關(guān)帝山不同海拔和季節(jié)對(duì)沙棘黃酮含量的影響

代永欣 薛靜茹 楊 楠 李澤淇 侯 銳 杭宇杰 呂英忠 王 林，*

（1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，山西 太谷 030801；2山西農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹(shù)研究所，山西 太谷 030815）

沙棘（HippophaerhamnoidesL.）是一種重要的經(jīng)濟(jì)樹(shù)種，兼有生態(tài)、食用、藥用等多種用途，是天然藥食兩用原料，被收載于《中華人民共和國(guó)藥典（2020版）》［1］。黃酮類化合物是沙棘中主要的生物活性成分和特征成分，屬于一大類酚類次生代謝產(chǎn)物，具有抗氧化活性，對(duì)植物起防御保護(hù)作用［2］。目前已從沙棘中鑒定出95種以上黃酮類化合物，主要是楊梅素、槲皮素、山柰酚、異鼠李素等黃酮苷元及其苷類化合物［3-4］。研究發(fā)現(xiàn)沙棘果和葉片中均富含黃酮類化合物，國(guó)內(nèi)外研究大多集中于沙棘果或葉片化學(xué)成分分析，及其抗氧化活性評(píng)價(jià)和比較［5-10］，而對(duì)于植物中生物量較高的莖（枝）器官的研究相對(duì)較少，這限制了對(duì)沙棘的全面利用。

次生代謝物質(zhì)是植物適應(yīng)生態(tài)環(huán)境的產(chǎn)物，植物體內(nèi)黃酮類化合物含量與環(huán)境條件密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)植物體內(nèi)的黃酮類化合物含量隨著光照強(qiáng)度的增強(qiáng)而升高［11］；短期、輕度干旱脅迫可促進(jìn)植物次生代謝物質(zhì)的積累［12］；低溫可促進(jìn)銀杏（Ginkgo biloba）葉片類黃酮的積累［13-14］，可見(jiàn)黃酮類化合物含量在環(huán)境脅迫條件下呈升高趨勢(shì)。海拔高度綜合了溫度、水分、光照等環(huán)境因子，同樣會(huì)影響植物體內(nèi)黃酮類化合物含量，Ma 等［15］發(fā)現(xiàn)隨著海拔（210～3 000 m）的升高，不同地區(qū)的野生沙棘果實(shí)中黃酮醇苷含量呈上升趨勢(shì)。沙棘常生長(zhǎng)于海拔800～3 600 m 的溫帶地區(qū)，目前有關(guān)同一地區(qū)不同海拔高度對(duì)沙棘黃酮類化合物含量影響的研究鮮有報(bào)道，限制了對(duì)沙棘黃酮類化合物含量響應(yīng)環(huán)境變化的全面了解，在實(shí)踐上不能為沙棘黃酮高含量強(qiáng)化栽培模式提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

我國(guó)是世界上沙棘資源最豐富的國(guó)家，沙棘資源面積占全球沙棘總面積的90%以上［16］，境內(nèi)分布最廣的是中國(guó)沙棘（HippophaerhamnoidesL.subsp.sinensisRousi）亞種，在改良生態(tài)環(huán)境和發(fā)展當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)方面發(fā)揮重要作用。近年來(lái)，沙棘的保健功能日益受到關(guān)注，植物化學(xué)成分含量高常被作為沙棘功能化利用的理想性狀［17］。本研究以山西省關(guān)帝山區(qū)野生中國(guó)沙棘為研究對(duì)象，通過(guò)測(cè)定不同海拔、不同季節(jié)中國(guó)沙棘不同部位的總黃酮及其主要成分含量，分析沙棘一年生枝、葉、果實(shí)中黃酮類化合物含量對(duì)季節(jié)和海拔的響應(yīng)，旨在揭示中國(guó)沙棘不同部位黃酮類化合物含量隨生長(zhǎng)季節(jié)、海拔高度的變化規(guī)律，為沙棘功能化利用及沙棘黃酮高含量強(qiáng)化栽培模式提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況與試驗(yàn)材料

