干細胞源性細胞外囊泡治療早發(fā)性卵巢功能不全的機制研究進展

曾文卓，黃欣怡，徐數(shù)理，孫曉峰

湖南中醫(yī)藥大學醫(yī)學院，湖南長沙 410208

早發(fā)性卵巢功能不全(premature ovarian insufficient，POI)指女性在40歲前出現(xiàn)的卵巢功能減退，主要表現(xiàn)為月經(jīng)異常、促性腺激素(FSH)水平升高(>25 U/L)、雌激素水平波動性下降，其終末階段稱為卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)，此階段表現(xiàn)為閉經(jīng)、激素嚴重紊亂(FSH>40 U/L)并伴不同程度的圍絕經(jīng)期癥狀[1-2]。POI 患者雌激素水平的降低可增加代謝性骨病、心血管疾病及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的患病風險[3]，降低患者的生活質(zhì)量。同時，POI 也是不孕癥的重要病因之一。當前，我國人口老齡化形勢嚴峻，提高人口出生率勢在必行，因此，女性生殖健康問題不僅是患者的自身健康問題，更是事關(guān)人口結(jié)構(gòu)優(yōu)化的社會問題。目前常用的針對POI 的治療及輔助生殖技術(shù)均存在不同程度的局限性。因此，亟需找到一種安全可靠的治療方法以解決POI 帶來的一系列問題。來源于干細胞的細胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)不僅具有其親代干細胞的治療功效，且免疫原性低、可跨越細胞屏障，近年來已成為多種疾病治療研究的熱點[4]。本文從POI的治療現(xiàn)狀及前景入手，基于改善卵巢功能、影響顆粒細胞(granulosa cells，GCs)增殖及凋亡、促進卵巢血管生成、減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)、影響生育能力及后代等方面對干細胞來源的EVs 治療POI 的機制進行綜述，旨在為EVs用于POI的臨床治療提供依據(jù)。

1 POI的治療現(xiàn)狀及前景

激素替代療法(hormone replacement therapy，HRT)是臨床上應(yīng)用最廣泛的POI治療方法，可調(diào)節(jié)激素紊亂，緩解各種更年期癥狀，但無法從根本上恢復卵巢功能和生育能力，且存在誘發(fā)靜脈血栓及癌癥等風險[5]。對于有生育需求的POI 患者，常在HRT 治療的基礎(chǔ)上借助輔助生殖技術(shù)和生育力保存方法。有效的輔助生殖技術(shù)為贈卵體外受精-胚胎移植技術(shù)(IVF-ET)，生育力保存方法包括胚胎冷凍、卵細胞冷凍及卵巢組織冷凍等[1]。但此類方法仍存在技術(shù)、管理、安全性及倫理上的問題，促排卵藥物的使用還可使患者面臨卵巢過度刺激綜合征的風險。隨著干細胞研究的深入，大量研究提示，干細胞移植在動物模型中可修復損傷卵巢組織、改善內(nèi)分泌，從而恢復卵巢功能[6-7]。在膝骨關(guān)節(jié)炎、移植物抗宿主病及糖尿病等疾病中干細胞治療已進入臨床試驗階段[8]，在POI中也已有少量不完善的初期臨床研究[9-11]。但干細胞移植的局限性如倫理爭議、移植細胞存活率低、異體移植排斥、侵入性操作及腫瘤轉(zhuǎn)化等[12]限制了其進一步應(yīng)用。EVs 是干細胞移植治療的重要旁分泌機制之一。一項關(guān)于心臟修復的研究證實，EVs 具有其親代誘導多能干細胞的治療功效，且無致瘤性[13]。多項研究也證實EVs 沒有致瘤風險[14-15]。EVs能包裹活性物質(zhì)、隔絕外界酶的影響，在血液循環(huán)和遠距離治療中更安全穩(wěn)定，是理想的藥物載體[16]。此外，EVs 具有干細胞的多種治療功效，又能彌補干細胞移植的劣勢，有望成為干細胞移植的優(yōu)勢替代方法。對于腫瘤患者，EVs可作為臨床診斷和預(yù)后評估的標志物[17]。在POI 的治療中，EVs 已被多項動物實驗研究證實能通過改善卵巢功能、影響GCs 增殖凋亡等不同機制恢復卵巢功能。因此，EVs 作為一種新興的細胞間通信方式，可能成為打破POI治療瓶頸的關(guān)鍵。

