m6A識(shí)別蛋白YTHDF1對(duì)杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥的改善作用及其機(jī)制

鄭妍妍，王燕，李蓓

西安市兒童醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西西安 710002

杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(Duchenne muscular dystrophy，DMD)是一種X染色體連鎖的隱性遺傳病，由編碼抗肌萎縮蛋白(dystrophin)的基因突變所致。分裂的成肌細(xì)胞是肌肉生長(zhǎng)和維持所必需的，而成肌細(xì)胞的有限生長(zhǎng)能力與DMD的進(jìn)行性肌肉退化特征直接相關(guān)[1-2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，全球新生男嬰DMD 患病率為1/3500[3]，而目前臨床尚無(wú)有效療法。因此，研究DMD發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制對(duì)實(shí)現(xiàn)該病的早期診斷、干預(yù)具有重要的臨床意義。DMD基因位于染色體Xp21，編碼含有3685個(gè)氨基酸的dystrophin(427 kD)。肌細(xì)胞膜表面存在抗肌萎縮-糖蛋白復(fù)合物(dystrophin-associated protein complex，DAPC)，可維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性和細(xì)胞膜內(nèi)外的傳遞運(yùn)輸功能，而dystrophin 是DAPC 的重要組成部分[4]。N6-甲基腺苷(m6A)修飾是真核生物RNA 中最廣泛的內(nèi)部修飾，參與多個(gè)生物學(xué)過(guò)程。不同的閱讀蛋白(包括YTHDF、YTHDC 和IGFBP 等家族蛋白)可特異性識(shí)別m6A 修飾，并調(diào)節(jié)RNA 的穩(wěn)定性[5]。研究發(fā)現(xiàn)，m6A 修飾在肌肉干細(xì)胞維持、肌細(xì)胞增殖和分化中發(fā)揮重要作用[6]。Yes1 相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(Yes1 associated transcriptional regulator，YAP1)是一種轉(zhuǎn)錄輔助因子，可促進(jìn)細(xì)胞增殖以及調(diào)節(jié)器官發(fā)育和再生，最近研究發(fā)現(xiàn)，在DMD 心臟組織中YAP1 活性明顯降低；而抑制YAP1 活性可明顯降低DMD 多能干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)DMD心肌病的發(fā)生[7]，但YAP1 是否通過(guò)調(diào)節(jié)m6A 修飾水平調(diào)控肌細(xì)胞增殖尚不明確。本研究通過(guò)檢測(cè)DMD患者和健康人群肌肉組織中YTHDF1 和dystrophin 的表達(dá)水平，觀察過(guò)表達(dá)或干擾YTHDF1 對(duì)人骨骼肌成肌細(xì)胞增殖的影響，探究YTHDF1對(duì)DMD中成肌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其潛在作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、Ham's F-10 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑、DMEM 培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素、慶大霉素購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；人表皮生長(zhǎng)因子(human epidermal growth factor，hEGF)、地塞米松、L-谷氨酰胺、胰蛋白酶-EDTA 溶液購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；YTHDF1 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒AAV-YTHDF1及YTHDF1 小干擾RNA(si-YTHDF1) 購(gòu)自美國(guó)Addgene 公司；PrimeScript RT-PCR 試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa 公司；BCA 蛋白含量測(cè)定試劑盒、EdU 試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific 公司；磷酸肌酸激酶(creative phospho kinase，CPK) ELISA試劑盒購(gòu)自上?？祈樕锟萍加邢薰?；anti-YTHDF1 抗體、antidystrophin 抗體、anti-YAP1 抗體、anti-肌細(xì)胞生成素(myogenin，MyoG)抗體、anti-肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain，MHC)抗體、anti-m6A 抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；Magna RIP RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀試劑盒、Magna甲基化RNA免疫沉淀(MeRIP) m6A試劑盒購(gòu)自美國(guó)Millipore 公司；放線菌素D 購(gòu)自武漢艾美捷科技有限公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀購(gòu)自德國(guó)Eppendorf 公司；Thermo Varioskan? LUX 多功能酶標(biāo)儀、NanoDrop 2000 分光光度儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；Western blotting 轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自北京凱元信瑞儀器有限公司；蛋白電泳儀及配套電泳槽購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司；凝膠成像儀購(gòu)自英國(guó)Uvitec Cambridge 公司；倒置普通光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司。