本研究在山西省西部呂梁山脈，關(guān)帝山龐泉溝自然保護(hù)區(qū)（111°18'～112°18'E，37°20'～38°20'N，海拔2 831 m）進(jìn)行。該區(qū)屬溫帶大陸性季風(fēng)氣候，年平均氣溫4.3 ℃，1月份平均氣溫最低，為-10.2 ℃，7月份平均氣溫最高，為17.5 ℃。年均降水量為600～822 mm，降水主要集中在7、8月份。于2021年5月在1 150、1 400、1 650、1 800和2 100 m 海拔高度的天然沙棘灌木純林各設(shè)置3個(gè)10 m×10 m樣地，樣地為陽(yáng)坡或半陽(yáng)坡，設(shè)置在坡中下部，樣地的生長(zhǎng)季平均氣溫和平均降水量［18］見(jiàn)表1。試驗(yàn)材料為所選定樣地中的野生中國(guó)沙棘植株。

表1 關(guān)帝山季均溫和季均降水量Table 1 Seasonal mean temperature and precipitation of Guandi mountain

1.2 試驗(yàn)方法

于2021年5月（春季）、7月（夏季）、9月（秋季）沿海拔梯度在每個(gè)樣地中隨機(jī)選擇3 株野生中國(guó)沙棘平均木采集樣品，5月尚無(wú)當(dāng)年生枝條，只采集新生葉片，7月采集葉片和一年生枝，9月采集葉片、一年生枝和果實(shí)。葉片、枝條、果實(shí)均選擇向陽(yáng)面樹(shù)冠中上部位置采集，將采集的樣品在烘箱中105 ℃殺青，之后于85 ℃烘干至恒重，用粉碎機(jī)粉碎至粉末狀，過(guò)100 目篩，用于總黃酮及黃酮主要成分和非結(jié)構(gòu)性碳含量測(cè)定。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 沙棘總黃酮含量的測(cè)定 采用粉碎過(guò)篩后的樣品，參考任園宇等［19］的亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法對(duì)總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2 沙棘黃酮類化合物含量的測(cè)定 對(duì)黃酮類化合物中含量較多的楊梅素、槲皮素、山柰酚、異鼠李素四種黃酮苷含量進(jìn)行測(cè)定，參照衛(wèi)罡等［20］的方法并稍作修改，具體如下：首先確定色譜分析條件，流動(dòng)相為甲醇+0.4%磷酸水溶液（1∶1），色譜柱為WondaSilTM C18 Superb（4.6 mm×150 mm），柱溫35 ℃，流速1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm。然后配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，按色譜條件加樣，以質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析（表2）。

表2 色譜分析線性回歸方程Table 2 Linear regression equation for chromatographic analysis

稱取粉碎過(guò)篩后的樣品0.2 g置于100 mL燒杯中，加入30 mL甲醇，混勻，超聲提取1 h，重復(fù)提取3次，合并提取液后用RE52 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）進(jìn)行濃縮至25 mL。加入25 mL 甲醇-25%鹽酸溶液（4∶1），75 ℃水浴1 h，自然冷卻后轉(zhuǎn)入50 mL 量瓶中定容，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，所得濾液即為樣品待測(cè)液。采用LC-20AT/SPD-M20A 高效液相色譜儀（日本島津公司）進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 沙棘生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定 于2021年5月在設(shè)置的樣地中選取6株沙棘平均木，測(cè)量株高、冠幅。9月，在向陽(yáng)面樹(shù)冠中上部選擇10個(gè)一年生枝條上的第3個(gè)成熟葉片，用YMJ-C 型葉面積掃描儀（浙江托普儀器有限公司）測(cè)定葉面積。

