基于頭發(fā)蛋白質(zhì)組學(xué)區(qū)分個人特質(zhì)的方法學(xué)探究*

吳曉淋 張濤 徐平 張亞莉 張振鵬**

（1）貴州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，貴陽 550025；2）軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院生命組學(xué)研究所，蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點實驗室，國家蛋白質(zhì)科學(xué)中心 （北京），北京蛋白質(zhì)組研究中心，北京 102206；3）中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院蛋白組學(xué)與新藥研發(fā)創(chuàng)新單元，北京 102206）

頭發(fā)是人體的一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的表皮附屬物［1］，主要成分為蛋白質(zhì)、水、脂類、色素和微量金屬元素［2］。蛋白質(zhì)占總量的60%~95%，其中角蛋白（keratin，KRT）與角蛋白相關(guān)蛋白（keratinassociated proteins，KAP）是最主要的蛋白質(zhì)種類。它們相互作用形成交聯(lián)結(jié)構(gòu)，保證頭發(fā)的化學(xué)和機械穩(wěn)定性［3］，使頭發(fā)具有較強的耐久性［4］。人體頭發(fā)的生長周期為2~7年，據(jù)估計，人體每天自然掉落的頭發(fā)數(shù)量約50~100根［5］。各種場景下發(fā)現(xiàn)的頭發(fā)痕跡，在考古學(xué)研究中的人類起源和遺傳演化及犯罪學(xué)研究中的身份鑒定和犯罪嫌疑人追蹤等具有重要意義［6］。

據(jù)文獻(xiàn)報道，可利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究頭發(fā)蛋白質(zhì)組。Zhang等［7］提出基于凝膠法的蛋白質(zhì)組學(xué)方法，分析頭發(fā)樣本蛋白質(zhì)，每個樣本分為10個組分，各組分鑒定到132~214種蛋白質(zhì)。Laatsch等［8］使用鳥槍法蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)探索非裔美國人、高加索人、肯尼亞人和韓國人的頭發(fā)蛋白質(zhì)組，發(fā)現(xiàn)不同種族的人群具有各自獨特的頭發(fā)蛋白表達(dá)水平，主要體現(xiàn)在KRT和KAP兩類蛋白。Parker等［9］對歐美66名受試者頭發(fā)蛋白質(zhì)組表征，共鑒定到401種蛋白質(zhì)，豐度最高的兩類是KRT和KAP等。此外，還有研究表明［10］，人頭發(fā)中Ⅰ型和Ⅱ型角蛋白如KRT33b、KRT81、KRT83和KRT86等可區(qū)分人類的性別和種族。目前尚未有文獻(xiàn)報道使用頭發(fā)蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行個人特質(zhì)區(qū)分。

頭發(fā)蛋白質(zhì)高度交聯(lián)的結(jié)構(gòu)使得其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定［11］、難以被外界因素破壞，蛋白質(zhì)提取量低。已發(fā)展出多種頭發(fā)蛋白質(zhì)的處理方法，包括高溫、高壓、酸、堿或酶等，可以將角蛋白分解成短肽或游離氨基酸［12］。傳統(tǒng)的頭發(fā)處理方法包括物理法和化學(xué)法兩大類。物理法是采用物理外力或條件，如超聲波、振蕩、滾珠研磨等，將頭發(fā)的結(jié)構(gòu)破壞，從而將蛋白質(zhì)釋放出來，其原理是超聲壓力波使頭發(fā)的蛋白質(zhì)分子振蕩并分解、裂解，或用滾珠研磨機或硅膠珠將頭發(fā)樣品壓碎和摩擦，使蛋白質(zhì)分子溶解。化學(xué)法是采用化學(xué)試劑的作用將頭發(fā)蛋白質(zhì)從組織中溶解出來。主要方法包括直接溶解法、酸性裂解法等。直接溶解法使用含有變性劑和蛋白酶抑制劑的緩沖液將頭發(fā)樣品放入高溫高壓的環(huán)境中，使蛋白質(zhì)分子從頭發(fā)釋放。酸性裂解法將頭發(fā)樣品放入酸性溶液并加熱，通過酸性環(huán)境的作用，使蛋白質(zhì)分子從頭發(fā)釋放［13］。