1.2 標(biāo)本收集 收集2016 年9 月－2017 年6 月于西安市兒童醫(yī)院確診并進(jìn)行手術(shù)的38 例DMD 患者(設(shè)為DMD 組)和33 例接受骨科手術(shù)且與DMD 患者年齡匹配(2～3 歲)的患者(未患有其他干擾性疾病，設(shè)為對(duì)照組)的肌肉組織和血液樣本(入院時(shí)采集，于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)病理和(或)基因檢測(cè)確診為DMD；(2)年齡<18 歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)不能配合完成檢查；(2)病理及影像資料不完整；(3)存在MRI檢查禁忌證。本研究經(jīng)西安市兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(20160918-1F)，所有受試者或監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書。

1.2.1 RT-qPCR 檢 測(cè)YTHDF1mRNA 水 平 使 用Trizol 試劑提取肌肉組織總RNA，并用Prime Script RT 試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR Premix Ex TaqⅡ在ABI 7500 實(shí)時(shí)PCR 系統(tǒng)中進(jìn)行實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR。PCR反應(yīng)體系(20 μl)：cDNA 2 μl、Taq聚合酶0.4 μl、上下游引物各0.8 μl、ddH2O 6 μl、2×SYBR綠色PCR 混合液10 μl。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 20 s、56 ℃ 10 s、72 ℃ 15 s，35 個(gè) 循 環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計(jì)算YTHDF1mRNA相對(duì)表達(dá)水平。引物序列如表1所示。

表1 RT-qPCR引物序列Tab.1 Primer sequences of RT-qPCR

1.2.2 Western blotting檢測(cè)YTHDF1、dystrophin蛋白表達(dá)水平 提取肌肉組織總蛋白，使用BCA 蛋白含量測(cè)定試劑盒進(jìn)行蛋白定量。上樣行SDS-PAGE 電泳，并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上；加入5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST 清 洗；加 入YTHDF1、dystrophin 抗 體(1:1000)4 ℃孵育過(guò)夜；TBST清洗，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠/兔IgG 抗體(1:500)室溫孵育1 h。使用ECL Plus 化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行曝光，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)拍片，以GAPDH為內(nèi)參照，ImageJ軟件進(jìn)行定量分析。

1.2.3 血清CPK 含量檢測(cè) 取血液樣本，1000×g離心10 min，收集上清，按照CPK ELISA試劑盒說(shuō)明書步驟檢測(cè)血清CPK含量。

1.2.4 YTHDF1 蛋白表達(dá)水平與血清CPK 含量的相關(guān)性分析 采用Pearson 相關(guān)性分析YTHDF1 蛋白表達(dá)水平與血清CPK含量的相關(guān)性。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人類骨骼肌細(xì)胞系(SkMC)由中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞中心提供，置于含hEGF、地塞米松、L-谷氨酰胺和慶大霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，補(bǔ)充10% FBS，于37 °C、5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.3.1 過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建及siRNA 合成 根據(jù)NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中YTHDF1 編碼區(qū)(CDS)序列，設(shè)計(jì)上下游分別含有XhoI和BamHI酶切位點(diǎn)的PCR 引物擴(kuò)增目的片段，雙酶切、膠回收純化后將其連接于進(jìn)行相同雙酶切處理的腺病毒表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，過(guò)夜培養(yǎng)。第2 天挑取單克隆搖菌，提取質(zhì)粒后經(jīng)XhoI和BamHI雙酶切鑒定及測(cè)序后，確認(rèn)載體構(gòu)建成功。參照腺病毒包裝規(guī)程進(jìn)行病毒包裝，并進(jìn)行滴度檢測(cè)。YTHDF1siRNA及其陰性對(duì)照(NC siRNA)由廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)、合成。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SkMC 細(xì)胞，接種于6孔板中(接種密度105個(gè)/cm2)。設(shè)置空載體組(轉(zhuǎn)染 對(duì) 照 空 載 體)、 AAV-YTHDF1 組( 轉(zhuǎn) 染AAVYTHDF1 過(guò)表達(dá)載體)與Scrambled 組(轉(zhuǎn)染NC siRNA)、si-YTHDF1 組(轉(zhuǎn)染YTHDF1siRNA)，待細(xì)胞融合至70%時(shí)，使用Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后于37 ℃培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞。