1.3.4 光合生理指標(biāo)的測(cè)定 于2021年7月天氣晴朗的上午9∶00—11∶30，在設(shè)定的樣地中采用Li-6400光合儀（美國(guó)LI-COR 公司）隨機(jī)測(cè)定沙棘植株中上部成熟葉片凈光合速率（net photosynthetic rate，Pn）和氣孔導(dǎo)度（stomatal conductance，Gs）。其中，光合有效輻射（photosynthetically active radiation，PAR）設(shè)定為1 500 μmol·m-2·s-1，CO2濃度為400 μmol·mol-1。

1.3.5 非結(jié)構(gòu)性碳含量的測(cè)定 采用硫酸蒽酮法［21］測(cè)定粉碎過(guò)篩后的樣品可溶性糖和淀粉含量，非結(jié)構(gòu)性碳（nonstructural carbohydrates，NSC）含量為可溶性糖與淀粉含量之和。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和處理，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示；用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析、差異顯著性比較（α=0.05）和相關(guān)性分析；利用Sigmaplot 10.0軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同海拔和季節(jié)條件下中國(guó)沙棘葉片黃酮類化合物含量

由圖1 可知，不同海拔高度下，葉片總黃酮含量均為9月份最高，5月份最低（因5月高海拔植株尚未萌發(fā)葉片，故未采集到1 800 和2 100 m 處葉片），且隨海拔升高整體呈先升高后降低趨勢(shì)，在1 650 m處的9月份達(dá)到最大值，為17.32 mg·g-1。各黃酮類化合物含量變化并無(wú)統(tǒng)一規(guī)律，與總黃酮含量的變化趨勢(shì)并不一致。隨著海拔的升高，楊梅素含量先下降后上升，最大值出現(xiàn)在1 150 m 處的7月份，為1.12 mg·g-1；槲皮素含量整體先升高后降低，在1 800 m 處的9月份達(dá)到最大值，為2.21 mg·g-1；而9月份異鼠李素含量除在1 400 m 處略有下降外，基本呈上升趨勢(shì)，在2 100 m 處達(dá)到最大值，為2.48 mg·g-1。說(shuō)明除上述幾種主要的黃酮類化合物外，其他類黃酮成分含量也會(huì)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致總黃酮含量發(fā)生變化。

圖1 不同季節(jié)沙棘葉片黃酮類化合物含量沿海拔的變化Fig.1 Changes of flavonoids contents of leaves in different seasons along altitude in sea buckthorn

2.2 不同海拔和季節(jié)條件下中國(guó)沙棘一年生枝黃酮類化合物含量

由圖2 可知，與葉片相反，不同海拔高度一年生枝總黃酮含量均表現(xiàn)為7月高于9月，除海拔1 800 m外，隨海拔的升高呈略上升趨勢(shì)，最大值為4.90 mg·g-1。黃酮類化合物楊梅素、山奈酚、槲皮素、異鼠李素基本呈相似的變化趨勢(shì)，均在7月份隨海拔升高整體呈下降趨勢(shì)，9月份沿海拔升高呈略升高趨勢(shì)，幾種黃酮類化合物7月份含量最高值均在1 150 m 處，9月份含量最高值均在2 100 m處。

圖2 不同季節(jié)沙棘一年生枝黃酮類化合物含量沿海拔的變化Fig.2 Changes of flavonoids contents of one-year-old branches in different seasons along altitude in sea buckthorn

2.3 不同海拔中國(guó)沙棘果實(shí)黃酮類化合物含量

由圖3可知，果實(shí)總黃酮含量沿海拔梯度呈先升高后下降變化趨勢(shì)（海拔2 100 m 處植株未結(jié)實(shí)，故未采集到），1 650 m處顯著高于其他海拔，為10.31 mg·g-1。楊梅素含量隨海拔升高而逐漸升高，最大值在1 800 m處，為0.52 mg·g-1。山奈酚含量在各海拔間無(wú)顯著差異，維持在0.35 mg·g-1左右。槲皮素和異鼠李素含量隨海拔升高而逐漸降低，最大值在1 150 m 處，分別為0.53和0.78 mg·g-1。

