未折疊蛋白反應(yīng)在熱射病中的作用研究進展

彭宇亮，寇久社，吳優(yōu)，方宗平，張西京*

1陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院針灸康復(fù)科，陜西咸陽 712000；2空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，陜西西安710032

熱射病(heat stroke，HS)是一種由熱損傷導(dǎo)致的嚴重威脅生命的疾病，其特征為核心體溫>40 ℃，并伴有中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙及多器官衰竭。根據(jù)發(fā)病原因及易感人群的不同，HS 可分為經(jīng)典型HS及勞力型HS。經(jīng)典型HS 與高溫高濕環(huán)境及散熱不良密切相關(guān)，多發(fā)生于幼兒、孕婦及年老體衰者，以及有慢性基礎(chǔ)疾病或免疫功能受損的個體。勞力型HS是由激烈運動中的產(chǎn)熱與散熱失衡所致，常見于運動員、軍人及高溫環(huán)境下作業(yè)的工人[1]。據(jù)估計，美國城市居民HS 的發(fā)病率為(17.6～26.5)/100萬[2]。1995 年，芝加哥的熱浪造成數(shù)百人死亡，這是20世紀最致命的熱浪之一。隨著全球變暖，熱浪的發(fā)生將變得更加頻繁并劇烈，有可能增高HS的病死率。HS在病理生理改變方面表現(xiàn)為熱誘導(dǎo)的細胞毒性、炎癥反應(yīng)及多器官衰竭[3-4]。當機體初始暴露于高溫環(huán)境中時，體溫調(diào)節(jié)功能被迅速激活，抑制繼續(xù)產(chǎn)熱，并增強散熱，進而維持核心體溫穩(wěn)定；同時，機體發(fā)生熱應(yīng)激反應(yīng)，快速減輕熱相關(guān)蛋白變性等病理變化，從而抵御熱相關(guān)性損傷。當機體持續(xù)暴露于高溫環(huán)境中，體溫調(diào)節(jié)中樞受損后無法維持產(chǎn)熱與散熱平衡，機體出現(xiàn)難以控制的高溫，熱應(yīng)激反應(yīng)功能受損，細胞內(nèi)出現(xiàn)熱相關(guān)性病理損傷，最終發(fā)展為HS[5]。

未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)被認為是熱應(yīng)激反應(yīng)中的一個重要組成部分。根據(jù)未折疊蛋白發(fā)生的位置，UPR 被分為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)UPR(endoplasmic reticulum unfolded protein response， UPRer) 及 線 粒 體UPR(mitochondrial unfolded protein response，UPRmt)。機體暴露于熱環(huán)境后，蛋白的折疊及降解能力嚴重受損[6]，產(chǎn)生了錯誤折疊或未折疊的蛋白并沉積于細胞質(zhì)內(nèi)，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)及線粒體功能障礙，最終導(dǎo)致細胞死亡[7-8]。為了改善熱環(huán)境引起變性蛋白沉積相關(guān)性的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及線粒體功能障礙，機體通過UPR 消除錯誤折疊或未折疊的蛋白，該過程中轉(zhuǎn)錄大量伴侶蛋白及蛋白酶以發(fā)揮作用[9]。當機體持續(xù)暴露于熱環(huán)境中時，UPR 功能障礙可能是導(dǎo)致HS 的重要因素。目前對UPR 的研究主要集中在細胞水平，即通過抑制UPR的激活以及調(diào)控關(guān)鍵因子，探討UPR在熱應(yīng)激誘導(dǎo)細胞凋亡時的機制及發(fā)揮的作用，而在動物及人體中開展的研究甚少。因此，深入探究UPR 在動物和人體中的調(diào)控機制及其在HS 中的作用，對HS的防治及藥物研發(fā)具有重要意義。本文全面闡述了UPRer及UPRmt的機制及其在HS 中發(fā)揮的作用。

1 UPR

1.1 UPRerER是真核細胞內(nèi)參與蛋白合成、折疊、修飾、轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵細胞器，也是調(diào)節(jié)細胞內(nèi)Ca2+平衡、傳遞信號并參與細胞脂質(zhì)合成的主要場所[10-11]。ER的蛋白調(diào)控機制包括保障正確折疊的蛋白進行下一步的修飾，而緩慢折疊或不折疊的蛋白會被保留在ER 中，并通過ER 相關(guān)蛋白降解(endoplasmicreticulum-associated protein degradation，ERAD)進行蛋白酶體降解。在病理狀態(tài)下，ER的蛋白調(diào)控能力被破壞，導(dǎo)致未折疊及錯誤折疊的蛋白在ER 上堆積[12]。為了維持ER 內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，機體通過激活UPRer減輕未折疊或錯誤折疊蛋白的積累[13]。蛋白激酶 樣ER 激 酶(protein kinase RNA-like ER kinase，PERK)、肌醇必需激酶1(inositol-requiring protein 1，IRE1)及激活轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)是UPRer的3 個主要途徑，在恢復(fù)蛋白平衡方面發(fā)揮著重要作用[14]。