但是頭發(fā)特殊的角蛋白高度交聯(lián)結(jié)構(gòu)，相對其他組織而言更難以提取，所需時間較長。使用單純的加熱或者震蕩方法對頭發(fā)蛋白質(zhì)的提取存在一定程度的缺失，導(dǎo)致鑒定量較少、覆蓋率較低等問題。且在文獻(xiàn)中需要高起始量的頭發(fā)（至少150根1 cm長度的頭發(fā)）用于實驗，在實際應(yīng)用場景中難以滿足。因此，本研究采用混合法結(jié)合物理和化學(xué)法開發(fā)一種基于低起始頭發(fā)量的高效率頭發(fā)蛋白質(zhì)提取方法，提高提取效率。

本研究利用低頭發(fā)起始量（10根1 cm長度的頭發(fā)），系統(tǒng)性探索樣本處理方式對頭發(fā)蛋白質(zhì)的提取效率；在此基礎(chǔ)上探討頭發(fā)蛋白質(zhì)裂解緩沖液成分對蛋白質(zhì)提取的影響，改進(jìn)建立名為PLEE（PTM lab for protein extraction from hair with high efficiency）的頭發(fā)蛋白質(zhì)穩(wěn)定高效提取技術(shù)體系。通過PLEE法對7例樣本的頭發(fā)蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，研究頭發(fā)在識別和區(qū)分不同個體特質(zhì)方面的可行性。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

7例人頭發(fā)樣本（編號為P1至P7），在后頂點離頭皮1 cm處進(jìn)行采樣。其中1例進(jìn)行4次技術(shù)重復(fù)（P7為技術(shù)重復(fù)組，編號為P7-R1至P7-R4）。

1.2 頭發(fā)蛋白質(zhì)提取方法

1.2.1 頭發(fā)樣本預(yù)處理

將10根1 cm長度的頭發(fā)剪成約1 mm長度的碎段，加入1 ml 20%甲醇進(jìn)行清洗，渦旋30 s，離心1 min，更換20%甲醇再次清洗，重復(fù)3次，最后一次吸出上清，頭發(fā)在室溫下自然風(fēng)干后備用。

1.2.2 頭發(fā)樣本處理方法優(yōu)化

a. 玻璃勻漿研磨器法（GH）：頭發(fā)樣品中加入240 μl SDS緩沖液（50 mmol/L Tris（pH=7.5），2% SDS和20 mmol/L DTT），使用玻璃勻漿器（Kimble，Manzanillo，Mexicos）研磨，直到?jīng)]有可見的纖維顆粒，將裂解液體系轉(zhuǎn)移到EP管中。

b. 液氮加硅珠研磨法（LN-BH）：頭發(fā)樣品用研缽在液氮中研磨頭發(fā)碎段，將頭發(fā)碎段放入EP管中，加入240 μl SDS緩沖液，1/3底部的二氧化硅珠（BioSpec，Bartlesville，USA），渦旋提取蛋白質(zhì)30 s，并在冰上靜置30 s，重復(fù)5次。

c. 室溫震蕩提取方法（RTO）：頭發(fā)樣品中加入240 μl 尿素緩沖液（50 mmol/L Tris（pH=7.5），7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲和40 mmol/L DTT），室溫下1 200 r/min的條件下振蕩18 h。

d. 液氮研磨加加熱法（LN-H95）：頭發(fā)樣品用研缽在液氮中研磨，將頭發(fā)碎段放入EP管中，加入240 μl尿素緩沖液，在95℃下加熱5 min。

e. 加熱震蕩法（SH65）：頭發(fā)樣品中加入240 μl SDS緩沖液，65℃下，1 200 r/min的條件下振蕩12 h。

f. 高溫加熱震蕩法（H-90-SH-65）：頭發(fā)樣品中加入120 μl SDS緩沖液，90℃加熱5 h。4℃，17 000g離心，收集上清液作為餾分1（F1）。隨后，將120 μl的SDS緩沖液加入到剩余的頭發(fā)沉淀中，65℃，1 200 r/min下振蕩12 h。4℃，17 000g離心，收集上清液作為餾分2（F2）。F1和F2的混合物被保存為H-90-SH-65法蛋白質(zhì)組樣品的完整蛋白質(zhì)。