2 干細胞來源的EVs

EVs 是一種可由多種細胞分泌的具有脂質(zhì)雙分子膜結(jié)構(gòu)的納米級囊泡[18]，根據(jù)大小、釋放方式及表面標記物的不同，可分為微囊泡(microvesicles，MVs)、 外 泌 體(exosomes， EXOs)、 凋 亡 小 體(apoptotic bodies，ABs)等多種亞群。MVs是膜蛋白重塑出芽分離出的具有脂質(zhì)雙分子層的囊泡，其直徑一般為150～1000 nm；外泌體直徑一般為40～150 nm，早期在細胞內(nèi)形成多泡體(multivesicular bodies，MVBs)，其內(nèi)包含有多個腔內(nèi)囊泡(intraluminal vesicles，ILVs)即外泌體的前體，MVBs與細胞膜融合后釋放出的ILVs 即為外泌體；凋亡小體直徑一般為1～5 μm，是通過發(fā)芽脫落機制或自噬體形成機制使胞膜皺縮內(nèi)陷，包裹胞質(zhì)、DNA 及細胞器形成的泡狀小體[19-20]。EVs廣泛分布在母乳、血液等生物體液中，可由干細胞、上皮細胞等多種細胞分泌[21]，而考慮到低免疫原性及可大量擴增等優(yōu)勢，干細胞是目前相關(guān)研究工作中EVs 的主要來源。干細胞來源的EVs可包含各種生物活性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA、微小RNA(microRNAs，miRNAs)、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)等，能通過傳遞內(nèi)容物參與細胞間通信，進而影響靶細胞的表型及功能[22]。

3 EVs治療POI的機制

多項動物實驗證實，各種干細胞來源的EVs 可通過不同機制對POI 起到治療作用。具體機制及治療效果可見表1[21,23-34]。

表1 不同干細胞來源的EVs治療早發(fā)性卵巢功能不全的機制及效果Tab.1 Mechanism and effect of extracellular vesicles from different stem cells in treatment of POI

3.1 改善卵巢功能 EVs 及其攜帶的活性物質(zhì)可恢復損傷卵巢的重量及形態(tài)、增加卵泡數(shù)量、調(diào)節(jié)激素分泌及改善異常發(fā)情周期。Huang 等[23]將人脂肪間充質(zhì)干細胞來源的外泌體注射到環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)誘導的POI 模型小鼠卵巢中，4周后卵巢卵泡數(shù)量明顯增多，雌二醇(E2)和抗繆勒管激素水平升高，F(xiàn)SH 水平下降。另一項研究則是通過腹腔注射將骨髓間充質(zhì)干細胞來源的外泌體移植入CTX誘導的化療源性POF大鼠模型中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)POF 大鼠發(fā)情周期及激素水平恢復正常，健康卵泡數(shù)量增加，卵巢功能得到改善[24]。也有學者將人臍帶造血干細胞來源的EVs 分離鑒定后經(jīng)尾靜脈注入POI模型小鼠，結(jié)果顯示小鼠體重明顯增加，卵巢質(zhì)量提高，卵母細胞及胚胎數(shù)增多，E2水平升高，F(xiàn)SH 水平降低[27]。羊水間充質(zhì)干細胞(amniotic fluid mesenchymal stem cells，AFMSCs)是從羊水中獲取的干細胞。Thabet 等[33]證實，AFMSCs 來源的EVs與AFMSCs 一樣，可恢復激素水平及發(fā)情周期，且EVs 與AFMSCs 均可通過增強miRNA-21 的表達，降低miRNA-21下游的PTEN和casepase-3的表達，最終改善化療誘導的卵巢儲備功能損傷。

