AIM2炎性小體與胸腔鏡下肺葉切除術(shù)腫瘤患者單肺通氣相關(guān)肺損傷的關(guān)系及預(yù)測(cè)價(jià)值*

宗宇紅 王磊 杜小兵 尹翔宇 許紫舸 王曼 朱蕾

(1.保定市第一中心醫(yī)院麻醉科,河北 保定 071000;2.河北大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科,河北 保定 071000)

急性肺損傷(Acute lung injury,ALI)是胸腔鏡下肺葉切除術(shù)患者術(shù)后死亡的主要原因,具有發(fā)病率高 (2%～5%)和死亡率高的特點(diǎn)(約25%)[1-2]。除了手術(shù)本身原因,單肺通氣相關(guān)肺損傷被認(rèn)為是導(dǎo)致術(shù)后急性肺損傷的重要原因之一。目前認(rèn)為是由于傷害性通氣模式(高潮氣量、高峰值吸氣壓、高吸入氧濃度等)引起的炎癥介質(zhì)釋放所致。特別是在單肺通氣(One-Lung Ventilation,OLV)中,機(jī)體依靠一側(cè)肺進(jìn)行氧合,導(dǎo)致肺內(nèi)解剖分流增多,引起缺氧肺損傷[3]。人畜實(shí)驗(yàn)研究表明,即使采用保護(hù)性通氣策略(低潮氣量、低吸氣峰壓、降低吸入氧濃度等),也不能完全阻止肺組織中炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生和肺損傷的發(fā)生[4-5]。因此為了預(yù)防術(shù)后單肺通氣相關(guān)肺損傷的發(fā)生,需要明確術(shù)后單肺通氣相關(guān)肺損傷的風(fēng)險(xiǎn)因素。黑色素瘤缺如因子2(Absent in melanoma 2,AIM2)炎癥小體分布于細(xì)胞胞漿中,是AIM2與可募集含有CARD結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)顆粒樣蛋白(ASC)及pro-Caspase1形成的一種多蛋白復(fù)合體,這一復(fù)合體可進(jìn)一步活化Caspase1蛋白從而激活細(xì)胞質(zhì)中的IL-1β及IL-18誘發(fā)炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn),AIM2炎癥小體與肺損傷有密切聯(lián)系[6],但AIM2炎性小體是否是胸腔鏡下肺葉切除術(shù)患者單肺通氣相關(guān)肺損傷的風(fēng)險(xiǎn)因素,國內(nèi)外研究鮮見相關(guān)報(bào)道,因此本研究擬評(píng)價(jià)肺組織AIM2炎性小體與胸腔鏡下肺葉切除術(shù)患者單肺通氣相關(guān)肺損傷的關(guān)系及預(yù)測(cè)價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年9月—2021年12月保定市第一中心醫(yī)院和河北大學(xué)附屬醫(yī)院擇期全麻下擬行胸腔鏡下肺癌行肺葉切除術(shù)的肺癌患者750例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①ASA分級(jí)I或II級(jí)。②年齡40～80歲。③性別不限。④體重40～90 kg。排除標(biāo)準(zhǔn)：①BMI>25 kg/m2。②腦外傷、腦出血、腦梗塞病史,NYHA分級(jí)Ⅲ-Ⅳ級(jí)。③肝腎功能異?；颊?。④酗酒濫用藥物史。⑤精神心理疾病病史,且近期未服用抗精神病藥物。⑥凝血功能異?；蜓“鍦p少患者。⑦既往曾接受放療、化療或免疫治療的患者。⑧全身或局部感染(包括C反應(yīng)蛋白升高、白細(xì)胞增多或體溫>38 ℃)。⑨影響下肢的周圍血管疾病。⑩過去3個(gè)月服用維生素、非甾體抗炎藥物或糖皮質(zhì)激素的患者。受試者中途拒絕繼續(xù)配合試驗(yàn)或者死亡。實(shí)驗(yàn)室檢查值因各種原因出現(xiàn)明顯異常者。各種原因?qū)е挛磭?yán)格執(zhí)行試驗(yàn)方案者。圍術(shù)期發(fā)生嚴(yán)重的良事件,如心律失常、氣道插管困難、過敏性的休克等。本研究中25例患者手術(shù)暫停,27例患者不同意進(jìn)行本研究,12例術(shù)中大出血,8例術(shù)中出現(xiàn)惡性心律失常,最終納入678例胸腔鏡下肺癌手術(shù)患者。本研究已在中國臨床研究注冊(cè)中心注冊(cè)(臨床注冊(cè)號(hào)：ChiCTR1900025040)。經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后,術(shù)前與入選本研究的患者及家屬簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 麻醉方法 將患者轉(zhuǎn)移至手術(shù)室時(shí),開放外周靜脈、右頸內(nèi)靜脈、橈動(dòng)脈并將導(dǎo)管連接起來。心電圖(導(dǎo)聯(lián)II和V5)、有創(chuàng)性血壓、中心靜脈壓、心率、雙譜指數(shù)(BIS)。異丙酚按照Marsh藥代動(dòng)力學(xué)模型靶控輸注(Graseby 3500;史密斯醫(yī)療,沃特福德,英國),最初的目標(biāo)濃度0.1μg /mL時(shí)逐步增加到0.3 μg /mL直到BIS值 40～55,0.03 mg/kg咪達(dá)唑侖,1 mg/kg順阿曲庫銨和0.5 μg/kg舒芬太尼靜脈注射。雙腔支氣管內(nèi)插管后,使用循環(huán)容積模式,設(shè)置潮氣量8 mL/kg,吸氣與呼氣的比例為1∶2,呼吸頻率為12次/min。持續(xù)輸注丙泊酚和瑞芬太尼維持麻醉,必要時(shí)給予舒芬太尼和順阿曲庫銨。通過改變異丙酚濃度,使BIS值在整個(gè)手術(shù)過程中維持在40～60之間。手術(shù)前將通氣模式改為單肺通氣,調(diào)整頻率10次/min和潮氣量7 mL/kg以維持脈搏血氧飽和度90%以上和ETCO2<30 mmHg。丙泊酚和瑞芬太尼在皮膚縫合后停用。給予新斯的明(20 μg /kg)和阿托品(5～10 μg /kg)拮抗肌松。患者恢復(fù)自主呼吸拔管后進(jìn)麻醉后監(jiān)護(hù)病房(Postanesthesia care unit,PACU)。患者根據(jù)Steward評(píng)分>4后從PACU中移出。術(shù)中保持患者血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定,SP、DP、HR波動(dòng)范圍不超過基礎(chǔ)值的20%。術(shù)畢均連接自控鎮(zhèn)痛泵(Abbott公司,美國)行PCIA,維持靜態(tài)VAS評(píng)分<3分,鎮(zhèn)痛藥配方：諾揚(yáng)10 mg,使用生理鹽水稀釋到100 mL,負(fù)荷量為2 mL,背景輸注速率為2 mL/h,PCA劑量為0.5 mL,鎖定時(shí)間為15 min。在麻醉的影響下,平均動(dòng)脈壓(MAP)維持在基線值的-20%到+20%之間。低于基線圖20%或MAP<60 mmHg持續(xù)超過30秒被定義為低血壓。當(dāng)給予靜脈注射液體療法效果不滿意時(shí)靜脈給予去氧腎上腺素(40μg)。靜脈注射阿托品(0.3 mg)治療心動(dòng)過緩(心率<60 bpm)。靜脈注射麻黃素(3～6 mg)治療心動(dòng)過緩和低血壓。