1.3 頭發(fā)樣本蛋白裂解緩沖液比較

基于高溫加熱震蕩法（H-90+SH-65）法，分別使用SDS 緩沖液和尿素緩沖液進(jìn)行提取，對裂解液進(jìn)行探索。

SDS緩沖液：50 mmol/L Tris（pH=7.5），2%SDS和20 mmol/L DTT。

尿素緩沖液：50 mmol/L Tris（pH=7.5），7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲和40 mmol/L DTT。

1.4 蛋白質(zhì)質(zhì)量檢測及蛋白質(zhì)定量

使用SDS-PAGE電泳檢測頭發(fā)蛋白質(zhì)提取質(zhì)量，考馬斯亮藍(lán)染色液染色2 h，脫色至背景無色。掃描膠片，使用ScanⅠmage分析，計算灰度值，確定蛋白質(zhì)的濃度及裂解的蛋白質(zhì)質(zhì)量。

1.5 質(zhì)譜樣本制備

各取50 μg蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)酶切。每份樣品加終濃度10 mmol/L DTT，80℃金屬浴還原反應(yīng)10 min后，加40 mmol/L碘乙酰胺（ⅠAM），室溫避光烷基化反應(yīng)30 min。使用SDS-PAGE膠分離，考馬斯亮藍(lán)染色及脫色。將各條帶切為大約1 mm3的膠粒。加入適量脫色液（30%乙腈（acetonitrile，ACN），50 mmol/L NH4HCO3）振蕩30 min，換脫色液繼續(xù)振蕩，直至膠粒無色。加入適量ACN脫水，更換ACN，重復(fù)以上步驟直至膠粒為白色硬顆粒，最后使用真空干燥機蒸干膠粒。取出干燥的膠粒置于冰上，加酶解緩沖液（50 mmol/L NH4HCO3，13.3 mg/L胰蛋白酶（trypsin），6.7 mg/L Lys-C），冰上溶脹40 min，補加酶解緩沖液至沒過膠粒。將酶解體系置于37℃恒溫箱反應(yīng)12~16 h。

酶解后，每管加100 μl抽提液（5%甲酸（formic acid，F(xiàn)A），50% ACN），13 300 r/min常溫離心1 min，靜置4 min，重復(fù)4次。將抽提液上清轉(zhuǎn)移到新的2 ml離心管中。重復(fù)上述步驟1次。

加入ACN彈勻，13 300 r/min常溫離心1 min，轉(zhuǎn)移上清，重復(fù)上述步驟至膠粒變?yōu)榘咨差w粒，將所有抽提液及ACN混勻。使用真空干燥機蒸干樣本，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 液相色譜及質(zhì)譜參數(shù)

溶樣緩沖液（1% ACN，0.1% FA）溶解肽段樣品，濃度調(diào)整至0.2 g/L。使用自動進(jìn)樣器自動進(jìn)樣。選擇LTQ Orbitrap Velos質(zhì)譜儀（Thermo Fisher Scientific，Palo Alto，CA）與UPLC EASY-nLC 1000系統(tǒng)（Thermo Fisher Scientific，Palo Alto，CA）配備一個自封的毛細(xì)管柱（75 μm×15 cm，1.9 μm C18reverse-phase fused-silica）聯(lián)用進(jìn)行質(zhì)譜檢測。

洗脫條件如下。流動相A：98% H2O+2%ACN+0.1% FA；流動相B：100% ACN+0.1% FA。60 min的梯度洗脫樣品：0~6 min，B相由4%升至8%；6~40 min，B相從8%升至26%；40~55 min，B相從26%升至43%；55~56 min，B相從43%升至80%；58~60 min，B相維持80%，流速0.4 μl/min。洗脫的組分直接通過納噴離子源（Nano Spray Ⅰonization，NSⅠ）進(jìn)入質(zhì)譜檢測。