1.1.1 PERK信號通路 PERK是ER膜上的跨膜蛋白激酶，其C端具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性，能夠磷酸化真核翻譯起始因子2 亞基-α(eIF2α)[15]。在ERS 期間，PERK 開始在ER 膜內(nèi)低聚激活，誘導(dǎo)其自磷酸化并激活激酶結(jié)構(gòu)域。p-PERK 可磷酸化eIF2α，eIF2α 的磷酸化可以抑制mRNA 的翻譯，從而阻止蛋白的翻譯，導(dǎo)致ER 中未折疊蛋白減少[16]。此外，激活轉(zhuǎn)錄因子4(ATF4)也可被磷酸化的eIF2α激活[17]，參與調(diào)控氨基酸代謝、伴侶蛋白合成、細胞自噬及凋亡[14]。ATF4作為應(yīng)激誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子，其機制是通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子C/EBP同源蛋白(CHOP)及生長抑制DNA 損傷基因34(GADD34)兩個重要靶基因而發(fā)揮功能。CHOP 亦是一種轉(zhuǎn)錄因子，能夠控制凋亡相關(guān)基因的編碼。GADD34 是合成蛋白磷酸酶(PPI)的一個亞單位，通過去磷酸化eIF2a 負向調(diào)控PERK 的作用[18]。然而，通過PPI 表達eIF2α 的組成型阻遏物(CReP)可以磷酸化eIF2α[19-20]。因此，GADD34 及CReP 在ERS 時對維持蛋白的穩(wěn)態(tài)起重要作用。

1.1.2 IRE1 信號通路 IRE1 主要表達于低等及高等真核生物中。在哺乳動物中，ERN1基因編碼Ire1α，ERN2基因編碼Ire1β。Ire1β 主要在呼吸道及胃腸道中表達，而Ire1α 則普遍表達[21-22]。IRE1α 是一種定位于ER的跨膜蛋白，同時具有蛋白激酶及核糖核酸酶活性。ER應(yīng)激時，IRE1α發(fā)生寡聚化及自磷酸化，磷酸化的IRE1α 可以特異性地從編碼轉(zhuǎn)錄因子X 盒結(jié)合蛋白(X-box-binding protein 1，XBP)的mRNA上切割一個26堿基內(nèi)含子，導(dǎo)致XBP1 mRNA轉(zhuǎn)錄因子的激活[23]。活躍的XBP1 mRNA 轉(zhuǎn)錄因子可上調(diào)參與ER蛋白易位、折疊及分泌的基因，同時還可調(diào)控錯誤折疊蛋白降解及自噬[24-26]。因此，XBP1 在UPR 穩(wěn)態(tài)中的作用至關(guān)重要。

此外，磷酸化的IRE1α 可以降解ER 定位的mRNA或前體微小RNA(miRNA)，稱為RIDD。RIDD可以減少ERS 時的蛋白合成，維持ER 穩(wěn)態(tài)[27]。RIDD 及XBP1 調(diào)控的mRNA 和前體miRNA 共享相同的CUGCAG 序列基序，這是IRE1α 裂解的關(guān)鍵位點[28]，但IRE1α 如何在RIDD 與XBP1 之間切換目前尚不清楚。值得注意的是，當ERS 期間未折疊蛋白積累時，XBP1 增加到峰值，然后開始下降。而RIDD 在基礎(chǔ)條件下是活躍的，在ERS 時也會增加。如果XBP1 及RIDD 能夠在ERS 時減少未折疊蛋白負荷，則ER蛋白穩(wěn)態(tài)可恢復(fù)到正常水平。然而，如果ERS 持續(xù)存在，XBP1 減少，而RIDD 繼續(xù)降解mRNA、miRNA 及編碼促生存蛋白的mRNA，則會導(dǎo)致凋亡[29-30]。除了RIDD，磷酸化的IRE1α 還能激活腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(tumor necrosis factor receptor-associated factor 2，TRAF2)，TRAF2 反 過 來激活c-Jun 氨基末端激酶(JNK)，最終導(dǎo)致細胞凋亡及自噬[8]。