1.2.2 ALI診斷標(biāo)準(zhǔn) 用急性呼吸窘迫綜合征(Adult respiratory distress syndrome,ARDS)來描述開胸術(shù)后的ALI。采用2006年中華醫(yī)學(xué)會(huì)重癥醫(yī)學(xué)分會(huì)《急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征診斷和治療指南》提出的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]：①急性起病。②氧合指數(shù)(PaO2/Fi02)≤200 mmHg[不考慮呼氣末正壓(PEEP)水平]。③胸部正位X線片顯示雙肺均有斑片狀陰影。④如氧合指數(shù)(OI=PaO2/FiO2)≤300 mmHg且滿足上述其他標(biāo)準(zhǔn),可診斷為急性肺損傷。根據(jù)患者是否發(fā)生急性肺損傷,將患者分為兩組：?jiǎn)畏瓮夥螕p傷組(I組)和單肺通氣非肺損傷組(NI組)。

1.2.3 觀察指標(biāo) 由經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的研究人員進(jìn)行術(shù)前、術(shù)后隨訪并記錄相關(guān)信息,參與術(shù)中管理的臨床醫(yī)生與研究人員互不知情。術(shù)前采集患者一般資料包括：年齡、性別、BMI、術(shù)前化療史、基礎(chǔ)合并癥[慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)等]、ASA分級(jí)、吸煙史、術(shù)前肺功能及彌散功能指標(biāo)[包括FEV1/FVC]。術(shù)中采集患者一般資料包括：?jiǎn)畏瓮鈺r(shí)間、PEEP和手術(shù)時(shí)間(從手術(shù)切口到皮膚閉合)。