1.3.2.1 Western blotting 檢測(cè)YTHDF1過(guò)表達(dá)或敲低效率 提取各組SkMC 細(xì)胞總蛋白，采用Western blotting 檢測(cè)YTHDF1 蛋白表達(dá)水平，一抗YTHDF1抗體稀釋比例為1∶1000。操作步驟同1.2.2。

1.3.2.2 EdU 法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 根據(jù)EdU 試劑盒說(shuō)明書步驟，使用5-乙基-2-脫氧尿苷(EdU)摻入法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況。加入EdU 孵育細(xì)胞約2 h，4%多聚甲醛溶液固定30 min，0.5% Triton X-100 孵育15 min，染色反應(yīng)液孵育30 min。細(xì)胞核用Hoechst染色。隨機(jī)選取5個(gè)區(qū)域于顯微鏡下觀察拍片。

1.3.2.3 Western blotting 檢 測(cè)dystrophin、 YAP1、MyoG、MHC 蛋白表達(dá)水平 提取SkMC 細(xì)胞總蛋白，采用Western blotting 檢測(cè)dystrophin、YAP1、MyoG、MHC 蛋白表達(dá)水平，操作步驟同1.2.2。一抗dystrophin 抗體、YAP1 抗體、MyoG 抗體和MHC抗體稀釋比例為1∶1000。

1.3.2.4 RT-qPCR檢測(cè)YTHDF1、YAP1mRNA表達(dá)水平 使用Trizol 試劑提取SkMC 細(xì)胞總RNA，采用RT-qPCR 檢測(cè)YTHDF1、YAP1mRNA 表達(dá)水平，操作步驟同1.2.1。

1.3.3 SRAMP在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè) 采用SRAMP在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)YAP1mRNA序列中的m6A修飾位點(diǎn)。

1.3.4 RNA免疫沉淀反應(yīng)(RIP)檢測(cè)YTHDF1與YAP1mRNA的結(jié)合情況 根據(jù)Magna RIP RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行RIP 測(cè)定。用補(bǔ)充有蛋白酶和RNase抑制劑的RNA裂解緩沖液裂解SkMC細(xì)胞，并在4 ℃下用涂有anti-YTHDF1 抗體、antim6A 抗體或IgG 的蛋白A/G 磁珠培養(yǎng)細(xì)胞裂解物過(guò)夜。洗滌后，純化免疫沉淀RNA，然后采用RTqPCR進(jìn)行定量分析。

1.3.5 mRNA 穩(wěn)定性檢測(cè) 轉(zhuǎn)染YTHDF1siRNA 16 h后，使用轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D 干預(yù)，收取干預(yù)0、2、4、8及16 h的細(xì)胞，提取總RNA，用酶標(biāo)儀檢測(cè)RNA 濃度，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，通過(guò)RT-qPCR 檢測(cè)YAP1mRNA表達(dá)水平，分析降解速率。

1.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 30 只雄性SPF 清潔級(jí)Mdx 小鼠，4 周齡，體重10～18 g，購(gòu)自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(陜)2016-005]，飼養(yǎng)于12 h 光照/12 h 黑暗交替、溫度(22±3) ℃、濕度45%～60%環(huán)境下，自由攝食飲水。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)西安市兒童醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(20160918-1F)。

