TEAD1轉(zhuǎn)錄本的鑒定及其在雞前脂肪細(xì)胞中的功能研究*

彭敏 徐虎 賈子秋 楊清竹 潘林 王維禹 孔令喆 孫嬰寧

（齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院生物技術(shù)系，齊齊哈爾 161006）

脂肪組織不僅是生物體的主要組成部分，也是重要的內(nèi)分泌器官和能量?jī)?chǔ)存組織［1］。脂肪堆積過(guò)多會(huì)導(dǎo)致肥胖［2］，同時(shí)引起多種肥胖相關(guān)疾病，包括2型糖尿病、代謝綜合征、癌癥、神經(jīng)性疾病和心血管疾?。?］等。脂肪細(xì)胞起源于中胚層多能干細(xì)胞。中胚層多能干細(xì)胞先分化成脂肪母細(xì)胞，接著脂肪母細(xì)胞向前脂肪細(xì)胞分化，前脂肪細(xì)胞通過(guò)增殖、分化形成成熟脂肪細(xì)胞，大量成熟脂肪細(xì)胞構(gòu)成脂肪組織［4］。前脂肪細(xì)胞的增殖和脂肪細(xì)胞中的脂質(zhì)過(guò)度積累是導(dǎo)致肥胖的主要原因［5］。雞是研究人類肥胖和肥胖相關(guān)疾病的潛在模型［6］。深入了解肉雞脂肪沉積的分子機(jī)制，不僅有助于控制雞體內(nèi)脂肪的過(guò)度沉積，對(duì)于控制人類肥胖發(fā)生也具有一定參考。

TEAD轉(zhuǎn)錄因子家族（TEAD transcription factors family，TEADs）在各種生物過(guò)程和人類疾病中發(fā)揮重要作用［7］。該家族成員均包含一個(gè)N端TEA結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C端YAP結(jié)合域（YBD），其中TEA結(jié)構(gòu)域在家族成員中非常保守，能夠與下游基因的M-CAT結(jié)合并且調(diào)控下游基因的表達(dá)［8］。TEAD轉(zhuǎn)錄因子4（TEAD transcription factor 4，TEAD4）在脂肪形成過(guò)程中，直接靶向脂肪形成的關(guān)鍵因子過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）的表達(dá)，并且通過(guò)輔助因子VGLL4和CtBP2募集到轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中來(lái)抑制小鼠脂肪形成［9］。TEAD轉(zhuǎn)錄因子1（TEAD transcription factor 1，TEAD1）又名TEF-1，最初是在鑒定與SV40增強(qiáng)子結(jié)合并激活轉(zhuǎn)錄的核蛋白時(shí)被發(fā)現(xiàn)的［10］。TEAD1在小鼠前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中呈先升高再降低的表達(dá)模式。目前TEAD1的功能還不清楚。為此，本研究克隆了TEAD1基因的全長(zhǎng)CDS區(qū)序列，發(fā)現(xiàn)并鑒定了兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本TEAD1-V1和TEAD1-V2。本研究進(jìn)一步揭示了TEAD1兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本的亞細(xì)胞定位，及其在雞前脂肪細(xì)胞增殖、遷移、凋亡和分化中的功能。研究結(jié)果有助于深入了解TEAD家族功能，并且為進(jìn)一步完善雞脂肪組織發(fā)育的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組織和細(xì)胞系

麻雞購(gòu)自中國(guó)黑龍江齊齊哈爾齊興雞場(chǎng)。飼養(yǎng)至7周齡時(shí)被宰殺，收集腹部脂肪、心臟、胸肌、腎臟、肌胃、腿肌、肝臟、肌胃周?chē)?、腺胃、胰腺、卵巢、十二指腸、脾臟、腦、空腸和回腸等16種組織，液氮速凍并儲(chǔ)存于-80℃，直到RNA提取。動(dòng)物工作遵循中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部制定的法規(guī)，并經(jīng)齊齊哈爾大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：2006-398）。

永生化雞前脂肪細(xì)胞1（immortalized chicken preadipocyte 1，ⅠCP1）細(xì)胞系及雞胚成纖維細(xì)胞系（chicken embryo fibroblast cells line，DF-1）由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部雞遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。ⅠCP1細(xì)胞系利用帶有雞端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（chicken telomerase reverse transcriptase，chTERT）基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染雞原代前體脂肪細(xì)胞，而后通過(guò)藥物篩選培養(yǎng)獲得［11］。ⅠCP1細(xì)胞系具有與原代前脂肪細(xì)胞相同的形態(tài)和分化特征，已被廣泛用于研究雞脂肪形成研究［12］。雞原代肌內(nèi)前脂肪細(xì)胞［13］（intramuscular preadipocytes，ⅠMP）和肌衛(wèi)星細(xì)胞［14］（muscle satellite cells，MuSCs）通過(guò)細(xì)胞體外分離培養(yǎng)方法獲得。