1.1.3 ATF6 信號通路 ATF6 是一種單通道、Ⅱ型跨膜蛋白，具有N端“細胞質(zhì)”結(jié)構(gòu)域。ATF6的N端結(jié)構(gòu)域是堿性亮氨酸拉鏈(basic-leucine zipper，bZIP)轉(zhuǎn)錄因子，隨后是一個20個氨基酸的跨膜結(jié)構(gòu)域，ATF6 的C 端穿過細胞膜進入ER[31]。ATF6 是在UPRer信號通路中發(fā)揮重要作用的第3個途徑。在ER應(yīng)激期間，未折疊蛋白增加，導(dǎo)致ATF6 從ER 轉(zhuǎn)移到高爾基體，被位點1蛋白酶(site 1 protease，S1P)及位點2蛋白酶(site 2 protease，S2P)裂解，形成活性轉(zhuǎn)錄因子ATF6p50，該轉(zhuǎn)錄因子易位到細胞核并調(diào)節(jié)基因表達[15]?；罨腁TF6 可以調(diào)節(jié)XBP1，進一步促進錯誤折疊蛋白降解，以及ER 蛋白易位、折疊、成熟和分泌[32-33]。此外，活躍的ATF6 也可調(diào)節(jié)CHOP、伴侶蛋白及ERAD成分的表達[34]。

1.2 UPRmt線粒體作為細胞內(nèi)重要的細胞器之一，是細胞代謝網(wǎng)絡(luò)及信號網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)中心，在機體生長發(fā)育、遺傳代謝、衰老及疾病等許多方面發(fā)揮著獨特的作用[14]。線粒體參與多種生物學(xué)進程，包括調(diào)節(jié)細胞死亡、細胞分化、生長及先天免疫[35-36]。然而，線粒體在應(yīng)激狀態(tài)下易出現(xiàn)功能障礙。在應(yīng)對線粒體功能障礙時，機體會產(chǎn)生大量的組織因子并激活信號通路，促進線粒體穩(wěn)態(tài)恢復(fù)。UPRmt是線粒體面對應(yīng)激時產(chǎn)生的一種保護效應(yīng)。UPRmt時線粒體啟動核DNA編碼線粒體伴侶蛋白及蛋白酶，并轉(zhuǎn)運至線粒體外膜，通過線粒體外膜通道進入線粒體，恢復(fù)或清除線粒體內(nèi)的錯誤折疊和未折疊蛋白，維持蛋白穩(wěn)態(tài)及線粒體功能[9,37]。

在對秀麗隱桿線蟲的研究中，UPRmt的激活途徑及作用機制已基本闡明，其核心調(diào)控因子是應(yīng)激相關(guān)激活轉(zhuǎn)錄因子-1(activating transcription factor associated with stress-1，ATFS-1)。ATFS-1 同時具有細胞核靶向序列及線粒體靶向序列，在正常生理條件下，ATFS-1通過線粒體靶向序列介導(dǎo)進入線粒體并降解；在線粒體應(yīng)激時，ATFS-1 無法進入線粒體，在細胞核靶向序列的引導(dǎo)下易位至細胞核，激活靶基因的轉(zhuǎn)錄表達[38-39]。由于ATFS-1 不能被導(dǎo)入線粒體，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子變得活躍，這表明線粒體導(dǎo)入是調(diào)控UPRmt的關(guān)鍵因素[9]。當ATFS-1 進入細胞核時，可調(diào)節(jié)超過500 種基因的轉(zhuǎn)錄，這些基因包括促進線粒體蛋白穩(wěn)態(tài)的基因(伴侶蛋白、蛋白酶及抗氧化基因)，可緩解線粒體應(yīng)激反應(yīng)。由ATFS-1 誘導(dǎo)的部分基因產(chǎn)物通過線粒體輸入復(fù)合物(如timm-17、timm-23)，并進入功能失調(diào)的線粒體網(wǎng)絡(luò)[40]。