1.2.4 樣本采集 單肺通氣30 min后切除肺葉時(shí)取遠(yuǎn)離病變處>8 cm以上肺組織兩塊分別取5 mm×5 mm×5 mm標(biāo)本,放入-80 ℃冰箱保存。一塊肺組織HE染色后BX4l型顯微鏡(Olympus公司,日本)觀察肺病理學(xué)損傷。一塊采用Western blot法檢測(cè)肺組織黑色素瘤缺如因子2(AIM2),凋亡相關(guān)微粒蛋白(ASC)和半胱天冬酶-1前體(pro-Caspase1)的表達(dá)。取肺組織加入RIPA裂解緩沖液和蛋白酶抑制劑PMSF(碧云天生物試劑研究所),于冰面進(jìn)行充分的研磨、裂解、離心,取上清液加入適量蛋白質(zhì)上樣緩沖液(5×)(碧云天生物試劑研究所)100 ℃加熱5 min,使用12%的聚丙烯凝膠電泳分離蛋白。轉(zhuǎn)移到PVDF膜(北京索萊寶科技有限公司)上,用5%脫脂奶粉在室溫?fù)u床封閉3 h,用TBST沖洗后分別加入內(nèi)參抗體β-actin(1∶6 000)、AIM2一抗(1∶1 000), ASC一抗(1∶1 000),pro-Caspase1一抗(1∶500),均購自美國Cell Signaling公司。4 ℃孵育過夜。TBST洗膜5min×3次,辣根過pro-Caspase1氧化物酶標(biāo)記的二抗(稀釋度1∶2 000,Jackson公司,美國)室溫孵育2 h。TBST洗膜15 min×5次。于化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑反應(yīng)2 min,取出膜,甩去多余的液體,用保鮮膜包好PVDF膜．暗室中用X膠片感光、顯影、定影。采用凝膠圖像Image J軟件(NIH公司,美國)分析蛋白條帶灰度值,以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值反映其表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 納入患者 本研究最終納入678例胸腔鏡下肺癌手術(shù)患者。術(shù)后單肺通氣肺損傷的發(fā)生率是16.9%。

2.2 對(duì)I組和NI組的一般情況進(jìn)行比較 其中性別、BMI、術(shù)前化療史、COPD、ASA分級(jí)、吸煙史、低蛋白血癥和PEEP比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。I組和NI組年齡、FEV1/FVC、單肺通氣時(shí)間、手術(shù)時(shí)間、AIM2、ASC和pro-Caspase1的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1、圖1。

圖1 兩組患者肺組織AIM2,ASC和pro-Caspase1表達(dá)情況

表1 兩組患者一般情況和手術(shù)情況各指標(biāo)的比較

2.3 兩組患者肺組織HE染色圖片觀察比較 光鏡下,I組肺泡間隔相對(duì)增厚,肺泡壁毛細(xì)血管及小靜脈擴(kuò)張充血。肺泡內(nèi)可見較多粉紅色滲出,比較均勻的水腫液,見圖2A。NI組肺泡結(jié)構(gòu)完整,肺泡腔內(nèi)滲出物較少,見圖2B。

圖2 肺組織HE病理結(jié)果(400×)

2.4 將上述差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)進(jìn)行多因素Logistic回歸分析 結(jié)果顯示,年齡、FEV1/FVC、單肺通氣時(shí)間、手術(shù)時(shí)間、AIM2、 ASC和pro-Caspase1是單肺通氣肺損傷的危險(xiǎn)因素,見表2。

表2 單肺通氣相關(guān)肺損傷危險(xiǎn)因素 Logistic 回歸分析

2.5 敏感性分析 納入不同協(xié)變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示： AIM2、 ASC和pro-Caspase1仍是單肺通氣肺損傷的危險(xiǎn)因素,見表3、4。

表3 單肺通氣相關(guān)肺損傷危險(xiǎn)因素 Logistic 回歸分析(敏感性分析1)

表4 單肺通氣相關(guān)肺損傷危險(xiǎn)因素 Logistic 回歸分析(敏感性分析2)