1.2 雞TEAD1轉(zhuǎn)錄本克隆及載體構(gòu)建

pCMV-HA質(zhì)粒購(gòu)自美國(guó)Clontech公司。根據(jù)NCBⅠ網(wǎng)站Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)提供的雞TEAD1基因（NM_001199405.1）序列，以ⅠCP1細(xì)胞系cDNA為模板，克隆雞TEAD1基因編碼區(qū)片段，引物信息見(jiàn)表1。反應(yīng)體系為：模板cDNA 5 μl，上、下游引物（10 μmol/L）各2 μl，DNA Buffer 25 μl，dNTP 1 μl，ddH2O 14 μl，Taq酶1 μl。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95°C，3 min；變性95°C，15 s；退火72°C，15 s；延伸72°C，30 s；進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。利用同源重組試劑盒（Vazyme，南京），將PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物連接在pCMV-HA載體上，構(gòu)建真核表達(dá)載體pCMV-HA-TEAD1-V1和pCMV-HA-TEAD1-V2。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

ⅠCP1細(xì)胞系使用添加10%胎牛血清（Biological Ⅰndustries，以色列）和1%青霉素-鏈霉素溶液（Beyotime，上海）的DMEM/F-12培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)），于37°C、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞匯合度至70%~75%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染按照LipofectaminTM8000轉(zhuǎn)染試劑（Beyotime）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。轉(zhuǎn)染6 h后更換1次培養(yǎng)基，48 h后收集細(xì)胞。

1.4 間接免疫熒光

將細(xì)胞接種于底部放置爬片的6孔板中，37℃、5% CO2培養(yǎng)。待細(xì)胞匯合度為60%~80%時(shí)，分別轉(zhuǎn)染pCMV-HA-TEAD1-V1、pCMV-HATEAD1-V2和空載體pCMV-HA。48 h后，4%的多聚甲醛固定30 min。采用0.3% Triton X-100的PBS透化5~10 min。500 μl 5% BSA封閉液室溫封閉1 h。一抗anti-HA（CST，#3724，稀釋比例1∶20）置于爬片上倒扣，室溫孵育2 h。二抗anti-Rabbit（LⅠ-COR，680LT，稀釋比例1∶50），室溫孵育1 h。Hoechst33342染核10 min。滴入抗熒光猝滅劑，制片，用激光共聚焦顯微鏡（Leica，德國(guó)）觀察。

1.5 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和RT-qPCR

采用Trizol（Takara，日本）法提?、馛P1細(xì)胞系和各組織總RNA。反轉(zhuǎn)錄按照HiScript?ⅠⅠ Q Select RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）（Vazyme）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。第一步反應(yīng)體系為：模板1 pg~1 μg，4×gDNA去除劑4 μl，低聚核苷酸（Oligo）1 μl，低聚六聚體引物（random hexamers）1 μl，ddH2O至16 μl，42°C反應(yīng)2 min。第一步反應(yīng)液16 μl，反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃，15 min；80°C，15 s。第二步反應(yīng)體系為5×HiScript ⅠⅠ Select qRT SuperMix ⅠⅠ 4 μl，RT-qPCR反應(yīng)按照ChamQTMSYBR?qPCR Master Mix（Without ROX）（Vazyme）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。反應(yīng)體系為：2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10 μl，cDNA模板2 μl，上、下游引物（10 μmol/L）各0.4 μl，ddH2O 7.2 μl，反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性30 s，95°C變性10 s，55°C退火延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以NONO或TBP為內(nèi)參基因，利用2-ΔΔCt算法將原始Ct值轉(zhuǎn)換為基因相對(duì)表達(dá)量。所用引物信息詳見(jiàn)表1和表S1。

Table 1 Primer sequences

1.6 EdU檢測(cè)

使用BeyoClick? EdU-488細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（Beyotime）按照試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)ⅠCP1細(xì)胞系增殖情況進(jìn)行檢測(cè)。將真核表達(dá)載體pCMVTEAD1-V1和pCMV-TEAD1-V2以及空載體pCMVHA轉(zhuǎn)染至ⅠCP1細(xì)胞系48 h后，每孔吸走1 ml細(xì)胞培養(yǎng)基后加入1 ml 37°C預(yù)熱的2×EdU-DMEM/F-12細(xì)胞培養(yǎng)基，搖勻后于37°C、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h。使用倒置熒光顯微鏡（Zeiss，德國(guó)）進(jìn)行觀察并拍照，使用Ⅰmage J進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.7 CCK-8檢測(cè)