參數(shù)設(shè)置：一級質(zhì)譜掃描離子質(zhì)荷比范圍為300~1 600，分辨率為30 000。自動增益控制（automatic gain control，AGC）設(shè)置為1×106，最大離子注入時間（maximum ion injection time，MⅠT）設(shè)置為50 ms。二級質(zhì)譜采用碰撞誘導(dǎo)解離（collision-induced dissociation，CⅠD）模式碎裂，選取豐度最高的前20個離子進(jìn)行二級碎裂分析，碰撞能量歸一化為35%，AGC的設(shè)置為5×104。動態(tài)排除設(shè)定為50 s避免冗余檢測。

1.7 蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)處理

所有的數(shù)據(jù)原始文件都由MaxQuant（1.6.17版）對照UniProt數(shù)據(jù)庫（2017年3月版，Uniprot，https://www.uniprot.org/）中的蛋白質(zhì)FASTA文件進(jìn)行搜索。搜庫參數(shù)：非標(biāo)（lable free）定量方法，選擇iBAQ值；胰蛋白酶的特異性消化；最多允許2次漏切；最小肽的長度設(shè)定為7個氨基酸；前體質(zhì)量偏差小于20×10-6；MS/MS質(zhì)量偏差小于0.5 u；固定修飾為Carbamidomethyl（C），可變修飾為Oxidation（M），Acetyl（Protein N-term）；肽和蛋白質(zhì)水平上的錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）小于1%。使用Perseus（1.6.6.0版）［14］對所有樣品進(jìn)行基于質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組學(xué)實驗的統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PLEE法可高效、穩(wěn)定提取頭發(fā)蛋白質(zhì)

采用低的頭發(fā)起始量（10根1 cm長度的頭發(fā)），從樣本處理方法和裂解液成分兩方面優(yōu)化頭發(fā)蛋白質(zhì)提取效率和質(zhì)量，流程如圖1a所示。采用相同起始量的蛋白質(zhì)裂解液進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，使用考馬斯亮藍(lán)染色，將各方法的條帶進(jìn)行灰度定量量化蛋白質(zhì)提取量，以最高的方法為100%，根據(jù)灰度比例計算各方法的蛋白質(zhì)提取效率（圖1b），GH法和LN-BH法的頭發(fā)蛋白質(zhì)提取效率較低，分別為1%和0.48%，而RTO法和LNH95法的頭發(fā)提取效率則分別為43.25%和13.20%，高于GH法和LN-BH法。然而，RTO法和LN-H95法在3個重復(fù)中的提取穩(wěn)定性較低。SH-65法能夠以高效率和穩(wěn)定性在3次重復(fù)中提取蛋白質(zhì)，提取率為66.52%~86.48%。H-90-SH-6法從頭發(fā)中高效提取最多含量的蛋白質(zhì)，且在3個生物重復(fù)中具有良好重現(xiàn)性。H-90-SH-65法提取的平均效率比SH-65法高出22.71%，與其他提取方法相比，效率至少增加1.3倍。結(jié)果顯示，強烈的物理震蕩和長時間的煮沸處理明顯提高蛋白質(zhì)的提取效率。比較使用SDS緩沖液和尿素緩沖液提取頭發(fā)蛋白質(zhì)的效率（圖1c）。結(jié)果表明，SDS緩沖液提取的蛋白質(zhì)是尿素緩沖液提取蛋白質(zhì)的1.67倍。

Fig. 1 PLEE method for effective hair protein extraction

通過比較頭發(fā)樣本處理方法和裂解液成分，在SDS緩沖液的作用下，結(jié)合強沖擊和長時間加熱，可高效提取頭發(fā)中的蛋白質(zhì)。本研究中將H-90-SH-65法和SDS 緩沖液相結(jié)合的技術(shù)流程命名為PLEE （PTM lab for protein extraction from hair with high efficiency）法。

2.2 基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可穩(wěn)定高效鑒定頭發(fā)蛋白質(zhì)

