不同培養(yǎng)溫度的魚源海豚鏈球菌轉(zhuǎn)錄組分析

賈新蕾，黃增朝，楊林狄，呂 靜，李妍萍，簡(jiǎn)紀(jì)常，黃郁蔥

（1. 廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院/廣東省水產(chǎn)動(dòng)物病害防控與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088;2. 南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室（湛江），廣東 湛江 524006）

海豚鏈球菌（Streptococcus iniae）是一種重要的水生動(dòng)物致病菌，1976 年P(guān)ier 等[1]從亞馬遜江豚（Inia geoffrensis）中首次分離獲得，之后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)它可感染除南極洲以外的所有魚類[2]。我國(guó)也有海豚鏈球菌感染卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）[3 - 4]、尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）[5-6]、鱘魚（Acipenser sinensis）[7 - 8]、銀鼓魚（Selenotocamultifasciata）[9]、小黃魚（Larimichthys polyactis）[10]、黃鰭鯛（Acanthopagrus latus）[11]等發(fā)病的相關(guān)報(bào)道。海豚鏈球菌具有感染宿主范圍廣、傳染性強(qiáng)、導(dǎo)致死亡率高等特點(diǎn)，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并受到了國(guó)內(nèi)外水產(chǎn)行業(yè)工作者的高度關(guān)注。

海豚鏈球菌病的暴發(fā)除了與病原菌本身的毒力有關(guān)，一些環(huán)境因子在疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中亦發(fā)揮重要作用，如溫度、pH 值等[12]，尤其是養(yǎng)殖的環(huán)境溫度與該病的發(fā)生呈現(xiàn)比較明顯的相關(guān)性，發(fā)病時(shí)水溫通常在27 ℃以上[13]。祝璟琳等[14]開展的流行病學(xué)研究表明，在32 ℃以上的溫度下羅非魚更容易爆發(fā)鏈球菌病，羅非魚免疫力在高溫條件下受到明顯的抑制[15]，鏈球菌對(duì)宿主的粘附、定植、入侵和抵抗免疫清除能力明顯增強(qiáng)[16 - 17]。同時(shí)，較高溫度時(shí)海豚鏈球菌產(chǎn)生的胞外產(chǎn)物中可能含有較多致病因子，從而影響細(xì)菌毒力[18]，尼羅羅非魚在感染海豚鏈球菌后其肝臟、腎臟在高溫時(shí)病理?yè)p傷更嚴(yán)重[19]。以上研究均表明在較高的溫度下病原鏈球菌的毒力顯著增強(qiáng)，從而引起鏈球菌病的爆發(fā)。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-Seq）技術(shù)是一項(xiàng)能夠檢測(cè)有機(jī)體整體轉(zhuǎn)錄水平的新興技術(shù)手段，目前已有學(xué)者利用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)研究細(xì)菌的毒力調(diào)控。如：Li 等[20]利用RNA-seq 技術(shù)分析了提高溫度和營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)副溶血性弧菌毒力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)溫度和營(yíng)養(yǎng)成分的提高可顯著提高副溶血性弧菌的毒力；王松艷[21]對(duì)不同溫度下培養(yǎng)的無(wú)乳鏈球菌進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，篩選出7 個(gè)毒力相關(guān)基因；師若萍[22]運(yùn)用高通量RNA 測(cè)序和非靶向代謝組學(xué)的研究方法，探究大腸桿菌在不同溫度下的生長(zhǎng)及其在轉(zhuǎn)錄和代謝水平的變化，了解其對(duì)于不同溫度的生理調(diào)節(jié)機(jī)制，以上研究結(jié)果表明溫度可廣泛影響細(xì)菌毒力和基因的表達(dá)。但目前尚未見(jiàn)溫度對(duì)海豚鏈球菌致病性的影響以及其基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的研究報(bào)道。卵形鯧鲹是我國(guó)海水養(yǎng)殖魚類中產(chǎn)量位居第二的優(yōu)良品種，高溫期易暴發(fā)海豚鏈球菌病[3-4]。本研究以卵形鯧鲹源海豚鏈球菌Tozj-1為研究對(duì)象，選用RNA-Seq 技術(shù)對(duì)不同溫度（25 ℃和35 ℃）培養(yǎng)的海豚鏈球菌進(jìn)行高通量測(cè)序分析，篩選差異表達(dá)基因，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 功能和KEGG 通路富集分析，探究溫度對(duì)海豚鏈球菌基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響及富集的功能和信號(hào)通路，以期為揭示溫度與海豚鏈球菌致病性積累基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為后續(xù)進(jìn)一步研究海豚鏈球菌的致病機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料本研究測(cè)序和試驗(yàn)用菌株Tozj-1來(lái)源于廣東省水產(chǎn)動(dòng)物病害防控與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。Tozj-1為實(shí)驗(yàn)室于2020 年8 月從廣東省湛江市某深海網(wǎng)箱養(yǎng)殖的患病卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）分離獲得。分離的菌株經(jīng)16S rRNA 測(cè)序、生理生化鑒定為海豚鏈球菌（S.iniae），通過(guò)人工感染卵形鯧鲹確認(rèn)其為病原菌，并保存于廣東省水產(chǎn)動(dòng)物病害防控與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 生長(zhǎng)曲線測(cè)定將Tozj-1菌株劃線接種于BHI 固體培養(yǎng)皿上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用無(wú)菌接種環(huán)挑取單個(gè)菌落接種于新鮮的無(wú)菌BHI 液體培養(yǎng)基，于28 ℃，120 r·min-1下振蕩過(guò)夜擴(kuò)大培養(yǎng)。將上述菌液以1∶50（V/V）的比例接種到無(wú)菌的BHI 培養(yǎng)基，分別置于25 ℃和35 ℃恒溫?fù)u床，150 r·min-1振蕩培養(yǎng)，每個(gè)溫度下設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。每隔1 h 取樣，測(cè)定菌液的吸光值（OD600），并繪制不同溫度下的海豚鏈球菌生長(zhǎng)曲線。