將ⅠCP1細(xì)胞系接種至96孔板，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置5個(gè)孔重復(fù)，將真核表達(dá)載體pCMV-TEAD1-V1和pCMV-TEAD1-V2以及空載體pCMV-HA轉(zhuǎn)染至ⅠCP1細(xì)胞系，于0、24、48 和72 h向每孔中避光加入10 μl CCK-8試劑（Apexbio，美國(guó)），搖勻后于37°C、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h，使用酶標(biāo)儀（帝肯，上海）測(cè)定在450 nm處的吸光值（A450）。

1.8 劃痕實(shí)驗(yàn)

將ⅠCP1細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，待匯合度達(dá)70%~80%時(shí)，用無(wú)菌的l0 μl白色微量移液器吸頭劃痕，棄培養(yǎng)基，用PBS洗去劃掉的細(xì)胞，加入新的培養(yǎng)基。然后分別轉(zhuǎn)染pCMV-HA-TEAD1-V1和pCMV-HA-TEAD1-V2以及空載體pCMV-HA，培養(yǎng)0、24和48 h，于倒置顯微鏡（Zeiss）下觀察拍照。

1.9 Hoechst33342染色

將ⅠCP1細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，培養(yǎng)過(guò)夜。分別轉(zhuǎn)染pCMV-HA-TEAD1-V1和pCMV-HATEAD1-V2以及空載體pCMV-HA至ⅠCP1細(xì)胞系，48 h后，0.5 ml固定液固定10 min。PBS清洗后，0.5 ml Hoechst33342染色液（Beyotime）染色5 min。PBS清洗后，采用抗熒光猝滅封片液封片，熒光顯微鏡（Zeiss）進(jìn)行觀察并拍照。

1.10 誘導(dǎo)分化及油紅O染色

采用160 μmol/L油酸（Sigma，美國(guó)）對(duì)6孔板中培養(yǎng)的ⅠCP1細(xì)胞系進(jìn)行誘導(dǎo)分化，分別誘導(dǎo)0、12、24、48、72和96 h提取總RNA。檢測(cè)過(guò)表達(dá)TEAD1兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本對(duì)于ⅠCP1細(xì)胞分化的影響時(shí)，將ⅠCP1細(xì)胞系接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞60%~70%匯合，轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體pCMV-HA-TEAD1-V1、pCMV-HA-TEAD1-V2或空載體pCMV-HA，24 h后更換含160 μmol/L油酸的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)至48 h，10%多聚甲醛固定30 min，用油紅O染液避光染色50 min，60%異丙醇洗去浮色，倒置顯微鏡（Olympus，北京）觀察拍照。用100 μl異丙醇室溫孵育15 min后，加入3倍體積的異丙醇稀釋后提取染料，采用酶標(biāo)儀（帝肯，上海）測(cè)量510 nm處吸光值（A510）。

1.11 BODIPY493/503染色

向5 mg BODⅠPY493/533粉末（GlpBio，美國(guó)，CA，GC42969）中避光加入4 ml二甲基亞砜（DMSO），混勻后4°C冰箱中避光保存。分化后的ⅠCP1細(xì)胞采用4%多聚甲醛固定40 min；加1 ml 60%異丙醇后立即吸出；1 ml BODⅠPY 493/503（1∶1 250）染液室溫避光染色15 min；1 ml Hoechst33342染液（1∶1 000稀釋）室溫避光染核10 min，采用倒置熒光顯微鏡（Zeiss）觀察拍照。

1.12 蛋白質(zhì)印跡（Western blot）分析

將ⅠCP1細(xì)胞系接種至6孔板，分別轉(zhuǎn)染pCMV-HA-TEAD1-V1、pCMV-HA-TEAD1-V2及pCMV-HA質(zhì)粒，誘導(dǎo)分化48 h后，使用RⅠPA裂解液（含1% PMSF）（Beyotime）提取細(xì)胞中總蛋白質(zhì)。SDS-PAGE電泳分離樣品，將蛋白質(zhì)樣品轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗4°C過(guò)夜孵育，二抗室溫孵育1 h。使用Western blot一抗二抗去除液（Beyotime）洗膜，與β-actin抗體重新雜交。使用Odyssey雙色紅外熒光成像（LⅠ-COR，美國(guó)）掃膜。所用一抗包括：anti-HA（CST，美國(guó)，#3724）、C/EBPα（Abmart，上海，6223-1）、FAS（Beyotime，AF6861）、PPARγ（Beyotime，AF7797）、FABP4（Beyotime，AF6843）、β-actin（Beyotime，AF0003）。對(duì)應(yīng)二抗除β-actin抗體為anti-Mouse（LⅠ-COR，美國(guó)，680RD），其余抗體均為anti-Rabbit（LⅠ-COR，680LT）。

