γ射線輻照協(xié)同水熱處理制備油茶殼低聚木糖的工藝研究

武小芬 彭煒煜 沈曉巖 王 巖 齊 慧 劉 安蘇小軍 陳 亮，*

（1湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖南省核農(nóng)學(xué)與航天育種研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125；2湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3湖南大學(xué)研究生院隆平分院，湖南 長(zhǎng)沙 410125）

油茶（CamelliaoleiferaAbel）是世界四大木本油料作物之一，2022年全國(guó)油茶種植面積約7 000 萬(wàn)畝（1 畝≈666.67 m2，下同），根據(jù)國(guó)家林業(yè)和草原局等發(fā)布的《加快油茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展三年行動(dòng)方案（2023—2025年）》［1］，預(yù)計(jì)2025年油茶種植面積達(dá)9 000 萬(wàn)畝，產(chǎn)業(yè)發(fā)展?jié)摿薮蟆Ｓ筒铓ぷ鳛椴栌图庸さ闹饕碑a(chǎn)物，占茶果鮮重的50%～60%，是寶貴的生物質(zhì)資源［2］。但作為副產(chǎn)物的油茶殼利用率較低，通常被丟棄或焚燒，不僅造成資源浪費(fèi)，還造成土壤/地下水污染和溫室氣體排放［3］。油茶殼中含有豐富的木質(zhì)纖維素組分，其中木聚糖含量可達(dá)22.33%［4］。因此，采用油茶殼木聚糖制備低聚木糖（xylo-oligosaccharides，XOS）能夠促進(jìn)油茶殼資源的高值化利用［5］。

低聚木糖一般指聚合度為2～7 的木糖聚合物，具有促進(jìn)有益菌增值、預(yù)防便秘和結(jié)腸癌、降低血清膽固醇濃度等作用，主要制備方法包括物理法、化學(xué)法和酶水解法等［4，6-7］。其中，物理法處理過(guò)程簡(jiǎn)單、環(huán)境友好，制備的低聚木糖純度較高，但得率低［8］；化學(xué)法主要以酸水解為主，具有操作簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)，但降解產(chǎn)物復(fù)雜、易造成環(huán)境污染［9］；酶法具有副產(chǎn)物少、環(huán)境友好、產(chǎn)品得率高等優(yōu)點(diǎn)，但酶成本較高［10］。水熱處理技術(shù)以水作為反應(yīng)的唯一溶劑，通過(guò)水自電離產(chǎn)生水合氫離子攻擊半纖維素的糖苷鍵、O-乙酰基和O-葡萄糖醛酸基，產(chǎn)生乙酸和葡萄糖醛酸等有機(jī)酸，催化半纖維素的解聚［11-12］。Moniz 等［13］在210 ℃下水熱處理稻草制備低聚木糖的得率為40.10%。Zhang等［14］采用白樺木屑中乙?；呋收嵩疅崽幚碇苽涞途勰咎?，當(dāng)甘蔗渣/白樺比為65∶35 時(shí)，160 ℃反應(yīng)100 min，低聚木糖得率為49.64%，200 ℃反應(yīng)10 min，得率提高到52.99%，均高于單一甘蔗渣水熱處理。

盡管水熱處理能夠有效解聚木聚糖制備低聚木糖，但單一水熱處理低聚木糖得率相對(duì)較低，需要通過(guò)協(xié)同處理或加入催化劑來(lái)提高低聚木糖轉(zhuǎn)化率。輻照技術(shù)作為一種非熱、綠色的預(yù)處理方法，可破壞木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)，使多糖鏈發(fā)生斷裂形成羧基和醛基，并可催化木聚糖的水熱解聚［15-17］。因此，本試驗(yàn)以0～1 000 kGy 輻照處理的油茶殼為原料，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)研究γ 射線輻照協(xié)同水熱處理油茶殼生產(chǎn)低聚木糖的工藝，旨在實(shí)現(xiàn)油茶殼木聚糖高效制備低聚木糖的目標(biāo)，為油茶殼資源高效利用提供理論依據(jù)，同時(shí)助力于提升油茶產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益和推動(dòng)產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油茶殼由湖南大三湘茶油有限公司提供，自然晾干后備用。

葡萄糖、木糖標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)Sigma公司；濃硫酸，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；試驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

