歐前胡素調(diào)節(jié)ERK/MAPK信號通路對肺結(jié)核大鼠炎癥反應(yīng)的影響*

陳楊君 陸霓虹 劉洪璐 楊艷 劉梅艷

(昆明市第三人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,云南 昆明 650041)

肺結(jié)核是全球十大傳染病死亡原因之一,其致死率極高,還可能引發(fā)與持續(xù)炎癥和組織損傷等相關(guān)疾病,其主要癥狀以低熱胸悶、乏力、咳嗽為主,對患者的生活造成極大的影響[1-2]。結(jié)核分歧桿菌是最具破壞性的傳染病病原體之一,它可逃避或調(diào)節(jié)宿主的免疫反應(yīng),引發(fā)大量炎癥反應(yīng),導(dǎo)致嚴(yán)重肺損傷,因此抑制炎癥反應(yīng)可有效治療肺結(jié)核病[3]。歐前胡素(Imperatorin,Imp)是一種天然存在的呋喃香豆素,存在于傘形科蔬菜、柑橘類水果和白芷、當(dāng)歸等一些草藥中,已被證明其具有多種藥理活性,如抗氧化、鎮(zhèn)痛、抗癌、抗炎和舒張血管等,但其在肺結(jié)核疾病中的研究鮮有報道[4]。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(Extracellular regulated protein kinases,ERK)介導(dǎo)的有絲分裂原激活蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路被認(rèn)為是經(jīng)典的MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,細(xì)胞外信號刺激或細(xì)胞內(nèi)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)分子異常,可能會導(dǎo)致ERK/MAPK信號通路過度激活,從而促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡及分化,參與疾病的發(fā)生發(fā)展[5]。如在結(jié)核病患者血清中MAPK信號通路被激活,該通路可能在免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[6]。但I(xiàn)mp是否能通過ERK/MAPK信號通路參與抑制肺結(jié)核疾病中炎癥反應(yīng)報道鮮少,因此本實(shí)驗(yàn)旨在探索Imp通過調(diào)節(jié)ERK/MAPK信號通路對肺結(jié)核大鼠炎癥反應(yīng)的影響,現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康清潔級雄性SD大鼠64只,體重200～230 g,購自深圳靈賦拓普生物科技有限公司(許可證號：SYXK(粵)2022-0293)。大鼠均在無特定病原體的環(huán)境(22～25 ℃,40%～50%濕度,12 h光照和黑暗循環(huán))中飼養(yǎng),可隨意進(jìn)食和飲水。該研究已獲得醫(yī)院動物倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 Imp購自上海源葉生物科技有限公司;鼠源表皮生長因子(EGF)購自美國Accurate Chemical公司;結(jié)核桿菌(H37RV)購自美國ATCC公司;白細(xì)胞介素-6(IL-6)試劑盒、γ干擾素(IFN-γ)試劑盒、蘇木精-伊紅(HE)染色液、環(huán)氧化酶-2(COX-2)試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;RIPA裂解緩沖液購自碧云天科技有限公司;Tunel凋亡試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑盒購自BioVision公司;p-ERK1/2、ERK1/2、p38 MAPK一抗購自Abcam公司。酶標(biāo)儀(PT-3502G)購自普天新橋技術(shù)有限公司;全自動菌落計數(shù)儀(ZX-400)購自澤析生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 肺結(jié)核模型的制備及干預(yù) 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,隨機(jī)分為造模組52只及對照組12只,造模組大鼠分別經(jīng)尾靜脈注射體積為2 mL,劑量5 mg/mL結(jié)核桿菌[7],對照組尾靜脈給予等體積的生理鹽水處理。各組隨機(jī)選取兩只大鼠,病理組織切片顯示液化灶、干酪樣壞死等病變?yōu)樵炷３晒8]。隨后將造模組50只大鼠隨機(jī)分為模型組、Imp低(Imp-L)、中(Imp-M)、高劑量(Imp-H)組、Imp-H+ERK特異性激活劑(EGF)組,每組10只。造模成功后,Imp-L組、Imp-M組、Imp-H組分別給予25、50、100 mg/kg Imp灌胃干預(yù)[9];Imp-H+EGF組在100 mg/kg Imp灌胃基礎(chǔ)上,腹腔注射25 mg/kg EGF干預(yù)[10],其余組以生理鹽水干預(yù),連續(xù)給藥12周(1天/次)。

1.2.2 樣本采集 給藥12周后,大鼠腹腔主動脈采集血液,用于ELISA檢測;通過腹膜內(nèi)注射戊巴比妥鈉麻醉并處死大鼠,分離左肺組織,固定在福爾馬林中,用于HE及Tunel染色;分離右肺組織儲存于-80℃冰箱中,用于Western blot檢測及統(tǒng)計結(jié)核桿菌菌落數(shù)。