1.2.2 人工回歸感染試驗(yàn)為了探究不同溫度對(duì)卵形鯧鲹源海豚鏈球菌毒力的影響，本研究使用卵形鯧鲹進(jìn)行體內(nèi)攻毒試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前，將28 ℃擴(kuò)大培養(yǎng)的海豚鏈球菌以1∶50（V/V）的比例接種到新鮮BHI 培養(yǎng)基中，分別置于25、35 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（OD600=0.9～1.1），收集菌體，用無(wú)菌PBS 緩沖液將菌液稀釋至1.0×107CFU·mL-1備用。

將360 尾健康的卵形鯧鲹[體質(zhì)量（50±6）g·尾]隨機(jī)分為4 組（2 個(gè)實(shí)驗(yàn)組和2 個(gè)對(duì)照組），每組設(shè)3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30 尾魚。25 ℃實(shí)驗(yàn)組于水溫25 ℃飼養(yǎng)，每尾腹腔注射25 ℃體外培養(yǎng)的Tozj-1菌懸液，對(duì)照組注射無(wú)菌PBS；35 ℃實(shí)驗(yàn)組于水溫35 ℃飼養(yǎng)，每尾腹腔注射35 ℃體外培養(yǎng)的Tozj-1菌懸液，對(duì)照組注射等量無(wú)菌PBS。觀察攻毒后14 d 內(nèi)試驗(yàn)魚的發(fā)病情況，記錄并統(tǒng)計(jì)死亡魚數(shù)量，通過(guò)解剖瀕臨死亡魚并進(jìn)行病原分離鑒定，以確定感染病原，鑒定方法同1.1。

1.2.3 總RNA 提取、cDNA 文庫(kù)構(gòu)建和高通量測(cè)序?qū)?8 ℃下培養(yǎng)的菌株Tozj-1以1∶50（V/V）的比例稀釋于新鮮BHI 肉湯中，分別于35 ℃和25 ℃條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（OD600=0.9～1.1）。每個(gè)溫度設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。其中，以25 ℃培養(yǎng)的海豚鏈球菌作為對(duì)照組，標(biāo)記為CK-1、CK-2、CK-3；以35 ℃培養(yǎng)的海豚鏈球菌作為實(shí)驗(yàn)組，標(biāo)記為Test-1、Test-2、Test-3。每個(gè)樣品取1 mL 菌液，12 000 r·min-1離心2 min，棄去上清，加入100 μL 溶菌酶，混勻，置于37 ℃裂解15 min，按照Trizol 試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行菌體的總RNA 抽提，使用Agilent 2100 生物分析儀評(píng)估RNA 質(zhì)量并通過(guò)RNase free 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)質(zhì)量檢測(cè)合格后純化總RNA，cDNA 文庫(kù)構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序工作委托廣州基迪奧生物科技有限公司完成。