目前，臨床前實驗研究中大部分EVs 移植是通過原位組織注射或靜脈注射兩種方式，結(jié)果顯示EVs均有效[35-37]，但兩種移植方式的選擇仍需進一步探索。一項人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUCMSC)修復化療性大鼠卵巢損傷模型的研究對比了卵巢注射及尾靜脈注射兩種移植方式的治療效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)靜脈注射創(chuàng)傷更小，且有助于修復化療性的多器官損傷，因而更具優(yōu)勢[38]，但EVs 移植是否優(yōu)先考慮靜脈注射仍值得探討。

3.2 影響卵巢GCs 的增殖及凋亡 POI 患者卵巢生理功能及生殖能力常因卵泡耗竭、閉鎖而減弱[29]。卵泡由核心的卵母細胞及周圍的GCs 和卵泡膜細胞構(gòu)成。卵母細胞為生殖細胞，GCs 對卵母細胞有重要的營養(yǎng)和支持作用。GCs分泌包括E2、生長因子、細胞因子在內(nèi)的多種活性因子，對卵泡的發(fā)育至關(guān)重要，同時GCs 的凋亡會誘發(fā)卵泡閉鎖[39]。因此，GCs 對卵泡生長、發(fā)育、閉鎖極為重要，其增殖與凋亡必然會影響卵巢的生理功能及生育能力。

多項研究表明，干細胞來源的EVs 對GCs 有促進增殖和抑制凋亡的作用。Sun 等[25]發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細胞來源的外泌體通過傳遞miR-644-5p 靶向p53可抑制卵巢GCs凋亡，并改善卵巢功能。另一項研究證實，GCs 能有效吸收HUCMSC 來源的外泌體，調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)的蛋白，從而保護卵巢GCs 免受順鉑誘導的損傷；此外，該研究進一步預(yù)測分析顯示，microRNA-24、microRNA-106a、microRNA-19b、microRNA-25 可能與細胞凋亡有關(guān)[28]。有研究者用CTX 誘導建立小鼠POI 模型后，通過腹腔注射移植HUCMSC來源的外泌體，恢復了小鼠激素水平和發(fā)情周期，并通過Hippo 通路恢復了GCs 促卵泡激素受體的表達，從而促進GCs 在體內(nèi)的增殖，最終改善了POI 小鼠的卵巢功能[29]。Zhang 等[21]將HUCMSC衍生的EVs 加入順鉑誘導的GCs 化療損傷模型中進行培養(yǎng)，結(jié)果顯示EVs 成功整合到GCs 中，并通過調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax 比例和抑制caspase-3 介導的凋亡級聯(lián)反應(yīng)保護了GCs 免受化療誘導的損傷，提示EVs 在GCs合成和分泌類固醇激素過程中發(fā)揮了重要作用。一項探討月經(jīng)血源性基質(zhì)細胞(menstrual bloodderived stromal cells，MenSCs)衍生外泌體對POI 影響的研究將分離出的外泌體經(jīng)尾靜脈注入經(jīng)4-乙烯基環(huán)己烯二環(huán)氧化物(VCD)誘導的SD 大鼠POI 模型中，結(jié)果顯示，MenSCs衍生外泌體可促進卵泡發(fā)育及GCs 增殖，抑制GCs 凋亡，且該外泌體具有卵巢皮質(zhì)傾向性，可調(diào)節(jié)卵巢生理功能及卵巢微環(huán)境[40]。經(jīng)尾靜脈注射來源于胚胎干細胞的EVs 可恢復POF模型小鼠的卵巢功能，并通過激活PI3K-Akt 通路促進GCs增殖，抑制GCs凋亡[34]。