圖3 沙棘果實(shí)黃酮類化合物含量沿海拔的變化Fig.3 Changes of flavonoids contents of berries along altitude in sea buckthorn

2.4 不同海拔中國(guó)沙棘的生長(zhǎng)情況和光合指標(biāo)

由表3可知，中國(guó)沙棘的株高和冠幅整體均隨海拔高度的增加呈先升高后降低趨勢(shì)。其中株高在1 400 m處達(dá)到最大值，為3.6 m；冠幅在1 650 m處達(dá)到最大值，為2.3 m，顯著高于其他海拔。葉面積在1 650 m處達(dá)到最大值，為326.55 mm2，除略高于2 100 m處外，顯著高于其他海拔。凈光合速率和氣孔導(dǎo)度整體均隨海拔高度的增加呈升高趨勢(shì)，均在2 100 m處達(dá)到最大值，分別為18.34 μmol CO2·m-2·g-1和1.65 mmol H2O·m-2·g-1。

表3 不同海拔沙棘的株高、冠幅、葉面積、凈光合速率和氣孔導(dǎo)度Table 3 Plant height，crown width，leaf area，net photosynthetic rate and stomatal conductance of sea buckthorn at different altitudes

2.5 不同海拔和季節(jié)條件下中國(guó)沙棘的非結(jié)構(gòu)性碳含量

由圖4 可知，葉片、一年生枝、果實(shí)中不同季節(jié)淀粉和可溶性糖含量隨海拔升高整體均呈先升高后降低趨勢(shì)，均在1 650 m 處達(dá)到最大值。對(duì)于同一部位，各海拔一年生枝可溶性糖和NSC 含量均表現(xiàn)為7月＞9月，各海拔葉片可溶性糖和NSC含量表現(xiàn)為5月＞7月＞9月；對(duì)于同一海拔，7月一年生枝可溶性糖和NSC 含量均大于葉片，9月為果實(shí)＞一年生枝＞葉片，果實(shí)NSC含量最大為17%左右，一年生枝和葉片NSC 含量最大接近14%。

圖4 不同季節(jié)沙棘不同部位NSC含量沿海拔的變化Fig.4 Changes of NSC content of different parts in different seasons along altitude in sea buckthorn

2.6 不同海拔中國(guó)沙棘黃酮類化合物含量與生長(zhǎng)和生理指標(biāo)的關(guān)系

通過(guò)對(duì)9月中國(guó)沙棘果實(shí)和葉片總黃酮及其成分含量與氣候因子、海拔、生長(zhǎng)和生理指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)果實(shí)總黃酮含量與果實(shí)可溶性糖、果實(shí)NSC、葉片可溶性糖、葉片NSC 含量呈極顯著正相關(guān)，葉總黃酮含量與果實(shí)可溶性糖和果實(shí)NSC 含量呈顯著正相關(guān)。果實(shí)楊梅素和葉槲皮素含量與海拔極顯著正相關(guān)，而果實(shí)槲皮素和果實(shí)異鼠李素含量與海拔極顯著負(fù)相關(guān)；果實(shí)楊梅素含量與季均溫呈極顯著負(fù)相關(guān)，與季均降水量呈顯著或極顯著正相關(guān)；果實(shí)槲皮素含量則與季均溫呈極顯著正相關(guān)，與季均降水量呈極顯著負(fù)相關(guān)。果實(shí)槲皮素和果實(shí)異鼠李素含量還與凈光合速率、葉面積等指標(biāo)呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)（表4）。

表4 沙棘黃酮類化合物與生長(zhǎng)指標(biāo)、氣候指標(biāo)、碳代謝之間的相關(guān)性Table 4 Results of correlation analysis between flavonoids and growth indexes，climate indexes and carbon metabolism in sea buckthorn