2.6 ROC曲線分析 AIM2 、ASC和pro-Caspase1靈敏度及特異度均較高,曲線下面積大且約登指數(shù)較大,預(yù)測(cè)單肺通氣相關(guān)肺損傷的發(fā)生有較高的準(zhǔn)確性,見表5、圖3。

圖3 ROC曲線圖

2.7 PR曲線分析顯示 AIM2 、ASC和pro-Caspase1曲線下面積大,預(yù)測(cè)單肺通氣相關(guān)肺損傷的發(fā)生有較高的準(zhǔn)確性,見表6、圖4。

表6 肺組織相關(guān)蛋白預(yù)測(cè)單肺通氣相關(guān)肺損傷結(jié)果

3 討論

單肺通氣(One -lung ventilation,OLV)是一種僅使用一個(gè)肺(非手術(shù)側(cè))進(jìn)行通氣的方法[8],可為手術(shù)醫(yī)生提供良好的視野。在肺切除術(shù)中,OLV與術(shù)后肺部并發(fā)癥相關(guān)且因其低氧血癥率高被認(rèn)為是ALI的一個(gè)危險(xiǎn)因素。有研究發(fā)現(xiàn)開胸術(shù)后ALI的發(fā)生率為4%～15%,其和急性呼吸窘迫綜合征是胸外科術(shù)后死亡的主要原因[9]。研究表明肺萎陷時(shí)間長(zhǎng)可引起嚴(yán)重的肺損傷[10],最近的一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)病理改變顯示,在OLV進(jìn)程中非通氣肺組織在復(fù)張后由于擴(kuò)張使肺泡的機(jī)械應(yīng)力增加,并對(duì)鄰近肺泡產(chǎn)生高剪切力,因此導(dǎo)致完全肺萎陷后的肺復(fù)張?jiān)谖莸姆沃姓T導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生,蛋白外滲和中性粒細(xì)胞募集到肺泡。隨著肺塌陷時(shí)間的延長(zhǎng),中性粒細(xì)胞浸潤和肺泡結(jié)構(gòu)損傷,從而引起肺損傷[11]。此外有研究發(fā)現(xiàn),單肺通氣后肺損傷程度與肺組織塌陷時(shí)間呈正相關(guān)可能與缺氧、缺血再灌注和細(xì)胞破壞有關(guān)[12-14]。

本研究發(fā)現(xiàn)年齡是胸腔鏡下肺葉切除術(shù)患者單肺通氣相關(guān)肺損傷的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,與過往研究一致[15]。FEV1/FVC是指最大呼氣第1秒呼氣量占用力肺活量的百分比,是反映有無氣道氣流受限的常用臨床指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)FEV1/FVC是胸腔鏡下肺葉切除術(shù)患者單肺通氣相關(guān)肺損傷的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

劉麗霞等[16]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)術(shù)前FEV1/FVC與術(shù)后急性肺損傷的發(fā)生呈明顯正相關(guān),術(shù)前肺功能重度受損患者術(shù)后急性肺損傷發(fā)生率明顯升高。本研究發(fā)現(xiàn),單肺通氣時(shí)間是胸腔鏡下肺葉切除術(shù)患者單肺通氣相關(guān)肺損傷的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,這與Della等[17]研究結(jié)果一致。單肺通氣過程中非通氣側(cè)肺葉血流因沒有得到氧合而導(dǎo)致組織缺氧,促進(jìn)了內(nèi)皮素、前列腺素、血管緊張素等血管活性物質(zhì)的釋放,引起缺氧性肺血管收縮,并刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生氧自由基,通過脂質(zhì)過氧化反應(yīng)破壞血管結(jié)構(gòu),導(dǎo)致肺血管通透性增加,從而導(dǎo)致術(shù)后肺損傷的發(fā)生。