1.2.4 原始數(shù)據(jù)質(zhì)控與差異表達(dá)基因分析原始數(shù)據(jù)的存儲(chǔ)采用FASTQ 格式，通過(guò)fastp[23]（https://github.com/OpenGene/fastp）對(duì)下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)和數(shù)據(jù)過(guò)濾，去除原始數(shù)據(jù)中質(zhì)量低、接頭污染、全部都是A 堿基以及未知堿基N 含量過(guò)高的Reads 后最終獲得Clean reads。利用工具Bowtie 2[24]建立參考基因組索引，將質(zhì)控分析后的高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到海豚鏈球菌參考基因組SF1（GenBank 登錄號(hào)CP005941.1）上。采用FPKM 法計(jì)算每個(gè)注釋基因的表達(dá)水平，使用FDR 與log2FC 來(lái)篩選差異基因，篩選條件為FDR＜0.05 且|log2FC|＞1。

1.2.5 聚類分析根據(jù)每組篩選的差異表達(dá)基因，使用R 語(yǔ)言Pheatmap 軟件包對(duì)差異基因進(jìn)行雙向聚類分析。首先，得到的差異表達(dá)基因在GO（The Gene Ontology）數(shù)據(jù)庫(kù)中的各個(gè)項(xiàng)目進(jìn)行映射，然后通過(guò)GO 功能顯著性富集分析[25]，在宏觀上了解該物種的基因功能分布特征。然后，基于KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)每個(gè)KEGG pathway 不同層次上存在的差異表達(dá)基因數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，確定這些差異表達(dá)基因的主要代謝路徑和信號(hào)通路[26]，進(jìn)一步了解基因的生物功能。最后，利用超幾何學(xué)方法，以Qvalue≤0.1 的Pathway 作為在差異表達(dá)基因中顯著富集的Pathway。

1.2.6 差異表達(dá)目標(biāo)基因的qRT-PCR 驗(yàn)證為了驗(yàn)證海豚鏈球菌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性，將差異表達(dá)基因與毒力因子數(shù)據(jù)庫(kù)（Virulence Factors of Pathogenic Bacteria，VFDB）進(jìn)行比對(duì)，篩選出22 個(gè)與毒力相關(guān)的差異表達(dá)基因，使用primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)特異性定量引物（基因名稱和引物序列見(jiàn)表1），引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。根據(jù)cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒的使用說(shuō)明書將質(zhì)檢合格的總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time quantitative PCR,qPCR）技術(shù)對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的驗(yàn)證，qPCR 反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共計(jì)40 個(gè)循環(huán)結(jié)束，60 ℃讀取熔解曲線。以16S rRNA 基因?yàn)閮?nèi)參基因，采用2-ΔΔCt方法分析計(jì)算各毒力基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 檢測(cè)海豚鏈球菌毒力基因的qRT-PCR 特異性引物

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度下海豚鏈球菌的生長(zhǎng)曲線海豚鏈球菌在本試驗(yàn)的2 個(gè)培養(yǎng)溫度下，35 ℃生長(zhǎng)速度明顯快于25 ℃，能夠快速進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，35 ℃在3 h 左右即達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，25 ℃在9 h 左右才達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。到達(dá)生長(zhǎng)平臺(tái)期后，35 ℃的吸光值略高于25 ℃的吸光值。當(dāng)吸光值OD600在1.0 左右時(shí)，2 個(gè)培養(yǎng)溫度的海豚鏈球菌均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（圖1）。

然而目前職業(yè)學(xué)校，很多家長(zhǎng)的文化程度本身較低，對(duì)孩子的教育重視程度不夠。而且很多家長(zhǎng)忙于生計(jì)，工作時(shí)間較長(zhǎng)，經(jīng)常會(huì)說(shuō)“我不會(huì)教育”，“我管不了孩子”，“我沒(méi)時(shí)間”。對(duì)于這樣的家長(zhǎng)，我覺(jué)得必須幫助他們認(rèn)識(shí)到一個(gè)問(wèn)題，那就是任何事業(yè)的成功，都不能彌補(bǔ)孩子教育的失敗。忙，不是借口；不會(huì)，不是理由?！盎畹嚼希瑢W(xué)到老”，父母也應(yīng)該學(xué)習(xí)在當(dāng)今時(shí)代如何與孩子溝通，如何陪伴孩子的成長(zhǎng)。