3.3 促進卵巢血管的形成 卵巢功能依賴復雜的卵巢血管系統(tǒng)和持續(xù)性的血管重塑，以為卵泡和黃體提供所必需的營養(yǎng)、氧氣及激素支持[41]。優(yōu)勢卵泡的產(chǎn)生也與初級卵泡中豐富的血管網(wǎng)絡(luò)有關(guān)[31]。由此可見，促進卵巢血管形成及重塑對POI 的治療具有重要作用。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、胰島素樣生長因子1(insulinlike growth factor-1，IGF-1)、血管生成素是重要的血管生成因子，尤其是血管生成素可明顯刺激新生血管生成，從而參與卵泡的發(fā)育[42]。Yang 等[31]從HUCMSC 內(nèi)提取出MVs 作用于POI 模型小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HUCMSC-MVs 移植后血管生成因子(包括VEGF、IGF-1、血管生成素)表達水平明顯升高，且可能通過PI3K-Akt 通路誘導血管生成來恢復卵巢功能。此外，Park 等[26]用骨髓間充質(zhì)干細胞的條件培養(yǎng)基(MSC CM)處理人卵巢內(nèi)皮細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MSC CM 可促進卵巢內(nèi)皮細胞的增殖及血管生成標記物的表達，并通過PI3K-ALK 通路促進血管生成，且采用小管形成實驗驗證了MSC CM 對卵巢內(nèi)皮細胞成血管能力的促進作用。但該研究未對培養(yǎng)基的具體作用成分進行分析。此外，考慮到血管生成可促進腫瘤生長，EVs 的促血管作用是否有致癌作用值得進一步探討。

3.4 減輕氧化應(yīng)激反應(yīng) 生理狀態(tài)下，活性氧(reactive oxygen species，ROS)與抗氧化劑保持平衡狀態(tài)，當ROS 過量導致平衡被打破時，機體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)(oxidative stress，OS)，使卵泡發(fā)生衰老[43]，因此，氧化應(yīng)激可能是多種生殖疾病的啟動因素，并參與卵泡閉鎖、減數(shù)分裂異常等病理過程[44]。在各種表觀遺傳事件中，microRNA是控制氧化應(yīng)激和細胞衰老的重要參與者[45]。目前已有研究證實，外泌體可通過傳遞microRNA抑制ROS的積累，進而改善卵巢功能。Ding 等[30]證實，來源于人臍帶干細胞的外泌體可通過miRNA-17-5p的表達下調(diào)SIRT7及下游靶基因(PARP1、γH2AX、XRCC6)的表達，抑制ROS 的積累，改善POI 患者的卵巢功能，且其作用具有劑量依賴性。而人羊膜間充質(zhì)干細胞來源外泌體中的miRNA-320a則可通過抑制GCs和卵母細胞中的氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)因子STRT4來降低ROS的水平[32]。

3.5 對生育能力及后代的影響 生育能力的恢復及后代的健康問題是育齡期POI 患者關(guān)注的重點。Li等[28]發(fā)現(xiàn)，HUCMSC 來源的外泌體可提高POI 小鼠的妊娠率，增加后代數(shù)量并縮短懷孕時間。Liu等[27]首次利用體外受精和交配實驗檢測POI 小鼠的生育能力，并評估其在接受HUCMSC EVs 移植后子代的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EVs 移植增加了卵母細胞和胚胎的數(shù)量，縮短了小鼠的懷孕時間，且子代小鼠的生長及即時工作記憶和識別記憶均未受到明顯影響，提示EVs 治療并不會導致后代的認知缺陷。但是相關(guān)研究仍需更全面、更系統(tǒng)地驗證及更長期的隨訪，以確保其安全性。

4 總結(jié)與展望

EVs通過各種機制對POI發(fā)揮治療作用，以上實驗研究共同表明EVs 在未來POI 的臨床治療中擁有巨大的潛力。EVs 是一種理想的藥物載體，并有望成為干細胞移植的優(yōu)勢替代方法，通過運輸miRNA等活性物質(zhì)恢復卵巢功能、提高生育能力，為POI患者帶來了希望。但就目前的研究現(xiàn)狀來看，EVs想要實現(xiàn)臨床應(yīng)用，仍存在許多待解決的難題：(1)EVs 攜帶的活性成分及作用機制研究不全；(2)EVs提取與修飾的技術(shù)與標準不規(guī)范；(3)給藥途徑、劑量及標準不確定。此外，EVs 的應(yīng)用還需更加嚴謹?shù)呐R床研究以評估其安全性?？傊?，EVs 在POI的治療中表現(xiàn)出巨大的潛力，相信關(guān)于EVs的研究將會給POI的臨床治療注入新的活力。