1.13 熒光素酶活性檢測(cè)

熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-promoter-C/EBPα［15］、pGL3-promoter-FABP4［16］、pGL3-promoter-FAS［17］和pGL3-promoter-PPARγ［18］參考文獻(xiàn)方法構(gòu)建。將ⅠCP1細(xì)胞接種至24孔板，分別將上述雙熒光素酶報(bào)告基因載體與海腎熒光素酶報(bào)告基因載體pRL-TK以及真核表達(dá)載體pCMV-HATEAD1-V1、pCMV-HA-TEAD1-V2或pCMV-HA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染比例為50∶50∶1，轉(zhuǎn)染48 h后，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（Promega，美國(guó)）按照說(shuō)明書(shū)測(cè)定熒光素酶活性。相對(duì)表達(dá)量為螢火蟲(chóng)熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

1.14 甘油三酯（TG）檢測(cè)

將ⅠCP1細(xì)胞系接種至6孔板，分別轉(zhuǎn)染pCMV-HA-TEAD1-V1、pCMV-HA-TEAD1-V2及pCMV-HA質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染24 h后油酸鈉誘導(dǎo)分化48 h，采用甘油三脂（TG）測(cè)試盒（建成，南京）利用酶標(biāo)儀（帝肯）測(cè)量A510，測(cè)量方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.15 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析及網(wǎng)址

采用Clustal Omega（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）在線工具進(jìn)行多序列比對(duì)。在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站SignaⅠP 5.0（https://services.healthtech.dtu.dk/）預(yù)測(cè)信號(hào)肽。在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站Prosite（https://prosite.expasy.org/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)功能位點(diǎn)。在線預(yù)測(cè)軟件PSORTⅠⅠ（https://www.genscript.com/psort.html）預(yù)測(cè)核定位序列（NLS）。在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站W(wǎng)oLF PSORT（https://wolfpsort.hgc.jp/）預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位。

1.16 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad prism5.0進(jìn)行作圖分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（mean±SEM）表示。數(shù)據(jù)分布正態(tài)性采用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)，利用Minitab17 Box-Cox將非正態(tài)分布數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為正態(tài)分布數(shù)據(jù)再進(jìn)行下一步統(tǒng)計(jì)分析。兩組比較采用Student’st檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），并進(jìn)行Duncan’s多重比較。除特殊注明外，體外實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 雞TEAD1轉(zhuǎn)錄本克隆與鑒定

以ⅠCP1細(xì)胞的cDNA為模板，克隆雞TEAD1基因全長(zhǎng)編碼區(qū)片段。通過(guò)Sanger測(cè)序和雙酶切鑒定，與NCBⅠ網(wǎng)站雞TEAD1基因序列對(duì)比，鑒定出兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本，分別命名為T(mén)EAD1-V1和TEAD1-V2。轉(zhuǎn)錄本TEAD1-V1長(zhǎng)度為1 239 bp，轉(zhuǎn)錄本TEAD1-V2長(zhǎng)度為1 176 bp（圖1a）。Western blot分析顯示TEAD1-V1和TEAD1-V2的真核表達(dá)載體構(gòu)建成功（圖1b）。轉(zhuǎn)錄本TEAD1-V2與轉(zhuǎn)錄本TEAD1-V1相比缺失一個(gè)外顯子，缺失長(zhǎng)度為63 bp（圖1c）。