1.4.1 DMD小鼠模型構(gòu)建 將30只Mdx小鼠隨機(jī)分為空載體組與AAV-YTHDF1組，每組15只?？蛰d體組腹腔注射200 μl 空載體，AAV-YTHDF1 組腹腔注射200 μl AVV-YTHDF1。注射時(shí)間為第1 天、第1 次注射后48 h、第1次注射后15 d。每天監(jiān)測(cè)小鼠的飲食、呼吸、精神狀態(tài)和體重。距第1 次注射20 周處死小鼠，采集肌肉組織和器官，檢測(cè)肌肉組織和器官濕重、纖維直徑及纖維類型。

1.4.2 Western blotting檢測(cè)YTHDF1、dystrophin蛋白表達(dá)水平 將肌肉組織制備為組織勻漿液，采用Western blotting檢測(cè)YTHDF1、dystrophin蛋白表達(dá)水平，具體操作同1.2.2。

1.4.3 HE染色 小鼠處死后立即取后肢腓腸肌和股四頭肌，組織塊大小不超過(guò)0.5 cm3。用0.9%生理鹽水漂洗血液與污漬，將組織放入包埋盒中，迅速浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定，常規(guī)切片后行HE 染色，于顯微鏡下觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以xˉ±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 YTHDF1在DMD患者肌肉組織中的表達(dá)情況RT-qPCR和Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，DMD 組患者肌肉組織中YTHDF1mRNA 和蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P<0.01或P<0.001，圖1A、B)。ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，DMD 組患者血清CPK含量明顯增加(P<0.001，圖1C)。Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，DMD患者YTHDF1蛋白表達(dá)水平與血清CPK 含量呈負(fù)相關(guān)(r2=0.8658，P<0.0001，圖1D)。Western blotting 檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，DMD 組患者肌肉組織中dystrophin 蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01，圖1E)。

圖1 兩組患者肌肉組織中YTHDF1、dystrophin表達(dá)水平及血清CPK含量比較Fig.1 Comparison of YTHDF1 and dystrophin expression levels in muscle tissue and serum CPK content between DMD patients and control peoples

2.2 過(guò)表達(dá)YTHDF1對(duì)肌細(xì)胞增殖和dystrophin表達(dá)的影響 Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與空載體組比較，AAV-YTHDF1組SkMC細(xì)胞中YTHDF1蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01，圖2A)，表明YTHDF1 過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)成功。與空載體組比較，AAV-YTHDF1 組SkMC 細(xì)胞中dystrophin、MyoG 和MHC 蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01，圖2B)。EdU檢測(cè)結(jié)果顯示，與空載體組比較，AAV-YTHDF1 組EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率明顯增高(P<0.01，圖2C)。

圖2 過(guò)表達(dá)YTHDF1對(duì)肌細(xì)胞增殖及dystrophin、MyoG和MHC蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effects of overexpression of YTHDF1 on myocyte proliferation and expression levels of dystrophin, MyoG and MHC

2.3 敲低YTHDF1對(duì)肌細(xì)胞增殖和dystrophin表達(dá)的影響 Western blotting 檢測(cè)結(jié)果顯示，與Scrambled組比較，si-YTHDF1 組SkMC 細(xì)胞中YTHDF1蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01，圖3A)，表明YTHDF1 敲低實(shí)驗(yàn)成功。與Scrambled 組比較，si-YTHDF1 組SkMC 細(xì)胞中dystrophin、MyoG 和MHC 蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01，圖3B)。EdU檢測(cè)結(jié)果顯示，與Scrambled 組 比 較，si-YTHDF1 組EdU 陽(yáng) 性 細(xì) 胞 率 明顯降低(P<0.05，圖3C)。

圖3 敲低YTHDF1對(duì)肌細(xì)胞增殖和dystrophin、MyoG和MHC蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effects of YTHDF1 knockdown on myocyte proliferation and expression levels of dystrophin, MyoG and MHC

2.4 YTHDF1與YAP1mRNA的相互作用 SRAMP在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，YAP1mRNA 上存在多個(gè)m6A 修飾位點(diǎn)(圖4A)；RIP 檢測(cè)結(jié)果顯示，Anti-YTHDF1 抗 體 組 中YAP1mRNA 富 集， 而Anti-YTHDF1抗體組與IgG抗體組中dystrophinmRNA含量無(wú)明顯差異(圖4B)；anti-m6A 抗體組中YAP1mRNA富集(圖4C)，表明YTHDF1通過(guò)識(shí)別YAP1mRNA 的m6A修飾與YAP1mRNA相互作用。