3 討論

3.1 海拔高度和季節(jié)對(duì)中國(guó)沙棘黃酮類化合物含量的影響

海拔變化可引起復(fù)雜的環(huán)境變化，從而引起黃酮類化合物含量的變化。前人研究發(fā)現(xiàn)，黃芩、軟棗獼猴桃、長(zhǎng)白山篤斯越桔、祁連圓柏、杜松、紅豆杉等植物的酚類物質(zhì)或總黃酮含量均隨海拔升高而升高［22-27］。而本研究中，野生中國(guó)沙棘葉片、一年生枝、果實(shí)中總黃酮含量均隨海拔梯度（1 150～2 100 m）呈先升高后下降趨勢(shì)，整體以1 650 m 處的含量最高。一般來(lái)說(shuō)，隨著海拔升高，紫外線輻射增強(qiáng)，黃酮類化合物可增強(qiáng)植物應(yīng)對(duì)紫外線輻射的能力，紫外光調(diào)控了黃酮類化合物合成過(guò)程中的酶活性，從而促進(jìn)黃酮類化合物的合成［11］。也有研究表明，低溫（4或5 ℃）處理有利于黃酮類化合物的積累［28-29］。本研究海拔1 650 m處春、秋季均溫分別為5.6 和4.7 ℃，與文獻(xiàn)［28-29］中可促進(jìn)黃酮類化合物積累的溫度接近，說(shuō)明適度低溫有利于黃酮類化合物的積累，海拔過(guò)高導(dǎo)致溫度過(guò)低，可能對(duì)植物生長(zhǎng)不利。本研究還發(fā)現(xiàn)，四種主要類黃酮成分含量隨海拔的變化趨勢(shì)并不一致，原因可能是不同黃酮成分的作用機(jī)制和調(diào)控機(jī)制不同，具體有待進(jìn)一步深入研究。

在比較沙棘葉片和果實(shí)黃酮含量的研究中，都一致報(bào)道了同一沙棘株系葉片總黃酮含量高于果實(shí)［2，30-33］，對(duì)枝的研究相對(duì)較少，有研究發(fā)現(xiàn)沙棘枝中總黃酮含量遠(yuǎn)低于葉片［34-35］。本研究發(fā)現(xiàn)，中國(guó)沙棘總黃酮含量表現(xiàn)為葉片＞果實(shí)＞一年生枝，與前人研究結(jié)果基本一致［34-35］。同時(shí)，葉片總黃酮含量也存在季節(jié)變化，表現(xiàn)為9月＞7月＞5月，說(shuō)明隨著葉齡的增加，黃酮類化合物在葉中的積累也增加。一年生枝的總黃酮含量在同一海拔表現(xiàn)為7月高于9月，與葉片呈現(xiàn)不一致的規(guī)律，但一年生枝中最大總黃酮含量遠(yuǎn)低于葉片和果實(shí)，利用價(jià)值不大。胡建忠等［8］研究發(fā)現(xiàn)，人工種植的中國(guó)沙棘葉片總黃酮含量在5—7月高于8—9月，與本研究結(jié)果相反，可能是因?yàn)榭傸S酮含量受季節(jié)和環(huán)境因素的共同影響，本研究所在地為關(guān)帝山區(qū)，海拔是主要影響因素。