FW 177 高速粉碎機(jī)，天津泰斯特儀器有限公司；JJ-6恒速攪拌器，江蘇金儀儀器科技有限公司；DZKWs-4電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；GZX-9246電熱鼓風(fēng)干燥箱、SHZ-C 水浴恒溫振蕩器、YXQ-50 SⅡ立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BLUE STARA 紫外分光光度計(jì)，北京萊伯泰科儀器股份有限公司；Ulti Mate 3000 高效液相色譜，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；Eco-S 15純水系統(tǒng)，上海和泰儀器有限公司；雷諾PHS-3 C型pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 輻照處理 將自然晾干的油茶殼裝于40 cm×20 cm×20 cm 金屬輻照箱中進(jìn)行動(dòng)態(tài)輻照處理。輻射源為鈷-60，源活度2.96×1016Bq，吸收劑量率為2 kGy·h-1，輻照吸收劑量分別為0（未處理的油茶殼，對(duì)照）、200、400、600、800、1 000 kGy。輻照處理后樣品粉碎過(guò)40目篩、裝于自封袋中備用。

1.3.2 單因素試驗(yàn) 按固液比1∶5、1∶7.5、1∶10、1∶15、1∶20 g·mL-1，分別稱取一定量0、200、400、600、800、1 000 kGy 輻照處理的油茶殼粉末裝于100 mL 立式不銹鋼高壓反應(yīng)器中，置于帶磁力攪拌功能的油浴鍋中于80、100、120、140、160、180、200、220 ℃進(jìn)行水熱處理10、20、30、40、50、60 min。樣品經(jīng)水熱處理后，冷卻，6 000 r·min-1離心10 min，收集濾液，采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）直接測(cè)定木糖含量；另外，取7 mL 濾液加入0.25 mL 72%的硫酸，置于高壓蒸汽滅菌鍋中，121 ℃水解60 min，采用HPLC 測(cè)定酸解濾液中的木糖含量，通過(guò)公式（1）和（2）計(jì)算木糖和低聚木糖轉(zhuǎn)化率［11］。

式中，m1為油茶殼粉絕干質(zhì)量（g）；m2為水熱處理液中的木糖質(zhì)量（g）；m3為水熱處理液酸解后的木糖質(zhì)量（g）；p為油茶殼中木聚糖百分含量（%）。

1.3.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以吸收劑量（A）、水熱處理溫度（B）、水熱處理時(shí)間（C）、固液比（D）為因素，以低聚木糖轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)，進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定γ 射線輻照協(xié)同水熱處理制備低聚木糖的最佳工藝。因素與水平見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors of orthogonal array design

1.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 以未輻照（0 kGy）油茶殼為對(duì)照，對(duì)單因素和正交試驗(yàn)獲得的最優(yōu)條件進(jìn)行驗(yàn)證，水熱處理方法按1.3.2進(jìn)行。

1.3.5 油茶殼水溶性組分和木聚糖含量測(cè)定 稱取3.0 g（精確至0.000 1 g）油茶殼粉，按固液比1∶30 g·mL-1加90 mL 去離子水于三角瓶中，于50 ℃、130 r·min-1反應(yīng)120 min，濾紙過(guò)濾，濾液采用HPLC 分析葡萄糖、木糖含量，并測(cè)定pH 值；取7 mL 濾液加入0.25 mL 72%硫酸121 ℃反應(yīng)60 min，HPLC 測(cè)定酸解后的葡萄糖和木糖含量；濾渣采用少量去離子水沖洗，于105 ℃烘箱中烘干至恒重，用于測(cè)定油茶殼木聚糖含量［18］。根據(jù)公式（3）計(jì)算水溶性組分含量。

式中，m1為油茶殼粉絕干質(zhì)量（g）；m2為水洗后濾渣絕干質(zhì)量（g）。

參照美國(guó)國(guó)際可再生能源實(shí)驗(yàn)室分析方法測(cè)定油茶殼中木聚糖含量［19］。稱取1.3.5 中烘干后濾渣0.3 g（精確至0.000 1 g）于三角瓶?jī)?nèi)，加入3 mL 72%的硫酸，于30 ℃水浴反應(yīng)60 min。隨后加入84 mL 蒸餾水將硫酸濃度稀釋至4%，放入高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃反應(yīng)60 min，反應(yīng)結(jié)束后冷卻、過(guò)濾，濾液用去離子水稀釋至合適倍數(shù)后，采用HPLC 測(cè)定木糖含量，根據(jù)公式（4）計(jì)算油茶殼中木聚糖含量。