UPRmt最初是在哺乳動物細胞中被發(fā)現(xiàn)的，實驗觀察到線粒體基質(zhì)中錯誤折疊蛋白的積累激活了這種特定的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)[41]。然而，由于哺乳動物線粒體功能的復(fù)雜性及多樣性，在哺乳動物細胞中存在多種UPRmt通路及調(diào)控因子。已知哺乳動物細胞中的UPRmt與3 種基本亮氨酸拉鏈(bZip)轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)，包括CHOP、激活轉(zhuǎn)錄因子(ATF)4 及ATF5[42-44]。這3種轉(zhuǎn)錄因子是否存在相互作用尚不清楚，但三者均在線粒體功能障礙期間被誘導(dǎo)，且都是誘導(dǎo)UPRmt所必需的[42,45-48]。ATF5 是一種與線蟲ATFS-1 同源的bZip 分子，當線粒體受損時，其同樣會遷移到細胞核并激活轉(zhuǎn)錄。研究表明，ATF5 的表達可以恢復(fù)ATFS-1基因敲除線蟲中UPRmt的激活[42]。ATF5 可通過誘導(dǎo)幾種線粒體伴侶蛋白及蛋白酶基因的表達，在線粒體功能障礙期間促進氧化磷酸化及細胞生長[42]。據(jù)報道，ATF5在幾種線粒體疾病中被轉(zhuǎn)錄及誘導(dǎo)，ATF5 損傷的細胞容易發(fā)生線粒體應(yīng)激[49-51]。值得注意的是，哺乳動物細胞中的UPRmt至少部分受線粒體輸入效率的調(diào)控。在線粒體功能障礙期間，線粒體蛋白輸入復(fù)合物TIM23的一個亞基迅速降解，導(dǎo)致輸入效率降低并誘發(fā)UPRmt[52]。因此，在哺乳動物中，UPRmt作為維持線粒體蛋白穩(wěn)態(tài)的代償機制，其詳細作用尚需進一步探索。

1.3 UPR與重癥疾病的關(guān)系 當遭受感染、嚴重創(chuàng)傷或營養(yǎng)不良等情況時，機體發(fā)生一系列應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致內(nèi)環(huán)境失調(diào)及蛋白合成/降解紊亂，可誘發(fā)UPR。輕度適當?shù)腢PR 能夠幫助機體清除未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，有助于機體的恢復(fù)。而在一些重癥疾病中，因應(yīng)激反應(yīng)過強導(dǎo)致大量未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白未能被及時清除，內(nèi)環(huán)境紊亂無法盡快恢復(fù)，UPR 將啟動相關(guān)途徑誘導(dǎo)細胞凋亡，加重疾病進展。有研究報道，UPR 的基因表達與膿毒癥患者器官衰竭及內(nèi)皮功能障礙的發(fā)展相關(guān)[53]。在膿毒癥大鼠的肝臟中發(fā)現(xiàn)細胞凋亡水平升高，肝損傷標志物表達增高，細胞形態(tài)學(xué)發(fā)生改變，以及UPRer相關(guān)蛋白表達增加[54]。使用β-arrestin 1 或小檗堿抑制UPRer后，可以減少炎性細胞因子的產(chǎn)生及UPRer相關(guān)蛋白的表達，從而減輕肝損傷[55-56]。最近的一項研究在心臟缺血再灌注損傷前6 h 使用寡霉素及多西環(huán)素誘導(dǎo)UPRmt，使許多已知的UPRmt相關(guān)基因明顯上調(diào)，并減少了野生型小鼠的梗死面積，提示在心臟缺血再灌注損傷中UPRmt發(fā)揮著保護作用，但在ATF5敲除小鼠中未觀察到此現(xiàn)象[57]。隨著對UPR 研究的不斷深入，有望進一步明確UPR 在重癥疾病中的具體作用機制，并針對UPR的各個環(huán)節(jié)進行干預(yù)。

2 HS與UPR的關(guān)系

HS后發(fā)展為多器官功能障礙綜合征，是由高溫引起的急性生理變化(如循環(huán)衰竭、缺氧及代謝需求增加)、直接細胞毒性、炎癥及凝血反應(yīng)之間復(fù)雜的相互作用所致[58-61]。在細胞及動物模型中發(fā)現(xiàn)，高溫直接導(dǎo)致大多數(shù)細胞器的損傷，如線粒體、溶酶體、高爾基體及ER，細胞器損傷反過來又導(dǎo)致細胞損傷[62-64]。損傷的嚴重程度取決于臨界熱的最大值，即高溫的程度及持續(xù)時間，超過這個溫度就會發(fā)生近乎致命的細胞損傷[65]。在極高的溫度(49～50 ℃)下，所有的細胞結(jié)構(gòu)將在5 min內(nèi)被破壞，導(dǎo)致細胞死亡。研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致細胞指數(shù)性死亡的熱量與導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解的熱量相關(guān)，表明高熱誘導(dǎo)的細胞毒性可能與細胞質(zhì)及膜蛋白的降解有關(guān)[66]。