圖1 海豚鏈球菌在不同培養(yǎng)溫度下的生長(zhǎng)曲線

2.2 人工感染試驗(yàn)結(jié)果不同溫度人工感染結(jié)果顯示（圖2），35 ℃時(shí)，在感染后1～3 d 卵形鯧鲹即出現(xiàn)大量死亡，之后死亡量逐漸趨于穩(wěn)定，第5 天停止死亡，患病卵形鯧鲹死亡前出現(xiàn)游泳異常、眼球突出、鰭條基部充血等癥狀，病原菌經(jīng)分離培養(yǎng)，16S rRNA 鑒定為海豚鏈球菌。25 ℃時(shí)，卵形鯧鲹在感染后3 天內(nèi)未出現(xiàn)死亡，第4 天開始出現(xiàn)少量死亡，死亡率較低，第7 天停止死亡。海豚鏈球菌在水溫35 ℃和25 ℃造成的卵形鯧鲹的累積死亡率分別為81.11%和12.23%，PBS 對(duì)照組均未出現(xiàn)死亡。

圖2 環(huán)境溫度對(duì)卵形鯧鲹海豚鏈球菌病死亡率的影響

2.3 總RNA 的提取提取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（OD600=0.9～1.1）的海豚鏈球菌的總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖3 所示，28 S 和18 S 的條帶清晰無(wú)彌散，RNA 完整性好，無(wú)降解。核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定結(jié)果顯示樣品的A260/A280比值在2.0 左右，濃度為400～700 ng·μL-1，RNA質(zhì)量符合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的要求。

圖3 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)海豚鏈球菌Tozj-1 株總RNA

2.4 樣品相關(guān)性分析本試驗(yàn)中每個(gè)溫度設(shè)有3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，其中CK-1、CK-2、CK-3 分別表示25 ℃的3 個(gè)平行樣品，Test-1、Test-2、Test-3 分別表示35 ℃的3 個(gè)平行樣品。如圖4 所示，同一溫度的3 個(gè)平行樣品相關(guān)性系數(shù)在0.998 0以上，表明來(lái)自3 個(gè)重復(fù)性試驗(yàn)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)具有高度可重復(fù)性，可用于后續(xù)分析。

圖4 樣品相關(guān)性分析熱圖

2.5 數(shù)據(jù)過(guò)濾與質(zhì)量評(píng)估Illumina 測(cè)序得到的數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)質(zhì)量檢測(cè)和數(shù)據(jù)過(guò)濾，最終獲得Clean reads，各樣本的Clean reads 與Raw reads 的Q20和Q30 分別達(dá)到了97%和93%以上，GC 含量在各樣本中較為一致，為40.19%～41.22%（表2）。以上數(shù)據(jù)均表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的數(shù)據(jù)良好，可以用于后續(xù)進(jìn)一步分析。

表2 過(guò)濾前后堿基信息統(tǒng)計(jì)

2.6 差異表達(dá)基因的分析使用Bowtie 2 軟件將6 個(gè)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)映射到海豚鏈球菌SF1 基因組，結(jié)果顯示，所有樣品數(shù)據(jù)皆可映射到基因組上，并且這些樣本的映射率均在98%以上（表3）。說(shuō)明該轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可靠，可以用于后續(xù)的試驗(yàn)分析。差異表達(dá)基因結(jié)果如圖5 所示，共篩選到927 個(gè)顯著差異表達(dá)基因，其中820 個(gè)上調(diào)表達(dá)，107 個(gè)下調(diào)表達(dá)。