式中，m1為油茶殼粉絕干質(zhì)量（g）；m2為HPLC 測(cè)定的木糖質(zhì)量（g）；0.88為木聚糖與木糖轉(zhuǎn)換系數(shù)。

1.3.6 葡萄糖和木糖含量的測(cè)定 采用高效液相色譜測(cè)定葡萄糖和木糖含量。色譜柱為Aminex HPX-87H（7.8 mm×300 mm）、柱溫55 ℃，流動(dòng)相為0.005 mol·L-1硫酸、流速0.6 mL·min-1，示差折光檢測(cè)器（溫度45 ℃），進(jìn)樣體積10 μL［20］。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2019 和Origin 2019 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和繪圖，采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（Duncan’s新復(fù)極差法）和正交試驗(yàn)結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 輻照處理對(duì)油茶殼木聚糖和水溶性組分含量的影響

不同吸收劑量處理的油茶殼水溶性組分和木聚糖含量見(jiàn)表2。未輻照油茶殼中木聚糖含量為21.45%，隨著吸收劑量的增加，木聚糖含量呈下降趨勢(shì)，1 000 kGy 輻照處理油茶殼中木聚糖含量降至最低值11.77%。在0～600 kGy 范圍，油茶殼水溶性組分含量隨吸收劑量的增加呈升高趨勢(shì)，600～800 kGy范圍稍有下降，但無(wú)顯著差異，1 000 kGy 輻照處理后達(dá)到最大值。水溶性組分中低聚木糖含量隨吸收劑量的升高顯著增加（P＜0.05），1 000 kGy輻照處理后低聚木糖含量為對(duì)照的9.63 倍；低聚葡萄糖含量隨吸收劑量的升高也呈增加趨勢(shì)，但增幅遠(yuǎn)小于低聚木糖；葡萄糖和木糖含量隨吸收劑量的變化無(wú)明顯規(guī)律。此外，輻照處理后油茶殼水浸提液pH 值也隨吸收劑量的增加逐漸降低。

表2 不同吸收劑量處理對(duì)油茶殼木聚糖和水溶性組分含量的影響Table 2 Effects of different absorbed doses on the contents of xylan and water-soluble components in Camellia oleifera shells

2.2 輻照協(xié)同水熱處理油茶殼制備低聚木糖單因素試驗(yàn)

不同吸收劑量（0～1 000 kGy）處理油茶殼，在固液比（1∶5）～（1∶20）g·mL-1、水熱處理溫度80～220 ℃反應(yīng)10～60 min，處理后低聚木糖和木糖的轉(zhuǎn)化率見(jiàn)圖1。由圖1-A 可知，隨著吸收劑量的增加，油茶殼經(jīng)100 ℃處理30 min，低聚木糖和木糖轉(zhuǎn)化率均呈增加趨勢(shì)，說(shuō)明輻照能夠促進(jìn)水熱處理過(guò)程中油茶殼木聚糖轉(zhuǎn)化為低聚木糖，同時(shí)也有部分轉(zhuǎn)化為木糖；當(dāng)吸收劑量為400 kGy 時(shí)，低聚木糖轉(zhuǎn)化率顯著增加，比對(duì)照提高了32.98個(gè)百分點(diǎn)；而吸收劑量從400 kGy增加至1 000 kGy時(shí)，低聚木糖轉(zhuǎn)化率僅提高9.51 個(gè)百分點(diǎn)，增幅遠(yuǎn)低于0～400 kGy。溫度是影響油茶殼低聚木糖轉(zhuǎn)化率的重要因素（圖1-B），隨著水熱處理溫度的升高，低聚木糖轉(zhuǎn)化率呈先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)處理溫度為180 ℃時(shí)，低聚木糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大值，180～200 ℃處理間低聚木糖轉(zhuǎn)化率無(wú)顯著差異，220 ℃處理后低聚木糖轉(zhuǎn)化率顯著降低；木糖轉(zhuǎn)化率隨處理溫度的升高呈逐漸增加的趨勢(shì)，220 ℃處理后木糖轉(zhuǎn)化率顯著高于其他處理組，說(shuō)明提高水熱處理溫度會(huì)促進(jìn)木聚糖轉(zhuǎn)化為低聚木糖，但溫度過(guò)高會(huì)促進(jìn)低聚木糖的進(jìn)一步降解，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率降低。不同處理時(shí)間對(duì)油茶殼低聚木糖和木糖轉(zhuǎn)化率的影響見(jiàn)圖1-C，當(dāng)水熱處理時(shí)間為0～30 min，油茶殼低聚木糖轉(zhuǎn)化率隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈顯著增加趨勢(shì)，處理時(shí)間為40 min時(shí)，低聚木糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大值，但在30～60 min 處理組，油茶殼低聚木糖轉(zhuǎn)化率無(wú)顯著差異；木糖轉(zhuǎn)化率則隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高。由圖1-D可知，當(dāng)固液比為1∶5 g·mL-1時(shí)，油茶殼水熱處理低聚木糖轉(zhuǎn)化率為66.47%，低聚木糖濃度達(dá)到25.47 g·L-1；隨固液比的增加，低聚木糖轉(zhuǎn)化率逐漸升高，這是由于底物濃度低時(shí)反應(yīng)更充分；但固液比（1∶10）～（1∶20）g·mL-1處理間低聚木糖轉(zhuǎn)化率無(wú)顯著差異。