1.2.3 ELISA檢測各組血清中IFN-γ、IL-6、COX-2水平 收集血液上清液,使用試劑盒測定血清中IFN-γ、IL-6、COX-2水平,實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3個重復(fù)樣品的平均值,操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4 統(tǒng)計大鼠肺組織中結(jié)核桿菌菌落數(shù) 收集部分右肺組織,加入0.9%的生理鹽水、硫酸制備細(xì)胞懸液及消化細(xì)胞,室溫下接種到培養(yǎng)基上,孵育5周后,對結(jié)核桿菌菌落數(shù)進(jìn)行計數(shù)。

1.2.5 HE檢測大鼠肺組織病理學(xué)變化 將固定的肺組織樣本脫水、包埋在石蠟中并切片。用二甲苯脫蠟后,在室溫下使用一系列梯度濃度的乙醇(100%乙醇5 min、95%乙醇1 min、80%乙醇5 min、75%乙醇5 min和蒸餾水2 min)脫水處理。然后在室溫下用蘇木精和伊紅染色12 min。用光學(xué)顯微鏡觀察切片中病理變化。

1.2.6 Tunel染色檢測細(xì)胞凋亡 將固定的肺組織常規(guī)切片,依次加入蛋白酶K、Tunel反應(yīng)液、coverter-POD,DAB顯色后,蘇木精復(fù)染、脫水、透明后,封片,隨機(jī)選取5個視野,計算細(xì)胞凋亡率(其中凋亡細(xì)胞為棕褐色)。

1.2.7 Western blot檢測通路相關(guān)蛋白表達(dá) 取肺組織,加入RIPA 裂解緩沖液在4℃下離心3000 g,15 min以收集上清液。使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒對總蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。使用10% SDS-PAGE分離蛋白質(zhì),隨后在4℃下轉(zhuǎn)移到PVDF膜。PVDF膜在室溫下用含Tris緩沖鹽的5%脫脂牛奶封閉60 min。將膜與以下抗體一起孵育：p-ERK1/2(稀釋度1∶1 000)、ERK1/2(稀釋度1∶1 000)、p38 MAPK(稀釋度1∶1 000)在4℃下過夜。隨后與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(稀釋度1∶5 000)在37℃下孵育1 h。反應(yīng)條帶通過增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑盒可視化,以GAPDH為內(nèi)參,Image J 2.1軟件分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 Imp對各組大鼠血清中IFN-γ、IL-6、COX-2水平的影響 與對照組相比,模型組IFN-γ、IL-6、COX-2水平顯著增加(P<0.05);與模型組相比,Imp-L組、Imp-M組、Imp-H組IFN-γ、IL-6、COX-2水平顯著降低,以Imp-H組變化最為顯著(P<0.05);與Imp-H組相比,Imp-H+EGF組IFN-γ、IL-6、COX-2水平顯著增加(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清中IFN-γ、IL-6、COX-2水平的比較

2.2 Imp對各組大鼠肺組織中結(jié)核桿菌菌落數(shù)的影響 與對照組相比,模型組結(jié)核桿菌菌落數(shù)顯著增加(P<0.05);與模型組相比,Imp-L組、Imp-M組、Imp-H組結(jié)核桿菌菌落數(shù)顯著降低,以Imp-H組變化最為顯著(P<0.05);與Imp-H組相比,Imp-H+EGF組結(jié)核桿菌菌落數(shù)顯著增加(P<0.05),見表2。

表2 各組大鼠肺組織中結(jié)核桿菌菌落數(shù)的比較

2.3 Imp對各組大鼠肺組織病理學(xué)的影響 對照組無明顯病理發(fā)生;模型組肺組織炎性浸潤嚴(yán)重,出現(xiàn)大量增生型結(jié)核結(jié)節(jié),肺泡腔增大;Imp-L組、Imp-M組、Imp-H組病理損傷得到改善,炎性浸潤逐漸緩解,其中Imp-H組接近于對照組;Imp-H+EGF組肺組織炎性浸潤進(jìn)一步加重,病理損傷較為嚴(yán)重。見圖1。

圖1 肺組織病理學(xué)變化(HE,200×)

2.4 Imp對各組大鼠細(xì)胞凋亡的影響 與對照組相比,模型組細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05);與模型組相比,Imp-L組、Imp-M組、Imp-H組細(xì)胞凋亡率顯著降低,以Imp-H組變化最為顯著(P<0.05);與Imp-H組相比,Imp-H+EGF組細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05),見圖2、表3。

圖2 細(xì)胞凋亡變化(200×)

表3 各組大鼠細(xì)胞凋亡的比較

2.5 Imp對各組大鼠肺組織p-ERK1/2、ERK1/2、p38 MAPK蛋白表達(dá)水平的影響 與對照組相比,模型組p-ERK1/2/ERK1/2、p38 MAPK顯著增加(P<0.05);與模型組相比,Imp-L組、Imp-M組、Imp-H組p-ERK1/2/ERK1/2、p38 MAPK顯著降低,以Imp-H組變化最為顯著(P<0.05);與Imp-H組相比,Imp-H+EGF組p-ERK1/2/ERK1/2、p38 MAPK顯著增加(P<0.05),見圖3、表4。