圖5 差異基因統(tǒng)計(jì)火山圖

表3 原始數(shù)據(jù)比對(duì)到基因組

2.7 差異表達(dá)基因的GO 功能富集分析對(duì)獲得的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 注釋分析，共得到1 611 個(gè)GO 功能注釋，其中生物學(xué)過(guò)程（biological process）959 個(gè)、細(xì)胞組分（cellular component）446 個(gè)和分子功能（molecular function）570 個(gè)。如圖6 所示，差異基因注釋在生物學(xué)過(guò)程有關(guān)的GO terms 數(shù)量最多，共計(jì)12 個(gè)，主要有代謝過(guò)程（metabolic process）、細(xì)胞過(guò)程（cellular process）和單一有機(jī)過(guò)程（single-organism process）等；其次是與分子功能有關(guān)的terms，共計(jì)8 個(gè)，主要有催化活性（catalytic activity）、結(jié)合（binding）等；與細(xì)胞組分有關(guān)的terms 最少，為7 個(gè)，主要有細(xì)胞（cell）、細(xì)胞成分（cell part）和膜（membrane）等。海豚鏈球菌代謝過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程、單一有機(jī)過(guò)程、結(jié)合過(guò)程和催化活性這幾個(gè)亞類包含的差異基因比較多，它們均受溫度調(diào)控。

圖6 CK 與Test 差異基因GO 分類

2.8 差異表達(dá)基因的KEGG 富集分析將2 個(gè)樣本的差異基因進(jìn)行KEGG 富集分析，結(jié)果顯示，820 個(gè)上調(diào)表達(dá)基因中有289 個(gè)基因可以富集到KEGG 的98 條pathways，其中顯著富集的pathways有5 個(gè)。這些顯著上調(diào)的基因主要與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和毒力因子表達(dá)有關(guān)，包括ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)、核糖體通路、群體感應(yīng)、脂肪酸代謝和合成通路（圖7-a）。除此之外，還包括少量與葉酸和淀粉蔗糖代謝的相關(guān)基因。值得注意的是，這些顯著上調(diào)的pathways 中有許多重復(fù)出現(xiàn)的基因（表4），特別是srtF基因（K710_0263）在ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)、群體感應(yīng)系統(tǒng)和雙組份調(diào)控通路中均上調(diào)表達(dá)。

圖7 差異表達(dá)基因的KEGG 富集分析（35 ℃相對(duì)于25 ℃）

表4 同時(shí)參與多條通路的上調(diào)表達(dá)基因

2.9 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的qRT-PCR 驗(yàn)證為了評(píng)估轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性，隨機(jī)篩選22 個(gè)差異表達(dá)的重要毒力基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的方法檢測(cè)毒力基因的轉(zhuǎn)錄水平，每個(gè)基因設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)，以保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，結(jié)果如圖8 所示。2 種檢測(cè)方法經(jīng)SPSS 軟件的相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)達(dá)到了0.824，相關(guān)極顯著（P＜0.001），說(shuō)明qRTPCR 驗(yàn)證結(jié)果與RNA-Seq 數(shù)據(jù)具有較好的一致性，并且基因表達(dá)變化的趨勢(shì)基本相同，進(jìn)一步驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性。

圖8 海豚鏈球菌在25 ℃和35 ℃條件下毒力相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量

2.10 溫度與毒力因子基因表達(dá)的相關(guān)性根據(jù)文獻(xiàn)[27- 28]以及VFDB 數(shù)據(jù)庫(kù)的篩選，發(fā)現(xiàn)約58 個(gè)當(dāng)前已知或預(yù)測(cè)的海豚鏈球菌毒力因子。由表5 可知，上調(diào)表達(dá)的毒力因子有46 個(gè)，特別是溶血素（SagI）、黏附素（fap1）、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子（cysB、galR）和C5α 肽酶（scpB）等重要的毒力因子，在35 ℃培養(yǎng)條件下毒力因子基因的表達(dá)量與25 ℃培養(yǎng)條件下相比明顯升高（log2FC＞1.6）；下調(diào)表達(dá)的毒力因子基因相對(duì)較少，僅有12 個(gè)（表6），其中包含海豚鏈球菌毒力標(biāo)志基因simA。