圖2 不同處理對(duì)油茶殼低聚木糖和木糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig.2 Effects of different treatment on xylo-oligosaccharide and xylose conversion rate of Camelia oleifera shell

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化輻照協(xié)同水熱處理油茶殼制備低聚木糖工藝

γ射線輻照協(xié)同水熱處理制備油茶殼低聚木糖正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。極差數(shù)據(jù)表明，各因素對(duì)油茶殼低聚木糖轉(zhuǎn)化率的影響程度依次為吸收劑量（A）＞水熱處理溫度（B）＞固液比（D）＞水熱處理時(shí)間（C），最佳處理?xiàng)l件為A2B3C3D2。

表3 γ射線輻照協(xié)同水熱處理制備低聚木糖L9（43）正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of L9（43）orthogonal test for xylo-oligosaccharide prepared by γ ray irradiation combined with hydrothermal treatment

由正交試驗(yàn)得出的低聚木糖轉(zhuǎn)化率最優(yōu)組合并未包含在表3 中的9 組試驗(yàn)中，因此，以未輻照樣品為對(duì)照，選取單因素試驗(yàn)最佳條件（A2B2C2D2）、正交試驗(yàn)最優(yōu)組合（A2B3C3D2）、正交表中最優(yōu)組（A2B3C1D2）進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明（表4），3組驗(yàn)證試驗(yàn)中A2B3C1D2組低聚木糖轉(zhuǎn)化率最高，比對(duì)照提高了22.61 個(gè)百分點(diǎn)。因此，最終確定A2B3C1D2為輻照協(xié)同水熱處理油茶殼制備低聚木糖的最優(yōu)試驗(yàn)條件，即吸收劑量400 kGy、水熱處理溫度200 ℃、水熱處理時(shí)間20 min、固液比1∶10 g·mL-1。

表4 正交試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果Table 4 The verified results for orthogonal test/%

3 討論

輻照技術(shù)用于生物質(zhì)預(yù)處理優(yōu)勢(shì)明顯，具有操作簡(jiǎn)便、過(guò)程能耗低、不需高溫、不污染環(huán)境、易于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化等優(yōu)點(diǎn)。經(jīng)輻照處理后的木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)結(jié)構(gòu)變得松散，纖維素和半纖維素糖苷鍵發(fā)生斷裂，部分降解形成小分子水溶性聚糖，且輻照對(duì)木聚糖的降解作用大于纖維素和木質(zhì)素［21-22］；武小芬等［23］對(duì)輻照后木聚糖樣品理化特性和結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，γ 射線輻照處理后的木聚糖表觀結(jié)構(gòu)被破壞，聚合度減小、熱穩(wěn)定性降低、反應(yīng)活化能下降；這些變化均有助于水熱處理過(guò)程中木聚糖的解聚。本研究發(fā)現(xiàn)，隨吸收劑量的升高，油茶殼水浸提液pH 值逐漸降低，是由于輻照處理后纖維素、木聚糖和木質(zhì)素會(huì)發(fā)生降解產(chǎn)生小分子脂肪酸類物質(zhì)；同時(shí)，這些產(chǎn)物在水熱反應(yīng)過(guò)程中可以作為催化劑促進(jìn)低聚木糖的產(chǎn)生［23-25］。