2.1 HS 與UPRer蛋白質(zhì)僅可在狹窄的溫度范圍內(nèi)保持天然的結(jié)構(gòu)及功能，溫度的輕微上升即會導(dǎo)致蛋白質(zhì)展開或錯誤折疊，形成聚集體，造成細胞周期停滯[62-63]。導(dǎo)致細胞死亡的熱量與蛋白質(zhì)變性的熱量相近，表明高溫導(dǎo)致細胞死亡的機制可能是影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)[66]。在HS期間，細胞內(nèi)大量的蛋白質(zhì)發(fā)生變性，無法正確折疊，從而導(dǎo)致細胞內(nèi)蛋白質(zhì)聚集。此外，當未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)在線粒體及ER 中積累時，UPR 可維持蛋白質(zhì)的動態(tài)平衡[67-68]。

UPRer在HS后腸損傷中發(fā)揮著重要作用。HS通過上調(diào)BAX、下調(diào)Bcl-2 激活PERK-CHOP 通路，誘導(dǎo)細胞凋亡[69]。CHOP 是UPRer的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一，在正常生理條件下表達量非常低。然而，發(fā)生UPRer時CHOP表達明顯增加，從而激活下游一系列凋亡分子誘導(dǎo)凋亡，參與各種病理過程的發(fā)生及發(fā)展[70]。研究還發(fā)現(xiàn)，在熱應(yīng)激環(huán)境中，大鼠比目魚肌細胞中含有大量錯誤折疊蛋白，激活了ERS 誘導(dǎo)的細胞凋亡，同時CHOP及caspase-12明顯上調(diào)；且此時比目魚肌中發(fā)生了較嚴重的ERS，導(dǎo)致UPR 失效，通過激活CHOP 及caspase-1 誘導(dǎo)凋亡[71]。肌肉產(chǎn)熱在勞力型HS的發(fā)生中起著重要作用，調(diào)節(jié)肌肉的各種生理功能可能為預(yù)防HS 提供線索。Xiong等[72]發(fā)現(xiàn)，在熱應(yīng)激誘導(dǎo)小鼠顆粒細胞凋亡后，UPRer標志物如GRP78(葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白)、CHOP 的表達水平增高，而硒處理可有效減輕熱應(yīng)激及UPRer激動劑誘導(dǎo)的凋亡，如caspase-3 活性增強、GRP78及CHOP 表達增加。Yang 等[73]發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激小鼠肺組織中UPRer相關(guān)蛋白表達增高，PERK-eIF2α-CHOP信號激活，而補充熊果酸可減弱這一信號的活性，從而保護小鼠肺組織免受熱應(yīng)激損傷。由此證實了UPRer在高熱誘導(dǎo)的機體組織損傷進展中起著關(guān)鍵作用。因此，在HS 中調(diào)控UPRer的激活及關(guān)鍵因子可能是治療HS新的切入點。

2.2 HS與UPRmt目前還沒有研究報道UPRmt在HS中的作用。然而，在熱應(yīng)激條件下，細胞內(nèi)錯誤折疊蛋白的增多及HSF1 伴侶的解離會觸發(fā)熱休克反應(yīng)[74]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，在哺乳動物細胞中，HSF1-SSBP1 復(fù)合體參與了蛋白毒性應(yīng)激期間的UPRmt。HSF1 在小鼠細胞熱休克時誘導(dǎo)HSP60、HSP10 及mtHSP70 的表達，而SSBP1 主要位于線粒體中，通過增強HSF1的轉(zhuǎn)錄活性來增強其表達[75]。這些研究主要集中在細胞水平，還需要在動物模型中對UPRmt的機制進行更深入的研究，以探索其在HS 中的影響，為HS的預(yù)防及治療指引新的方向。

3 總結(jié)與展望

對于HS患者而言，目前最有效的治療措施是快速、有效、持續(xù)地降溫[76]，新的治療策略仍有待開發(fā)。只有對HS 的各種病理生理機制進行深入研究，才可能開發(fā)出新的有效治療方案。隨著對HS研究的深入，UPR在HS中發(fā)揮的作用也不斷被發(fā)現(xiàn)，UPR可能會成為HS 的潛在治療靶點。但對于HS 中UPR發(fā)生的具體過程，仍有待進一步探究。因此，應(yīng)深刻認識HS發(fā)病過程中的病理改變及UPR的作用，并探索HS與UPR的關(guān)系，以更準確地調(diào)節(jié)UPR，預(yù)防并治療HS。在未來的研究中，可重點關(guān)注UPR相關(guān)蛋白(HSP10、HSP60、LONP1、CLpP 等)在HS 中發(fā)揮的具體作用，尋找關(guān)鍵的分子作為干預(yù)目標，為HS的防治提供新策略。