圖3 肺組織中p-ERK、ERK、p38 MAPK蛋白表達(dá)

表4 肺組織中p-ERK1/2、ERK1/2、p38 MAPK蛋白表達(dá)比較

3 討論

肺結(jié)核是由分枝桿菌菌株引起的,其中結(jié)核分枝桿菌主要在人體中觀察到,世界衛(wèi)生組織數(shù)據(jù)顯示,全球有1000萬新發(fā)肺結(jié)核病例和150萬人死亡[11]。目前治療肺結(jié)核主要有異煙肼、利福平等藥物,但由于其對肝等器官造成損傷,使患者依從性降低,有效治療對于控制肺結(jié)核的傳播和降低其死亡率具有重要意義[8,12]。因此,本研究以結(jié)核分枝桿菌建立肺結(jié)核大鼠模型,通過分析肺結(jié)核大鼠炎癥相關(guān)指標(biāo),探索藥物的作用效果及機(jī)制。

Imp是呋喃香豆素的衍生物,以白色細(xì)長針狀或結(jié)晶狀存在,廣泛存在于多種中草藥中,具有多種藥理學(xué)特性包括抗癌、抗炎、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)和免疫調(diào)節(jié)作用[13]。Hsieh等[14]研究發(fā)現(xiàn),Imp可通過抑制小鼠T輔助細(xì)胞(Th)2反應(yīng)改善屋塵螨誘導(dǎo)的過敏性哮喘。Li等[15]研究還發(fā)現(xiàn),Imp具有抗炎作用,可改善肺部炎癥、水腫和纖維化,可能是與炎癥相關(guān)的肺病的潛在抗炎劑。結(jié)核分枝桿菌菌落數(shù)可反映肺結(jié)核的嚴(yán)重程度[16],本研究反映肺結(jié)核大鼠肺組織嚴(yán)重病變,大量炎性浸潤及炎癥因子IL-6、IFN-γ、COX-2產(chǎn)生,結(jié)核桿菌菌落數(shù)及細(xì)胞凋亡率明顯增加,提示大鼠產(chǎn)生肺結(jié)核與炎性浸潤有關(guān)。不同劑量的Imp干預(yù)后,肺組織病變逐漸減輕,菌落數(shù)、炎性因子水平及凋亡數(shù)逐漸降低,提示Imp可抑制血清中炎性因子的釋放及肺組織中結(jié)核桿菌的增殖及細(xì)胞凋亡,改善結(jié)核桿菌造成的肺損傷,阻止炎性因子的進(jìn)展。

MAPK信號通路包含ERK1/2、p38 MAPK,與調(diào)節(jié)炎癥及細(xì)胞凋亡、細(xì)胞生長與分化等有關(guān)[17]。如缺氧會激活ERK/P38 MAPK信號通路,從而促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移,在癌癥的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[18]。如參苓白術(shù)散可干預(yù)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠水通道蛋白的表達(dá),可能與抑制ERK/p38 MAPK信號通路激活有關(guān)[19]。HY1702通過抑制MAPK/ERK通路減少了脂多糖刺激的巨噬細(xì)胞的炎癥和新生兒急性呼吸窘迫綜合征癥狀[20]。沉默脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2表達(dá)可通過抑制MAPK/ERK通路抑制急性呼吸窘迫綜合征的炎癥和氧化應(yīng)激損傷[21]。本研究發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核大鼠p-ERK1/2/ERK1/2、p38 MAPK表達(dá)上調(diào),推測其發(fā)生發(fā)展與ERK/MAPK信號通路的激活有關(guān)。不同劑量的Imp干預(yù)后,p-ERK1/2/ERK1/2、p38 MAPK表達(dá)逐漸被抑制,而肺組織病理學(xué)得到改善,炎癥反應(yīng)被抑制,推測Imp可通過抑制ERK/MAPK信號通路的激活,阻止炎性反應(yīng)。為驗(yàn)證該推測,實(shí)驗(yàn)以ERK激活劑-EGF進(jìn)行回復(fù)驗(yàn)證,結(jié)果顯示EGF逆轉(zhuǎn)了Imp對肺結(jié)核大鼠肺損傷的保護(hù)作用,表明Imp的抗炎作用可能通過抑制ERK/MAPK信號通路實(shí)現(xiàn)。

4 結(jié)論

Imp可通過抑制ERK/MAPK信號通路的激活降低肺結(jié)核炎癥反應(yīng),成為潛在的治療肺結(jié)核藥物,但由于通路復(fù)雜,尚需進(jìn)一步核驗(yàn)。