3.2 生長(zhǎng)和碳代謝對(duì)不同海拔中國(guó)沙棘黃酮類化合物含量的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，中國(guó)沙棘在海拔1 650 m處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。前期研究也發(fā)現(xiàn)低海拔和高海拔均對(duì)中國(guó)沙棘生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制，低海拔主要受干旱脅迫影響，高海拔的低溫、生長(zhǎng)季縮短同樣不利于中國(guó)沙棘生長(zhǎng)［36］。雖然有研究發(fā)現(xiàn)干旱脅迫可促進(jìn)次生代謝物的積累，但長(zhǎng)期、重度干旱脅迫則不利于次生代謝物積累［12］。較多研究觀察到短期、輕度干旱條件下，植物體內(nèi)會(huì)有一個(gè)碳積累的過(guò)程［37］，該時(shí)期植物可能會(huì)產(chǎn)生更多的次生代謝物質(zhì)用于防御。但在重度或長(zhǎng)期干旱條件下，植物體內(nèi)水分輸導(dǎo)嚴(yán)重受阻，儲(chǔ)存碳逐漸被消耗導(dǎo)致碳供需失衡，植物不可能將儲(chǔ)存碳用于合成次生代謝物［38］。因此，黃酮的積累也是植物生長(zhǎng)和碳代謝權(quán)衡的結(jié)果，在不影響植物正常生長(zhǎng)的情況下，適度脅迫有利于黃酮積累。

關(guān)帝山區(qū)中國(guó)沙棘的凈光合速率隨海拔升高呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，在2 100 m處達(dá)到最大值。眾多研究提出植物存在水-碳耦合機(jī)制，其中之一體現(xiàn)在光合作用對(duì)水分狀況的依賴上［39］。隨著海拔的升高，關(guān)帝山區(qū)降水增多，凈光合速率也隨之增大。但是較高的凈光合速率并未轉(zhuǎn)化為高水平的非結(jié)構(gòu)性碳（NSC），中國(guó)沙棘各個(gè)部位NSC含量在2 100 m處反而下降，可能是由于高海拔處葉面積降低、日光合有效時(shí)間及生長(zhǎng)季縮短導(dǎo)致光合產(chǎn)物含量降低。中國(guó)沙棘葉片、一年生枝、果實(shí)NSC和可溶性糖含量均在1 650 m處達(dá)到最大值，樹(shù)木生長(zhǎng)狀況也優(yōu)于其他海拔，表明此處樹(shù)木光合產(chǎn)物供應(yīng)充足。NSC主要為各種生理過(guò)程提供能量和代謝中間產(chǎn)物，為結(jié)構(gòu)物質(zhì)和功能分子提供配基，很多黃酮類成分即是與糖基結(jié)合形成黃酮醇苷類化合物［4］。因此，NSC不足不僅會(huì)影響植物的生理代謝過(guò)程，也會(huì)影響黃酮類化合物的合成，而光合產(chǎn)物供應(yīng)充足有利于黃酮類化合物的積累。

4 結(jié)論

關(guān)帝山野生中國(guó)沙棘總黃酮含量表現(xiàn)為葉片＞果實(shí)＞一年生枝，均隨海拔高度（1 150～2 100 m）的增加呈先升高后降低趨勢(shì)，在中海拔（1 650 m）處達(dá)到最大值。葉片總黃酮含量在9月最高。1 650 m 處植株綜合生長(zhǎng)狀況最好，葉片、一年生枝和果實(shí)非結(jié)構(gòu)性碳（NSC）含量最高。果實(shí)總黃酮含量與果實(shí)可溶性糖、果實(shí)NSC、葉片可溶性糖、葉片NSC 含量呈極顯著正相關(guān)。葉片總黃酮含量與果實(shí)可溶性糖和果實(shí)NSC 含量呈顯著正相關(guān)。果實(shí)楊梅素和葉槲皮素含量與海拔呈極顯著正相關(guān)，而果槲皮素和果異鼠李素含量與海拔呈極顯著負(fù)相關(guān)。表明中海拔（1 650 m）中國(guó)沙棘的葉片和果實(shí)是黃酮含量較高的部位，生長(zhǎng)季后期黃酮在葉片積累較多，沙棘體內(nèi)總黃酮含量除受環(huán)境條件影響外，還與植物生長(zhǎng)狀況和碳代謝密切相關(guān)。