Fig. 1 Identification and cloning of TEAD-V1/V2 in chicken

2.2 雞TEAD1轉(zhuǎn)錄本的生物信息學(xué)分析及亞細(xì)胞定位

轉(zhuǎn)錄本TEAD1-V1和TEAD1-V2分別編碼412個(gè)氨基酸和391個(gè)氨基酸。將兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本和鼠TEAD1（AAH60138.1）的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，通過(guò)NCBⅠ上蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域（conserved domains）分析，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本都在N端含有1個(gè)TEA結(jié)構(gòu)域，但是TEAD1-V2比TEAD1-V1缺少8個(gè)氨基酸，并且存在1個(gè)外顯子的序列差異（圖2）。利用在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站SignaⅠP 5.0對(duì)TEAD1轉(zhuǎn)錄本編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示TEAD1兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本均無(wú)信號(hào)肽。通過(guò)Prosite預(yù)測(cè)TEAD1兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本表達(dá)蛋白的功能位點(diǎn)。發(fā)現(xiàn)TEAD1兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本表達(dá)蛋白都含有5類功能活性位點(diǎn)，包括酪蛋白激酶ⅠⅠ磷酸化位點(diǎn)、酰胺化位點(diǎn)、蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、N-肉豆蔻?；稽c(diǎn)和N-糖基化位點(diǎn)，其中TEAD1-V1在199~201位氨基酸處比TEAD1-V2多一個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)TaK（表S2）。利用PSORTⅠⅠ在線軟件對(duì)TEAD1兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本表達(dá)蛋白中存在的假定NLS進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示：TEAD1-V1蛋白有3條假定的核定位序列pNLS1、pNLS2和pNLS3；TEAD1-V2蛋白有2條假定的核定位序列pNLS1和pNLS2（表S3）。

Fig. 2 The TEA domain of the TEAD1-V1/V2 proteins

在WOLF PSORT網(wǎng)站對(duì)TEAD1轉(zhuǎn)錄本表達(dá)蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果顯示，TEAD1-V1蛋白定位于細(xì)胞核（nucl：32），TEAD1-V2蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)膜（cyto：18，nucl：9，plas：5）。為了驗(yàn)證這一結(jié)果，采用間接免疫熒光在激光共聚焦顯微鏡下觀察，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pCMV-HA-TEAD1-V1的ⅠCP1細(xì)胞主要在細(xì)胞核中觀察到綠色熒光，轉(zhuǎn)染pCMV-HA-TEAD1-V2的ⅠCP1細(xì)胞在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核內(nèi)均觀察到綠色熒光（圖3）。

Fig. 3 Subcellular localization of TEAD1-V1/V2

2.3 TEAD1轉(zhuǎn)錄本對(duì)前脂肪細(xì)胞增殖的影響

RT-qPCR結(jié)果顯示：過(guò)表達(dá)TEAD1-V1能下調(diào)Ki67、Cyclin E、Cyclin D1和PCNA基因mRNA表達(dá)，其中Ki67和Cyclin E顯著下調(diào)（P<0.05，圖4a）；過(guò)表達(dá)TEAD1-V2同樣下調(diào)Ki67、Cyclin E、Cyclin D1和PCNA基因mRNA表達(dá)，其中Cyclin E顯著下調(diào)（P<0.05，圖4b）。CCK-8和EdU結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染TEAD1-V1和TEAD1-V2過(guò)表達(dá)載體能顯著抑制ⅠCP1細(xì)胞系增殖（P<0.05，圖4c~e）。

Fig. 4 Effects of TEAD1-V1/V2 overexpression on ICP1 cell proliferation

2.4 TEAD1轉(zhuǎn)錄本對(duì)雞前脂肪細(xì)胞遷移的影響

在劃痕試驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染48 h后，過(guò)表達(dá)TEAD1-V1能顯著促進(jìn)ⅠCP1細(xì)胞遷移（P<0.01），而TEAD1-V2對(duì)ⅠCP1細(xì)胞遷移沒(méi)有影響（P>0.05，圖5）。

Fig. 5 Effects of TEAD1-V1/V2 overexpression on ICP1 cell migration

2.5 TEAD1轉(zhuǎn)錄本對(duì)雞前脂肪細(xì)胞凋亡的影響

Hoechst33342染色結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)TEAD1-V1和TEAD1-V2的ⅠCP1細(xì)胞大多呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染。而轉(zhuǎn)染pCMV-HA空載體的ⅠCP1細(xì)胞核呈橢圓形藍(lán)色，提示TEAD1兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本能顯著促進(jìn)ⅠCP1細(xì)胞凋亡（P<0.001，圖6a）。對(duì)凋亡相關(guān)基因檢測(cè)，過(guò)表達(dá)TEAD1-V1和TEAD1-V2均能上調(diào)Caspase-3、Caspase-9、Bax和BCL-2基因mRNA表達(dá)（P<0.05，圖6b，c）。