表5 上調(diào)表達(dá)的細(xì)菌毒力因子

表6 下調(diào)表達(dá)的細(xì)菌毒力因子

3 討 論

溫度是影響細(xì)菌毒力的重要環(huán)境因子。由病原菌引發(fā)的魚類疾病的暴發(fā)往往與水溫有著極為緊密的關(guān)聯(lián)性。郭富強(qiáng)等[29]的研究結(jié)果表明，隨著水溫的不斷升高羅非魚感染無(wú)乳鏈球菌的累積死亡率也隨之升高，在33 ℃死亡率最高；劉志剛等[17]發(fā)現(xiàn)無(wú)乳鏈球菌感染羅非魚在37 ℃死亡率最高；Zamri-Saad 等[30]認(rèn)為鏈球菌水溫在32～37 ℃時(shí)易出現(xiàn)高發(fā)病率和高死亡率，而水溫26 ℃以下時(shí)較少發(fā)病。在本研究中，人工回歸感染試驗(yàn)結(jié)果表明，卵形鯧鲹感染海豚鏈球菌后在35 ℃下的死亡率高達(dá)81.11%，而在25 ℃下的死亡率僅為12.23%，2 個(gè)溫度的PBS 對(duì)照組均未出現(xiàn)死亡，說(shuō)明海豚鏈球菌在35 ℃時(shí)毒力更強(qiáng)，導(dǎo)致宿主死亡率更高，發(fā)病癥狀更為明顯。同時(shí)，本課題組在卵形鯧鲹鏈球菌病的流行病學(xué)調(diào)查研究中發(fā)現(xiàn)，卵形鯧鲹在25 ℃以下幾乎不感染發(fā)病，在30～35 ℃時(shí)死亡率較高。因此，本研究設(shè)置25 ℃培養(yǎng)的海豚鏈球菌作為對(duì)照組，35 ℃培養(yǎng)的海豚鏈球菌為實(shí)驗(yàn)組，探究其在不同溫度下基因轉(zhuǎn)錄水平上的差異表達(dá)，揭示溫度對(duì)海豚鏈球菌毒力基因的影響。

在本研究中，當(dāng)設(shè)置FDR＜0.05 且|log2FC|＞1時(shí)，與25 ℃培養(yǎng)的海豚鏈球菌相比，35 ℃培養(yǎng)的海豚鏈球菌顯著上調(diào)的基因有820 個(gè)，而顯著下調(diào)的基因只有107 個(gè)。從整體來(lái)看，在較高的培養(yǎng)溫度下（35 ℃）菌株大多數(shù)基因處于上調(diào)狀態(tài)，菌株表現(xiàn)為更加“活躍”的狀態(tài)，而在較低的溫度下（25 ℃）菌株大多數(shù)基因則顯著下調(diào)，菌株顯得相對(duì)不那么“活躍”，具體表現(xiàn)為與糖類、碳類的代謝相關(guān)的基因顯著下調(diào)，而與細(xì)菌毒力相關(guān)的基因則顯著上調(diào)。Mereghetti[31]等在研究無(wú)乳鏈球菌全基因轉(zhuǎn)錄組測(cè)序時(shí)也有類似的發(fā)現(xiàn)，編碼毒力的相關(guān)基因在40 ℃時(shí)上調(diào)表達(dá)，而處于生長(zhǎng)穩(wěn)定期的大量的新陳代謝相關(guān)基因在30 ℃時(shí)上調(diào)表達(dá)。

ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是已知的最大蛋白家族之一，并在細(xì)菌中廣泛存在，其將ATP 水解與各種底物（例如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、肽、固醇、糖、離子及藥物）的主動(dòng)運(yùn)輸結(jié)合在一起[32-33]，這將導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)膜兩側(cè)的物質(zhì)頻繁交換。在本研究中，海豚鏈球菌在35 ℃時(shí)ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)通路相關(guān)的基因顯著上調(diào)，說(shuō)明35 ℃海豚鏈球菌可能涉及各種物質(zhì)參與的能量交換，以及物質(zhì)的合成與代謝。群體感應(yīng)是一種協(xié)同調(diào)節(jié)系統(tǒng)，它以一種被稱為AIP（autoinduc ing peptide）的自誘導(dǎo)肽作為信號(hào)分子，通過(guò)感知菌群密度和環(huán)境因子的變化，并把周圍的環(huán)境信息傳遞到雙組份系統(tǒng)當(dāng)中，再由雙組份系統(tǒng)對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行表達(dá)調(diào)控[34]。一些AIP 的前體肽在核糖體中合成，但是AIP 無(wú)法自由地穿透細(xì)胞壁，因此必須通過(guò)ABC 運(yùn)輸系統(tǒng)或其他的膜通道蛋白進(jìn)入胞外發(fā)揮作用。因此部分上調(diào)表達(dá)的基因同時(shí)參與了ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)通路、雙組份信號(hào)系統(tǒng)通路、群體感應(yīng)通路、脂肪酸代謝和合成通路當(dāng)中的2～3 個(gè)通路，特別是顯著上調(diào)的srtF（K710_0263）基因同時(shí)參與了3 個(gè)通路的表達(dá)調(diào)控，具有重要的研究意義。研究發(fā)現(xiàn)，srtF屬于C 類sortase 家族，主要作用是在細(xì)菌表面形成菌毛并將其固定在細(xì)胞壁上，與細(xì)胞黏附、定植、生物膜形成等環(huán)境過(guò)程相互作用[35]。