圖4 YTHDF1蛋白與YAP1 mRNA的相互作用Fig.4 The interaction between YTHDF1 protein and YAP1 mRNA

2.5 YTHDF1 對(duì)YAP1 表達(dá)和YAP1mRNA 穩(wěn)定性的影響 Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與空載體組比較，AAV-YTHDF1 組YAP1 蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)；與Scrambled 組比較，si-YTHDF1 組YAP1蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01，圖5A)。放線菌素D干預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空載體組比較，AAV-YTHDF1組YAP1mRNA半衰期延長(zhǎng)，同一時(shí)間點(diǎn)YAP1mRNA降解減少(P<0.001，圖5B)。

2.6 YTHDF1對(duì)DMD小鼠肌肉生長(zhǎng)和肌肉質(zhì)量的影響 AAV-YTHDF1 組與空載體組小鼠初次注射時(shí)體重?zé)o明顯差異(P>0.05)，但20 周時(shí)，AAV-YTHDF1組小鼠體重較空載體組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖6A)。Western blotting 檢測(cè)結(jié)果顯示，與空載體組比較，AAV-YTHDF1 組小鼠肌肉組織中YTHDF1 和dystrophin 蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.01，圖6B)。與空載體組比較，AAV-YTHDF1組小鼠腓腸肌、股四頭肌、三頭肌肌肉重量增加(P<0.05)；但兩組腹股溝、性腺或腹膜后脂肪墊重量無(wú)明顯差異(P>0.05，圖6C)。HE 染色結(jié)果顯示，與空載體組比較，AAV-YTHDF1 組小鼠炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，壞死面積縮小，組織病理學(xué)改變明顯得到改善(P<0.05)；此外，與空載體組比較，AAV-YTHDF1組小鼠腓腸肌和股四頭肌纖維面積明顯增大(P<0.05，圖6D)。

圖6 YTHDF1對(duì)DMD小鼠肌肉生長(zhǎng)和肌肉質(zhì)量的影響Fig.6 Effect of YTHDF1 on muscle growth and muscle mass in DMD mice

3 討 論

DMD是最常見(jiàn)的遺傳性神經(jīng)性肌肉病，起病隱匿且預(yù)后差，大多數(shù)患者早期無(wú)明顯臨床癥狀，導(dǎo)致診斷困難和誤診。在美國(guó)，DMD從癥狀開(kāi)始到確診約有2.5年的延遲，而在全球其他地區(qū)，延遲時(shí)間則更長(zhǎng)[8]。DMD 是一種主要影響男孩的疾病，其特征是進(jìn)行性肌肉退行性變和萎縮，導(dǎo)致心肌病和呼吸衰竭，最終導(dǎo)致患兒過(guò)早死亡[9]。

DMD 的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)是dystrophin基因突變[10]。Dystrophin基因突變導(dǎo)致dystrophin 蛋白突變，而dystrophin位于肌細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)面，是一種大型支架蛋白，可與相關(guān)糖蛋白組成DAPC[10-11]。DAPC 將細(xì)胞外基質(zhì)錨定到細(xì)胞骨架上，使肌肉纖維抵抗損傷的能力明顯增強(qiáng)，是肌肉收縮過(guò)程中維持肌膜結(jié)構(gòu)完整性的關(guān)鍵蛋白[12]。雖然多數(shù)骨骼肌的初始形成在發(fā)育過(guò)程中不受阻礙，但由于與肌肉收縮相關(guān)的機(jī)械應(yīng)力導(dǎo)致外周膜受損，肌肉纖維會(huì)隨著個(gè)體的成熟而迅速退化[13]。隨著疾病的加重，被稱為衛(wèi)星細(xì)胞的骨骼肌祖細(xì)胞無(wú)法充分增殖和分化以替代受損的肌肉纖維[14]。有報(bào)道顯示，可以利用內(nèi)源性機(jī)制促進(jìn)肌細(xì)胞持續(xù)增殖來(lái)維持骨骼肌的再生能力，減輕DMD造成的損害[15]。