Fig. 6 Effects of TEAD1-V1/V2 overexpression on ICP1 cell apoptosis

2.6 雞TEAD1轉(zhuǎn)錄本在不同組織、細(xì)胞及脂肪形成過(guò)程的表達(dá)分析

利用RT-qPCR檢測(cè)7周齡麻雞各組織中TEAD1-V1和V2的mRNA表達(dá)水平，引物擴(kuò)增區(qū)域如圖1c所示。結(jié)果顯示，雞TEAD1轉(zhuǎn)錄本在16種組織中普遍表達(dá)，并且TEAD1-V1和TEAD1-V2的表達(dá)模式相似，兩個(gè)TEAD1轉(zhuǎn)錄本在心臟、胰腺、肝臟和脾臟的表達(dá)最高，在腹部脂肪、肌胃脂肪、胸肌和腎臟等11種組織檢測(cè)到中等水平表達(dá)，在卵巢中的表達(dá)最低（P<0.05，圖7a，b）。檢測(cè)TEAD1轉(zhuǎn)錄本在ⅠCP1細(xì)胞系［11］、DF-1細(xì)胞系［19］、MuSCs細(xì)胞［20］和ⅠMP細(xì)胞［21］中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本均在ⅠCP1細(xì)胞中表達(dá)最高，在其他3種細(xì)胞表達(dá)相對(duì)較低（P<0.05，圖7c，d）。檢測(cè)TEAD1轉(zhuǎn)錄本在雞ⅠCP1細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中的mRNA水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TEAD1-V1和TEAD1-V2的mRNA水平在0~72 h表達(dá)呈下降趨勢(shì)，但在96 h表達(dá)量顯著升高（P<0.05，圖7e，f）。提示兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本可能在ⅠCP1細(xì)胞系過(guò)程中發(fā)揮作用。

Fig. 7 Relative RNA expression of TEAD1-V1/V2

2.7 TEAD1轉(zhuǎn)錄本對(duì)前脂肪細(xì)胞分化的影響

為了明確兩個(gè)TEAD1轉(zhuǎn)錄本在雞前脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的作用，利用油紅O和BODⅠPY檢測(cè)過(guò)表達(dá)TEAD1-V1和TEAD1-V2對(duì)ⅠCP1細(xì)胞系脂滴積累的影響，結(jié)果顯示：過(guò)表達(dá)TEAD1-V1能顯著減少ⅠCP1細(xì)胞中脂滴的積累（P<0.05）；而過(guò)表達(dá)TEAD1-V2對(duì)脂滴積累沒(méi)有顯著影響（P>0.05，圖8a，b）。再通過(guò)RT-qPCR、Western blot和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)過(guò)表達(dá)TEAD1轉(zhuǎn)錄本對(duì)成脂相關(guān)基因的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平及啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因活性影響。RT-qPCR、Western blot和雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示：過(guò)表達(dá)TEAD1-V1能顯著下調(diào)C/EBPα的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平（P<0.01），抑制C/EBPα的啟動(dòng)子活性（P<0.01，圖8c，e，g）；過(guò)表達(dá)TEAD1-V2能顯著下調(diào)C/EBPα的mRNA表達(dá)（P<0.01）和啟動(dòng)子活性（P<0.01），同時(shí)顯著上調(diào)FAS基因mRNA表達(dá)和啟動(dòng)子活性（P<0.05，圖8d，f），但是對(duì)成脂標(biāo)志基因的蛋白質(zhì)表達(dá)水平?jīng)]有明顯作用（P>0.05，圖8g）。過(guò)表達(dá)TEAD1-V1能顯著降低ⅠCP1細(xì)胞中甘油三脂的含量（P<0.05），而過(guò)表達(dá)TEAD1-V2對(duì)ⅠCP1細(xì)胞中甘油三酯含量沒(méi)有影響（P>0.05，圖8h）。這些結(jié)果提示，TEAD1-V1能抑制雞前脂抑制肪細(xì)胞分化，而TEAD1-V2對(duì)雞前脂肪細(xì)胞分化沒(méi)有顯著影響。

Fig. 8 Effects of TEAD1-V1/V2 overexpression on ICP1 cell differentiation

3 討論

TEAD1是一種轉(zhuǎn)錄激活因子，最初在人類HeLa細(xì)胞中鑒定，并特異性結(jié)合SV40增強(qiáng)子序列中的GT-ⅠⅠC和Sph基序［22］。TEAD1在乳腺癌和膀胱癌的發(fā)生中發(fā)揮重要作用［23］。另外，TEAD1是維持成人心肌細(xì)胞功能所必需的，其缺失導(dǎo)致致死性擴(kuò)張型心肌?。?4］。小鼠TEAD1基因的缺失導(dǎo)致心臟畸形，甚至胚胎死亡［25］。雞TEAD1突變能降低骨骼肌α肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子功能［26］。TEAD1在小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中表達(dá)先升高后降低［9］，提示該基因在脂肪形成中也發(fā)揮作用。本研究在雞ⅠCP1細(xì)胞中首次克隆TEAD1基因編碼區(qū)全長(zhǎng)序列，并成功地鑒定出兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本，TEAD1-V1和TEAD1-V2。此外，本文發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)TEAD1轉(zhuǎn)錄本在雞體內(nèi)各組織中及不同的細(xì)胞中具有相似的表達(dá)模式。TEAD1-V1轉(zhuǎn)錄本能抑制前脂肪細(xì)胞分化和遷移，而TEAD1-V2對(duì)前脂肪細(xì)胞分化和遷移沒(méi)有明顯作用，同時(shí)，兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本均抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡。研究結(jié)果為深入研究TEAD1在雞體內(nèi)的功能和作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。雞是研究脂肪組織和肥胖的潛在模型［27］，本研究也為進(jìn)一步控制雞體內(nèi)脂肪過(guò)度沉積和人類肥胖提供理論參考。

