圖3-b）。

圖3 FoSSP20 和FoSSP20ΔSP 的亞細(xì)胞定位

2.4 FoSSP20 抑制BAX 在本氏煙草葉片上誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死利用煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)對(duì)FoSSP20 的功能進(jìn)行驗(yàn)證，由于FoSSP20 為經(jīng)典分泌蛋白，其SP 具有分泌活性，進(jìn)一步驗(yàn)證SP 的缺失是否會(huì)影響FoSSP20 的細(xì)胞死亡抑制活性。擴(kuò)增FoSSP20 的全長(zhǎng)和缺失SP 的FoSSP20 （FoSSP20ΔSP），將2 個(gè)片段分別克隆到pGR107-GFP載體中，并成功轉(zhuǎn)入根瘤農(nóng)桿菌中。利用煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，分別在本氏煙中瞬時(shí)表達(dá)FoSSP20 和FoSSP20ΔSP的GFP 融合蛋白（OD600= 0.6），并在24 h 后在相同位置注射含有pGR107-BAX的農(nóng)桿菌。注射5 d 后，BAX、BAX 與GFP共注射部位開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞壞死，而FoSSP20、FoSSP20ΔSP與BAX 共注射部位沒(méi)有出現(xiàn)細(xì)胞壞死，當(dāng)用UV 燈照射葉片時(shí)，壞死部位產(chǎn)生黑色病斑，而未壞死部位出現(xiàn)綠色熒光（圖4-a）。為了驗(yàn)證煙草葉片中蛋白的表達(dá)情況，提取了葉片的總蛋白，利用Western blot 免疫雜交對(duì)GFP 融合蛋白進(jìn)行檢測(cè)，雜交結(jié)果表明共注射不影響蛋白的表達(dá)（圖4-b）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， FoSSP20 和FoSSP20ΔSP都可以完全抑制BAX 誘導(dǎo)的PCD。

圖4 FoSSP20 和FoSSP 在煙草中瞬時(shí)表達(dá)

2.5 FoSSP20基因表達(dá)模式為了確定FoSSP-20基因在Foc4侵染時(shí)的表達(dá)變化，通過(guò)qRTPCR 檢測(cè)FoSSP20的表達(dá)模式。以Foc4的分生孢子（conidia, CON）作為侵染后0 h 的樣本，以FoSSP20在Foc4 的分生孢子時(shí)期的表達(dá)量作為對(duì)照。與CON 樣品相比，F(xiàn)oc4 的菌絲（hyphae,HYP）樣品中FoSSP20 基因表達(dá)無(wú)顯著差異，而FoSSP20基因在侵染后12 h 表達(dá)量開(kāi)始出現(xiàn)顯著差異，在侵染后24 h 達(dá)到峰值（25.8 倍）（圖5）。隨后FoSSP20 的表達(dá)量開(kāi)始逐漸降低。qRT-PCR 結(jié)果表明，候選效應(yīng)蛋白FoSSP20 可能在病原菌的侵染階段發(fā)揮作用。