基于質(zhì)譜可穩(wěn)定、高效地分析PLEE法提取頭發(fā)蛋白質(zhì)。采集7例頭發(fā)樣本，使用PLEE法蛋白質(zhì)提取，通過膠內(nèi)消化和質(zhì)譜分析獲取質(zhì)譜數(shù)據(jù)，其中P7樣本重復(fù)提取檢測4次，評估流程穩(wěn)定性。對產(chǎn)出質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制分析，85%的肽段二級譜譜圖數(shù)在1~2之間（圖2a），82%的肽段長度分布在8~20個氨基酸殘基之間（圖2b），99%的肽段評分分布在40~380之間（圖2c），99.9%的肽段質(zhì)量偏差在5×10-6之內(nèi)（圖2d）。結(jié)果提示，質(zhì)譜數(shù)據(jù)質(zhì)量較好，鑒定結(jié)果可靠。

Fig. 2 Mass spectrometry quality control analysis

蛋白質(zhì)組學(xué)分析頭發(fā)樣本蛋白質(zhì)鑒定情況（表1），樣本鑒定到總蛋白質(zhì)數(shù)量在169~229之間，其中角蛋白和角蛋白相關(guān)蛋白的數(shù)量在46~49之間。對P7樣本的4次技術(shù)重復(fù)分析，共同鑒定蛋白質(zhì)131種（圖3a），重復(fù)間的定量值進(jìn)行分析結(jié)果顯示各重復(fù)間的定量值分布（圖3b）及累計曲線（圖3c）相似，具有強的相關(guān)性系數(shù)，均為0.99及以上（圖3d）。表明基于PLEE法和質(zhì)譜的頭發(fā)蛋白質(zhì)組學(xué)流程穩(wěn)定、重復(fù)性高。

Table 1 Search results in MaxQuant based on the PLEE method

Fig. 3 Proteomics analysis of technical replicates

2.3 個體的頭發(fā)蛋白質(zhì)組學(xué)差異分析

分析各樣本的鑒定蛋白質(zhì)種類及共鑒定蛋白質(zhì)分布的情況，發(fā)現(xiàn)不同個體的頭發(fā)蛋白質(zhì)組成和占比存在差異。10份樣本共有蛋白質(zhì)為107種（圖4a），各樣本非共有蛋白質(zhì)種類在57~119之間（圖4b），其中5例樣本（P1、P3、P4、P5、P7-R4）各鑒定到1種獨特蛋白（PARP4、RRP15、SERPⅠNB4、ANK3、MACF1），1例（P6）鑒定到2種獨特蛋白（TUBA1C、TPP1）（圖4c，表2）。選擇共有蛋白質(zhì)對所有樣本進(jìn)行定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析。主成分分析（圖4d）及聚類分析（圖4e）結(jié)果顯示，技術(shù)重復(fù)樣本聚為一類，不同樣本被區(qū)分。以上結(jié)果提示，不同個體間存在獨特鑒定的蛋白質(zhì)，且共有蛋白質(zhì)在不同個體間定量值存在差異。

Fig. 4 Proteomics analysis among different samples

篩選在不同個體來源的頭發(fā)中表達(dá)量差異大、在同個體中穩(wěn)定鑒定的頭發(fā)蛋白質(zhì)簇。P1~P6樣本中的定量值方差最大的30個蛋白質(zhì)進(jìn)行定量值分布情況可視化，其中有17個為KRT或KAP（KRT33A、KRTAP9-6、KRT6A、KRTAP2-2、KRT83、KRTAP3-2、KRTAP7-1、KRTAP19-5等）（圖5a）。篩選4個技術(shù)重復(fù)中定量值方差最小的30個蛋白質(zhì)（圖5b）。同時符合兩個條件的10個蛋白為：KRT33A、KRTAP9-6、KRT83、KRTAP7-1、KRT32、BLMH、KRT38、KRTAP11-1、NPAS1、KRTAP4-3（圖5c，表3）。這些蛋白質(zhì)在不同樣本間的分布存在顯著差異，在同個體的不同技術(shù)重復(fù)內(nèi)穩(wěn)定鑒定。