AIM2是一種胞質(zhì)受體,是介導(dǎo)細(xì)胞因子成熟、分泌和焦亡的細(xì)胞質(zhì)多蛋白平臺(tái)。典型的炎癥小體中有3層分子：傳感器、適配器和效應(yīng)器。傳感器蛋白檢測(cè)病原體來源的分子特征或細(xì)胞環(huán)境中的蛋白,適配器蛋白通過蛋白-蛋白相互作用將信號(hào)傳遞給效應(yīng)蛋白,效應(yīng)器蛋白促炎細(xì)胞因子的成熟形式,觸發(fā)炎癥小體級(jí)聯(lián)的激活[18-19]。由于其配體的保守性,AIM2在多種病原體的免疫識(shí)別過程中非常重要。此外,AIM2還能在細(xì)胞損傷或應(yīng)激時(shí)識(shí)別宿主DNA。在感染和ALI的發(fā)展過程中,AIM2炎癥小體被激活,使含有pyd的寡聚NLRP3和NLRP6片段可形成ASC纖維,導(dǎo)致Caspase-1的成熟,以及它們?cè)谘搴徒M織中的釋放,誘導(dǎo)肺部炎癥[20-21]。巨噬細(xì)胞為炎癥小體基因的主要細(xì)胞,其激活不僅有助于促炎細(xì)胞因子的分泌,還會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞因炎癥反應(yīng)而程序化死亡,M1和M2巨噬細(xì)胞在腫瘤中廣泛分布,其中M2(替代激活巨噬細(xì)胞)又稱抗炎巨噬細(xì)胞占主導(dǎo)地位。經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞M1分泌各種促炎介質(zhì),包括TNFα、IL1-β、IL6和過量活性氧(ROS),導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的激活[22]。研究發(fā)現(xiàn)M1極化的巨噬細(xì)胞增強(qiáng)AIM2基因表達(dá)[23],在肺損傷過程中,巨噬細(xì)胞一方面激活A(yù)IM2,釋放炎癥介質(zhì),導(dǎo)致炎癥損傷,另一方面向M1極化發(fā)展,導(dǎo)致肺組織損傷[24]。

本研究發(fā)現(xiàn),術(shù)后單肺通氣肺損傷患者肺組織中AIM2,ASC和pro-Caspase1蛋白表達(dá)較術(shù)后單肺通氣無肺損傷的患者明顯升高,通過多因素Logistic回歸分析表明肺組織中AIM2,ASC和pro-Caspase1蛋白表達(dá)是發(fā)生術(shù)后單肺通氣肺損傷獨(dú)立危險(xiǎn)因素,并且通過二次敏感性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),AIM2,ASC和pro-Caspase1蛋白表達(dá)仍是發(fā)生術(shù)后單肺通氣肺損傷獨(dú)立危險(xiǎn)因素。急性肺損傷本質(zhì)上是一種炎癥反應(yīng),與內(nèi)皮和上皮屏障的破壞有關(guān),其特征是富含蛋白質(zhì)的水腫液積聚、支氣管上皮脫落、壞死或凋亡的I型細(xì)胞出現(xiàn)、基底膜脫落、間質(zhì)水腫擴(kuò)大、內(nèi)皮細(xì)胞損傷以及組織中細(xì)胞碎片的積聚。細(xì)胞特征包括肺泡-毛細(xì)血管膜完整性的喪失,中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的遷移,以及促炎/細(xì)胞毒性蛋白的增加。炎癥介質(zhì)增高伴有抗炎分子表達(dá)的下降是肺損傷炎癥發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵,其中NF-KB作為重要的轉(zhuǎn)錄因子,在肺部炎癥的細(xì)胞信息傳導(dǎo)調(diào)控中起核心作用,多種炎癥介質(zhì)受其調(diào)節(jié)[25]。單肺通氣時(shí)各種病理生理改變均可使NF-KB激活,AIM2炎性小體識(shí)別炎癥信號(hào)時(shí),從而使AIM2表達(dá)增多,其可直接或通過ASC募集pro-caspase-1,pro-caspase-1經(jīng)過自剪切作用水解為p35和p10,其中p35再被剪切為CARD和p20,兩個(gè)p20和p10結(jié)合構(gòu)成具有活性的Caspase-1,發(fā)揮對(duì)pro-IL-1β和pro-IL-18的剪切作用,進(jìn)而產(chǎn)生成熟的具有生物學(xué)活性的IL-1β和IL-18,從而誘發(fā)肺損傷[26-27]。在本研究中ROC曲線結(jié)果與通過PR曲線分析驗(yàn)證后結(jié)果一致,提示肺組織AIM2炎性小體預(yù)測(cè)單肺通氣相關(guān)肺損傷的發(fā)生有較高價(jià)值。

本研究局限性在于收集肺組織是一種有創(chuàng)操作。監(jiān)測(cè)患者血漿中AIM2炎性小體的濃度將使臨床檢查更加方便。本項(xiàng)目將通過大規(guī)模的臨床研究,通過檢測(cè)外周血中AIM2炎性小體濃度的變化來監(jiān)測(cè)疾病的進(jìn)展。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中探索AIM2炎癥小體在單肺通氣肺損傷中的相關(guān)機(jī)制是我們未來的研究方向。

4 結(jié)論

AIM2炎性小體升高是胸腔鏡下行肺葉切除術(shù)的肺癌患者單肺通氣相關(guān)肺損傷的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,且肺組織AIM2炎性小體可準(zhǔn)確預(yù)測(cè)單肺通氣相關(guān)肺損傷。