圖5 不同侵染時(shí)間的香蕉根部候選效應(yīng)蛋白FoSSP20 的基因表達(dá)量

3 討 論

目前對(duì)鐮刀菌（Fusarium oxysporum,Fo）效應(yīng)蛋白研究較少，研究主要集中在一類會(huì)分泌進(jìn)入寄主植物的木質(zhì)部中發(fā)揮作用幫助病原菌侵染的效應(yīng)蛋白中，這一類效應(yīng)蛋白稱之為SIX（secretedin-xylem）蛋白。 在番茄枯萎病菌（Fusarium oxysporumf. sp.lycopersici,Fol）中共鑒定出14 個(gè)SIX 蛋白（SIX1～SIX14）。在所有SIX 蛋白中，SIX1 是番茄（Lycopersicon esculentum）中I-3 介導(dǎo)的抗性所必需的，因此也被稱為Avr3，并且FocTR4 中SIX1同源基因的缺失會(huì)導(dǎo)致FocTR4 對(duì)香蕉致病力降低[29-30]。SIX3 蛋白也作為一種無(wú)毒基因（Avr2）能被植物的I-2 介導(dǎo)的抗性識(shí)別[31]。FocSge1基因可以調(diào)控Foc4中效應(yīng)蛋白基因的表達(dá)，而SIX8 被證明對(duì)Foc TR4 的毒力有貢獻(xiàn)[32]。除了已被研究的SIX 蛋白外，F(xiàn)oc4中還有很多其他類型的效應(yīng)蛋白仍功能未知未被報(bào)道。FocM35_1 是一種金屬蛋白酶類效應(yīng)蛋白有助于FocTR4 毒性在病原菌侵染早期表達(dá)量上調(diào)[16]。FoSSP1 是本課題組前期研究的一個(gè)候選效應(yīng)蛋白，能激發(fā)植物免疫并負(fù)調(diào)控Foc4的侵染[33]。分泌蛋白根據(jù)其分泌途徑的不同可以分為經(jīng)典分泌蛋白和非經(jīng)典分泌蛋白。其中，經(jīng)典分泌蛋白依靠N 端的信號(hào)肽引導(dǎo)蛋白合成分泌[34]，而非經(jīng)典分泌蛋白通過(guò)胞吞胞吐或其他方式分泌到細(xì)胞外，是病原菌對(duì)分泌途徑進(jìn)行有益的補(bǔ)充和替代[35]。在本研究中，鑒定了一種非SIX 蛋白的新蛋白FoSSP20，該蛋白的信號(hào)肽具有分泌功能，但信號(hào)肽的有無(wú)不影響該蛋白抑制BAX 誘導(dǎo)本氏煙的PCD。通過(guò)亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)FoSSP20定位于植物細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞膜中，并且該蛋白在Foc4侵染過(guò)程中表達(dá)量顯著上調(diào)。這些結(jié)果都表明FoSSP20 可能作為Foc4的一個(gè)新的毒力因子在侵染過(guò)程中發(fā)揮作用。

通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)，篩選FoSSP20 的同源蛋白并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。分析結(jié)果表明FoSSP20 在整個(gè)鐮刀菌屬中保守，并且不同物種之間FoSSP20 的同源物的序列存在差異。因此，猜測(cè)FoSSP20 蛋白及其同源物可能與Fo的進(jìn)化相關(guān)。在后續(xù)的研究中，將會(huì)克隆不同種的FoSSP20 蛋白的同源蛋白，構(gòu)建煙草瞬時(shí)表達(dá)載體，將FoSSP20 的同源蛋白在煙草中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，驗(yàn)證其功能與FoSSP20 的異同。在亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)SP 的缺失對(duì)FoSSP20 的定位沒(méi)有影響，可能是由于真菌的SP 不能在植物中發(fā)揮作用，后續(xù)會(huì)進(jìn)一步構(gòu)建含植物信號(hào)肽的FoSSP-20 表達(dá)載體對(duì)該蛋白的定位。此外，全長(zhǎng)的FoSSP20 熒光強(qiáng)度明顯弱于FoSSP20ΔSP，也可能是由于FoSSP20 的SP 發(fā)揮了功能，導(dǎo)致FoSSP20被分泌至植物細(xì)胞外使得熒光強(qiáng)度降低。在未來(lái)的研究中，將會(huì)對(duì)FoSSP20基因進(jìn)行敲除回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證FoSSP20 蛋白是否是Foc4毒力所必需的，并且驗(yàn)證其對(duì)Foc4生長(zhǎng)發(fā)育的影響。FoSSP-20 可以抑制本氏煙中由BAX 誘導(dǎo)的PCD，說(shuō)明該蛋白可能會(huì)通過(guò)調(diào)控植物免疫來(lái)幫助Foc4侵染香蕉；驗(yàn)證FoSSP20 是否能抑制本氏煙中活性氧和胼胝質(zhì)的積累，及其對(duì)植物信號(hào)通路相關(guān)基因的影響，從而明確該蛋白在Foc4調(diào)控寄主免疫反應(yīng)中的作用。