水熱制備低聚木糖的試驗(yàn)中，400 kGy輻照處理的油茶殼低聚木糖轉(zhuǎn)化率比未輻照油樣品提高22.61 個(gè)百分點(diǎn)；Liu 等［16］采用800 kGy 輻照結(jié)合水熱處理玉米芯，底物濃度30%、160 ℃反應(yīng)60 min，低聚木糖濃度超過(guò)45.53 g·L-1；這些研究結(jié)果表明，輻照是一種有效的預(yù)處理手段，能夠促進(jìn)水熱處理過(guò)程中木聚糖轉(zhuǎn)化為低聚木糖。本試驗(yàn)采用輻照結(jié)合水熱處理油茶殼制備低聚木糖，轉(zhuǎn)化率最高可達(dá)74.33%；Shen 等［26］采用水熱處理?xiàng)钅灸拘迹?80 ℃反應(yīng)30 min，低聚木糖轉(zhuǎn)化率為53.2%；Zhang等［4］采用蘋果酸催化水熱處理油茶殼，120 ℃反應(yīng)30 min，低聚木糖轉(zhuǎn)化率為67.75%；You等［27］采用氯化鋅催化水熱處理油茶殼，170 ℃反應(yīng)30 min，低聚木糖轉(zhuǎn)化率為61.38%；這些研究結(jié)果說(shuō)明，采用輻照協(xié)同水熱處理制備低聚木糖的轉(zhuǎn)化率高于單一水熱處理，同時(shí)也高于蘋果酸和氯化鋅等作為催化劑的水熱處理。盡管本研究低聚木糖轉(zhuǎn)化率低于Zhang 等［28］采用球磨+超聲+水熱處理組（80.40%），但輻照處理相對(duì)于球磨具有能耗低、噪音小、處理過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，且文獻(xiàn)中水熱處理時(shí)間為90 min，本研究最佳處理時(shí)間僅為20 min，大幅提高了處理效率。

輻照預(yù)處理后的油茶殼，水熱處理固液比降至1∶5 g·mL-1時(shí)，低聚木糖轉(zhuǎn)化率仍保持較高水平（66.47%），而此時(shí)處理液中低聚木糖濃度可達(dá)25.47 g·L-1，這說(shuō)明輻照結(jié)合水熱處理是一種有效的制備低聚木糖的方法。后續(xù)將在本試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開(kāi)展不同處理?xiàng)l件下低聚木糖的組成變化研究，探討木二糖、木三糖和木四糖占總低聚木糖的比例，形成2～4 低聚合度低聚木糖高效制備工藝。同時(shí)，還將對(duì)低聚木糖分離純化技術(shù)進(jìn)行研究，開(kāi)發(fā)出高品質(zhì)的低聚木糖產(chǎn)品。此外，水熱處理后油茶殼殘?jiān)饕岳w維素和木質(zhì)素為主，對(duì)其進(jìn)行理化結(jié)構(gòu)分析和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)，將有助于推動(dòng)實(shí)現(xiàn)油茶殼資源全組分高值化利用的目標(biāo)。

4 結(jié)論

輻照處理會(huì)促進(jìn)油茶殼中木聚糖的降解，使油茶殼中水溶性組分和低聚木糖含量增加，促進(jìn)水熱處理過(guò)程中木聚糖的轉(zhuǎn)化。單因素和正交試驗(yàn)結(jié)果表明，輻照協(xié)同水熱處理油茶殼制備低聚木糖的最佳工藝為吸收劑量400 kGy、水熱處理溫度200 ℃、水熱處理時(shí)間20 min、固液比1∶10 g·mL-1，此條件下低聚木糖的轉(zhuǎn)化率為74.33%，比未輻照油茶殼低聚木糖轉(zhuǎn)化率提高22.61 個(gè)百分點(diǎn)?？梢?jiàn)，相對(duì)于傳統(tǒng)水熱處理技術(shù)，采用輻照協(xié)同水熱處理是制備低聚木糖的有效手段。