TEAD轉(zhuǎn)錄因子是幾種致癌信號(hào)通路的核效應(yīng)因子，包括Hippo、WNT、TGF-β和EGFR通路，TEAD家族的亞細(xì)胞定位調(diào)節(jié)了這些影響腫瘤的通路的功能輸出［28］。Hou等［29］實(shí)驗(yàn)證明，TEAD1亞細(xì)胞定位在細(xì)胞核來(lái)影響心肌細(xì)胞發(fā)生病變。本研究通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和間接免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄本TEAD1-V1主要定位于細(xì)胞核，轉(zhuǎn)錄本TEAD1-V2定位于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核。TEAD1-V1有3條假定的NLS；TEAD1-V2只有2條假定的NLS。TEAD1-V2比TEAD1-V1缺少63個(gè)氨基酸，核定位序列pNLS3位于這一區(qū)域。因此推測(cè)pNLS3是導(dǎo)致TEAD1兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本核定位不同的因素之一。

目前研究發(fā)現(xiàn)，TEAD家族的表達(dá)在許多癌癥類型中上調(diào)，包括胃癌、結(jié)腸直腸癌、乳腺癌和前列腺癌［30］。除了它在癌癥中的公認(rèn)作用外，Osman等［31］實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)證實(shí)，TEAD1能促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖。本研究過(guò)表達(dá)TEAD1轉(zhuǎn)錄本V1和V2能夠下調(diào)細(xì)胞增殖重要的標(biāo)志基因Ki67、Cyclin E、Cyclin D1和PCNA基因的表達(dá)，同時(shí)EdU和CCK-8等試驗(yàn)證明TEAD1兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本能夠抑制雞前脂肪細(xì)胞增殖。上述結(jié)果表明，TEAD1對(duì)不同細(xì)胞增殖的調(diào)控作用可能是細(xì)胞或組織特異性引起的。今后有必要利用流式細(xì)胞術(shù)，進(jìn)一步探究TEAD1轉(zhuǎn)錄本對(duì)前脂肪細(xì)胞周期的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，雞TEAD1轉(zhuǎn)錄本抑制雞前脂肪細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。TEAD1是Hippo信號(hào)通路的主要效應(yīng)子，Hippo信號(hào)通路通過(guò)控制這些過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)控基因來(lái)調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和凋亡［32］。在哺乳動(dòng)物中，當(dāng)Hippo途徑關(guān)閉時(shí)，TEAD1和其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，以調(diào)節(jié)下游效應(yīng)物的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制凋亡［33］?？梢酝茰y(cè)，TEAD1轉(zhuǎn)錄本可能通過(guò)調(diào)控Hippo信號(hào)通路，抑制雞前脂肪細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Yuan等［34］和Grelet等［35］實(shí)驗(yàn)證實(shí)，不同轉(zhuǎn)錄本之間具有不同的生物學(xué)功能。而Zhang等［36］實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LncFAM200B的4個(gè)轉(zhuǎn)錄本在抑制牛前脂肪細(xì)胞增殖方面具有相似的功能。在本研究中，TEAD1的兩種轉(zhuǎn)錄本在雞前脂肪細(xì)胞增殖和凋亡方面中也具有相似的功能，具體的作用機(jī)制需要進(jìn)一步研究。本文的發(fā)現(xiàn)提示，TEAD1及其轉(zhuǎn)錄本可能是雞脂肪過(guò)度沉積和人類肥胖的潛在治療靶點(diǎn)。