在下調(diào)表達(dá)基因中比較典型的是雙組份系統(tǒng)中編碼檸檬酸合酶（Citrate lyase）相關(guān)的基因（K710_0369、K710_0374、K710_0375、K710_0379和K710_1345），由此表明，在35 ℃時(shí)，Tozj-1菌株的三羧酸循環(huán)被抑制，對(duì)葡萄糖的代謝能力明顯降低，而在25 ℃相對(duì)較低的環(huán)境溫度中，其對(duì)葡萄糖的代謝能力表現(xiàn)良好。這與胡文婷[16]研究的無(wú)乳鏈球菌和劉韜[36]研究的魯氏耶爾森菌結(jié)論一致，低溫更有利于病原菌葡萄糖的代謝。并且在35 ℃時(shí)，與磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)、果糖和蔗糖代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝相關(guān)的基因顯著下調(diào)，這證明糖類、碳類的代謝更適合在較低溫度下進(jìn)行。

病原菌的致病過(guò)程與毒力因子的共同介導(dǎo)作用密切相關(guān)。海豚鏈球菌幾種重要的毒力因子包括M 蛋白、磷酸葡萄糖苷酶（pgmA）、溶血素S、C5α 肽酶、脫乙?；?、CAMP 因子。M 蛋白[37]是一種可以通過(guò)莢膜延伸到菌體表面形成菌毛的蛋白，它在細(xì)菌粘附、感染、抵御吞噬等方面起關(guān)鍵作用；磷酸葡萄糖苷酶（pgmA）[38]促進(jìn)細(xì)胞壁和莢膜的生物合成，并能抵抗正電性抗菌肽；溶血素S[39- 40]能破壞宿主紅細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞，有可能對(duì)腦血管造成損傷；C5α 肽酶能水解中性粒細(xì)胞化學(xué)誘導(dǎo)物補(bǔ)體因子C5α，從而破壞宿主細(xì)胞的抗侵襲能力；脫乙?；竅41]能夠提高病原菌對(duì)溶菌酶的耐受性，逃避宿主免疫，黏附并入侵宿主的上皮細(xì)胞；CAMP 因子[42]通過(guò)與FC 區(qū)域的免疫球蛋白結(jié)合，從而有助于攔截抗體向補(bǔ)體呈遞抗原。這些毒力因子相互作用協(xié)助S.iniae侵入宿主，逃避宿主的免疫防御。在本研究中，不同溫度下培養(yǎng)的海豚鏈球菌，其毒力因子呈差異表達(dá)，在35 ℃時(shí)，除了溶血素、黏附素、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子等毒力因子轉(zhuǎn)錄上調(diào)之外，抗逆因子和一些酶類基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量也大幅上升，只有少量的毒力因子下調(diào)表達(dá)。劉志剛等[17]、王松艷[21]和郭富強(qiáng)[29]對(duì)無(wú)乳鏈球菌的研究亦發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果。以上相關(guān)研究結(jié)果均表明，高溫有助于海豚鏈球菌毒力相關(guān)基因表達(dá)，導(dǎo)致其毒力增強(qiáng)，有助于其黏附、定植、入侵、胞內(nèi)存活和擴(kuò)散等致病過(guò)程，引起宿主發(fā)病。

本研究結(jié)果初步證實(shí)溫度能夠廣泛影響海豚鏈球菌基因的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而調(diào)控海豚鏈球菌的致病性，為進(jìn)一步研究海豚鏈球菌的致病機(jī)理提供理論依據(jù)，但其調(diào)控機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究加以闡明。