Dystroglycan 1 又稱為dystrophin 相關(guān)糖蛋白，通常與dystrophin 形成蛋白復(fù)合物發(fā)揮作用。Dystroglycan 1 可直接與Hippo 通路的效應(yīng)因子YAP1結(jié)合，抑制小鼠心肌細(xì)胞的增殖，當(dāng)編碼dystroglycan 1 的基因被敲除時(shí)，這種相互作用被破壞，而Hippo 誘導(dǎo)的YAP1 磷酸化增強(qiáng)了YAP1 與dystroglycan 1 的 相 互 作 用[12]。YAP1 作 為Hippo 信 號(hào)通路下游的關(guān)鍵效應(yīng)因子，可調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖和凋亡，控制器官發(fā)育和再生，以及維持正常組織的穩(wěn)態(tài)，在多種生理病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，dystrophin 與Hippo 信號(hào)通路的關(guān)鍵激酶Wts 存在相互作用，并且dystrophin 能夠通過(guò)結(jié)合Wts 調(diào)控果蠅的器官發(fā)育[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，DMD 患者肌肉組織中dystrophin表達(dá)水平明顯降低；過(guò)表達(dá)YTHDF1 可促進(jìn)肌細(xì)胞增殖，使dystrophin 蛋白表達(dá)水平升高；敲低YTHDF1 可抑制肌細(xì)胞增殖，使dystrophin蛋白表達(dá)水平降低。

YAP1作為潛在的致癌基因[18]，目前研究主要集中于YAP1 上下游分子的篩選[19]；然而，關(guān)于YAP1表達(dá)水平調(diào)控的機(jī)制尚未完全清楚。m6A 修飾是真核細(xì)胞中最豐富的RNA 內(nèi)部修飾，可被m6A 結(jié)合蛋白(reader)識(shí)別，包括YTHDF1-3、IGF2BP1-3 和YTHDC1-2[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常肌肉組織比較，m6A 識(shí)別蛋白YTHDF1 在DMD 肌肉組織中表達(dá)降低。既往研究發(fā)現(xiàn)，YTHDFs 可識(shí)別YAP1mRNA 的m6A 修飾，其可通過(guò)與m6A 修飾的mRNA 結(jié)合來(lái)提高穩(wěn)定性，從而促進(jìn)YAP1的表達(dá)[21-24]。本研究結(jié)果證實(shí)了這一現(xiàn)象，即過(guò)表達(dá)YTHDF1 通過(guò)延長(zhǎng)YAP1mRNA的半衰期來(lái)穩(wěn)定YAP1mRNA表達(dá)。

MyoG和MHC是成肌細(xì)胞分化過(guò)程中骨骼肌特異性表達(dá)的關(guān)鍵基因。MyoG是骨骼肌分化的決定因子，調(diào)控成肌細(xì)胞融合和肌纖維形成[25]，MyoG敲除小鼠因無(wú)肌肉形成，在胚胎期死亡[26]；MHC是構(gòu)成骨骼肌纖維內(nèi)粗肌絲的主要成分。肌纖維類型主要由肌纖維內(nèi)表達(dá)的MHC 類型決定[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)YTHDF1 可促進(jìn)MyoG 和MHC 蛋白的表達(dá)；敲低YTHDF1可抑制MyoG和MHC蛋白的表達(dá)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，YTHDF1 通過(guò)識(shí)別YAP1mRNA 的m6A 修飾促進(jìn)YAP1mRNA 的穩(wěn)定性，進(jìn)而促進(jìn)YAP1/dystrophin 介導(dǎo)的肌細(xì)胞增殖，改善DMD 小鼠的肌肉萎縮。未來(lái)可進(jìn)一步完善DMD 肌肉萎縮的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以為DMD 的診斷及治療提供理論依據(jù)和新的視角。