TEAD1基因在人的多種組織中廣泛表達(dá)，包括骨骼肌、胰腺、胎盤(pán)、肺和心臟［37］。這與本研究的結(jié)果相一致，兩個(gè)TEAD1轉(zhuǎn)錄本均在各組織中大量表達(dá)，其中包括胰腺、心臟和脂肪組織等，這表明TEAD1轉(zhuǎn)錄本在多種組織中發(fā)揮功能。兩個(gè)TEAD1轉(zhuǎn)錄本在ⅠCP1細(xì)胞中高表達(dá)，但是隨著誘導(dǎo)分化的進(jìn)行，表達(dá)量顯著下降，提示兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本可能對(duì)前脂肪細(xì)胞分化存在抑制作用。TEAD1在小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中表達(dá)先升高后降低［9］，這與本研究TEAD1-V1/V2在雞ⅠCP1誘導(dǎo)分化過(guò)程中的表達(dá)模式不同。推測(cè)這與雞和哺乳動(dòng)物的脂肪形成存在差異［38］有關(guān)。

脂肪細(xì)胞分化是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，在適當(dāng)?shù)拇碳は?，前脂肪?xì)胞會(huì)發(fā)生細(xì)胞形態(tài)變化并最終分化為圓形成熟脂肪細(xì)胞［1］。脂肪細(xì)胞分化涉及PPARγ與C/EBPα轉(zhuǎn)錄因子的相互作用［39］。C/EBPα是分化“開(kāi)關(guān)”的組成部分［40］。Hop2與轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα相互作用并抑制脂肪細(xì)胞分化［41］。本研究發(fā)現(xiàn)，TEAD1-V1能下調(diào)C/EBPα啟動(dòng)子活性，并且調(diào)控C/EBPα基因mRNA和蛋白質(zhì)水平表達(dá)。C/EBPα能夠結(jié)合并激活許多脂肪特異性基因的啟動(dòng)子活性，例如，在前脂肪細(xì)胞分化的早期，活化的C/EBPα能夠正反饋促進(jìn)PPARγ表達(dá)，PPARγ又能進(jìn)一步激活脂滴包被蛋白（lipid-drop coated protein，PLⅠN1）［42］和脂肪酸結(jié)合蛋白（fatty acidbinding protein 4，F(xiàn)ABP4）的表達(dá)，最終引起脂滴積累增大，前脂肪細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞［43］。結(jié)合上述數(shù)據(jù)，本研究推測(cè)，TEAD1-V1可能通過(guò)調(diào)控C/EBPα轉(zhuǎn)錄來(lái)抑制雞前脂肪細(xì)胞分化。真核細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)控存在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控和翻譯后水平調(diào)控，而mRNA水平的變化可能跟轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控有關(guān)，翻譯受到嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控，多出來(lái)的mRNA不一定會(huì)被翻譯［44］。TEAD1-V2能引起分化標(biāo)志基因C/EBPα的轉(zhuǎn)錄水平變化，但是對(duì)蛋白質(zhì)水平?jīng)]有影響，推測(cè)可能受到一些microRNA和LncRNA的轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控。另外，兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本過(guò)表達(dá)之后影響的標(biāo)志基因不同。TEAD1-V1轉(zhuǎn)錄本TEA結(jié)構(gòu)域比TEAD1-V2長(zhǎng)9 bp，這個(gè)結(jié)構(gòu)域能夠與下游靶基因基因結(jié)合［45］。兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本TEA結(jié)構(gòu)域不一樣，因此結(jié)合調(diào)控的下游基因不同。本研究因缺少雞TEAD1抗體，并未開(kāi)展蛋白質(zhì)水平的研究。今后有必要制備雞TEAD1轉(zhuǎn)錄本抗體，開(kāi)展染色質(zhì)免疫共沉淀（ChⅠP）及免疫共沉淀（Co-ⅠP）研究，進(jìn)一步分析TEAD1轉(zhuǎn)錄本在前脂肪細(xì)胞中的作用機(jī)制。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究首次鑒定出了雞TEAD1基因的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本，TEAD1-V1和TEAD1-V2。通過(guò)亞細(xì)胞定位分析TEAD1-V1轉(zhuǎn)錄本主要定位于細(xì)胞核，TEAD1-V2轉(zhuǎn)錄本定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄本TEAD1-V1和TEAD1-V2均能夠抑制雞前脂肪細(xì)胞增殖并促進(jìn)雞前脂肪細(xì)胞凋亡；TEAD1-V1能抑制前脂肪細(xì)胞分化并促進(jìn)前脂肪細(xì)胞遷移，而TEAD1-V2對(duì)前脂肪細(xì)胞分化和遷移沒(méi)有影響。

附件見(jiàn)本文網(wǎng)絡(luò)版（http://www.pibb.ac.cn或http://www.cnki.net）：

PⅠBB_20230020_Table_S1.pdf

PⅠBB_20230020_Table_S2.pdf

PⅠBB_20230020_Table_S3.pdf