Table 2 Protein statistics uniquely present in a sample

Fig. 5 Screening of differentially expressed proteins among different samples

Table 3 Statistics of proteins expressed stably between the same individuals and expressed differently between different individuals

3 結(jié)論

追蹤人員身份的方法包括DNA檢測［15］、指紋識別［16］、面部識別、虹膜識別［17］等。然而，這些方法都有一定的限制和缺陷。例如，在DNA檢測中，樣本污染或者樣本量不足導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確，指紋識別可能會出現(xiàn)誤判或者無法識別，面部識別和虹膜識別會受到光線、角度等因素的影響，導(dǎo)致識別失?。?8-19］。并且這些技術(shù)都需要預(yù)先錄入人員的信息，才能通過比對確定身份。在刑偵和考古工作中，經(jīng)常出現(xiàn)追蹤人員身份的困難。偵查人員搜集到的犯罪人員信息有限，考古人員在工作中存在人員身份、年代確認(rèn)的問題。在現(xiàn)場，往往能追尋頭發(fā)樣品的蹤跡。頭發(fā)可長時間穩(wěn)定儲存，可記錄身體一段時間內(nèi)的狀態(tài)［20-22］。頭發(fā)的特殊蛋白質(zhì)和結(jié)構(gòu)成分使蛋白質(zhì)在室溫下保持穩(wěn)定，對頭發(fā)蛋白質(zhì)組進(jìn)行更多的生物學(xué)信息挖掘可作為區(qū)分個體特質(zhì)的有效手段，從而進(jìn)行身份追蹤［23］。

為提高頭發(fā)蛋白質(zhì)的提取率和提取質(zhì)量，對樣本處理方法和蛋白質(zhì)裂解緩沖液進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示，與SH-65方法相比，H-90-SH-65方法的提取率增加22.71%，比另外4種方法至少增加1.3倍。強烈的物理震蕩和長時間煮沸都有助于有效地從頭發(fā)中提取蛋白質(zhì)。SDS緩沖液的蛋白質(zhì)提取效率為尿素緩沖液的1.67倍。且PLEE法在3個生物學(xué)重復(fù)的提取效率具有高度的重現(xiàn)性，表明PLEE法對頭發(fā)蛋白質(zhì)的提取效率高效且穩(wěn)定。

通過對質(zhì)譜的質(zhì)量檢測及技術(shù)重復(fù)分析，表明該流程穩(wěn)定且高效的。對不同個人的特質(zhì)頭發(fā)蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。在10份樣本共有的蛋白質(zhì)為107種。每個樣本中還含有57~119種非共有蛋白質(zhì)，其中部分樣本鑒定出1~2種獨特蛋白質(zhì)。這提示，對個體特異性蛋白質(zhì)的鑒定有望作為個人特質(zhì)的區(qū)分。另外，發(fā)現(xiàn)在樣本間表達(dá)存在較大差異的蛋白質(zhì)，且在同個體的技術(shù)重復(fù)間穩(wěn)定表達(dá)的10個蛋白質(zhì)：KRT33A、KRTAP9-6、KRT83、KRTAP7-1、KRT32、BLMH、KRT38、KRTAP11-1、NPAS1、KRTAP4-3。這些蛋白質(zhì)有望作為區(qū)分個體特質(zhì)的關(guān)鍵蛋白。

綜上所述，基于PLEE方法的頭發(fā)蛋白質(zhì)組學(xué)提供不同個體之間更詳細(xì)的生物學(xué)信息，表明角蛋白及角蛋白相關(guān)蛋白是至關(guān)重要的一類蛋白質(zhì)，可以用于區(qū)分個人特質(zhì)?；赑LEE法的頭發(fā)蛋白質(zhì)組學(xué)研究將是下一代強大而有用的工具。還可用于洗滌劑有效性評估和頭發(fā)健康評估?；诓煌磉_(dá)的蛋白質(zhì)簇用于區(qū)分個體特質(zhì)的靈敏性、準(zhǔn)確性還有待進(jìn)一步探索。

致謝感謝北京國家蛋白質(zhì)科學(xué)中心的孫浩帆博士在實驗中提供的幫助。