Pool-ARMS：一種高效檢測混合遺傳樣本中特定單核苷酸變異的方法

曹麗淼 譚瑗瑗 汪 慶 錢 秋 于清濤 舒慶堯，5，*

（1浙江大學(xué)現(xiàn)代種業(yè)研究所/水稻生物育種全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310058；2浙江大學(xué)新農(nóng)村發(fā)展研究院，浙江 杭州 310058；3無錫哈勃生物種業(yè)技術(shù)研究院有限公司，江蘇 無錫 214100；4哈爾濱市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150029；5浙江省作物種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310058）

單核苷酸變異（single nucleotide variation，SNV），又稱單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP），廣泛存在于動植物基因組中，影響RNA 轉(zhuǎn)錄、剪切和蛋白質(zhì)翻譯及其功能。在水稻中，Wx基因第一內(nèi)含子剪切供體位點(diǎn)SNV（G→T）使粳稻稻米直鏈淀粉含量降低［1-2］；一個編碼RNA 酶基因TMS5第71 位的一個SNV（C→A）產(chǎn)生了溫敏雄性不育特性［3］。迄今，已有多種SNV分析方法在作物育種中應(yīng)用。如將SNV 轉(zhuǎn)化為基于酶切位點(diǎn)差異的酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列（cleaved amplified polymorphic sequence，CAPS）或衍生酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列（derived cleaved amplified polymorphic sequence，dCAPS）標(biāo)記［4-5］，基于DNA雙鏈熔解特性差異的高分辨熔解曲線（high-resolution melting analysis，HRM）技術(shù)［6］，以及利用DNA聚合酶延伸對引物3'端或附近與模板的錯配高度敏感的特性建立的擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)PCR（amplification refractory mutation system PCR，ARMS-PCR）等［7］。其中，利用ARMS-PCR可以準(zhǔn)確快速地對SNV進(jìn)行分型，目前已成功應(yīng)用于如水稻香味、光合效率相關(guān)基因［8-9］。但是，該方法只用于個體的基因分型，不能用于混合群體的突變檢測。

通過誘變或堿基編輯創(chuàng)制特異SNV 位點(diǎn)是培育優(yōu)異種質(zhì)資源最直接有效的手段。由于誘發(fā)突變的頻率極低，僅有7.5×10-6～9.8×10-6［10］，美國科學(xué)家開發(fā)了一類混合樣本中檢測突變的技術(shù)，即定向誘導(dǎo)基因組局部突變技術(shù)（targeting induced local lesions in genomes，TILLING）［11］，并衍生了如iTILLING（individualized TILLING）［12］、Seq-TILLING［13］、HRM-TILLING［14］等檢測不同類型突變的技術(shù)體系。這些技術(shù)除基于二代測序（next generation sequencing，NGS）技術(shù)的Seq-TILLING 外，植株混合檢測的倍數(shù)都很?。ㄒ话銥?∶4）且檢測的是各類隨機(jī)突變，無法檢測特定SNV。

在基因組編輯研究中，已開發(fā)基于PCR 片段分型和測序的多種突變檢測技術(shù)［15］。但是，這些方法也無法對特定SNV 進(jìn)行檢測［16］。最新開發(fā)的引導(dǎo)編輯技術(shù)（prime editing，PE）可以精確地實(shí)現(xiàn)所有核苷酸之間的替換，但靶點(diǎn)的唯一性使其在特殊位點(diǎn)的編輯效率仍然很低，從而嚴(yán)重限制了該技術(shù)在植物育種中的應(yīng)用［17-19］。

為了建立可以高效檢出誘變和堿基編輯群體中攜帶目標(biāo)SNV個體的技術(shù)體系，大幅降低兩類群體中目標(biāo)個體的檢出成本，根據(jù)ARMS-PCR的基本原理，本研究設(shè)計一種適用于混合遺傳樣本中檢測攜帶特定SNV個體的方法，簡稱Pool-ARMS。以水稻兩個由單堿基變異引起的長鏈非編碼RNA基因（long non-coding RNA，lncRNA）PMS1和PMS3為例開展實(shí)證性研究［20-22］，即PMS1的一個G→T（pms1）和PMS3的一個C→G（pms3）使水稻獲得了PGMS 特性，以期證明該策略的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 常規(guī)材料和PGMS水稻

本研究試驗(yàn)材料使用粳稻包臺型細(xì)胞質(zhì)雄性不育（BT-cytoplasmic male sterility，BT-CMS）保持系浙粳7B［23］的黃葉突變體浙粳7BY，浙江大學(xué)水稻生物育種全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（本實(shí)驗(yàn)室）采用花藥培養(yǎng)育成的粳型溫敏不育系TS949，野敗型秈稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育系保持系龍?zhí)仄諦的翠綠葉突變系翠玉B（CYB）［24］，聚合抗稻瘟基因Pi1和Pigm的秈稻9311的近等基因系9311pg［25］，以及粳型光周期敏感性雄性不育（photoperiod-sensitive genic male sterility，PGMS）系江79S［26］。

1.2 PGMS水稻的堿基編輯

為通過堿基編輯培育PGMS 水稻，本研究采用高效代理引導(dǎo)基因編輯器編輯目標(biāo)SNV，在pegFinder 網(wǎng)站（http：//pegfinder.sidichenlab.org）根據(jù)pms1和pms3的序列設(shè)計pegRNA 序列［27］。每一個表達(dá)片段都有2 個sgRNA（一個nicking sgRNA 用于切割未編輯的鏈以提高編輯效率，另一個作為pegRNA的一部分）、一個逆轉(zhuǎn)錄序列（reverse transcription，RT）和一個引物結(jié)合位點(diǎn)（primer binding site，PBS），使用多順反子tRNA的策略以提高多重編輯能力和效率，從而產(chǎn)生pegRNA和nicking sgRNA 的串聯(lián)序列［28］。用于這兩個基因引導(dǎo)編輯的pegRNA 和nicking sgRNA 序列具體信息見表1。分別合成了382和377 bp的pegRNA-tRNA-sgRNA-tRNA串聯(lián)序列（重復(fù)序列tRNA為77 bp，gRNA scaffold為76 bp）。為實(shí)現(xiàn)雙靶基因的引導(dǎo)編輯，將兩者合成為一個759 bp的表達(dá)片段。最后，將目的表達(dá)片段導(dǎo)入基于潮霉素和雙草醚抗性基因的雙代理引導(dǎo)基因編輯器PE3-DS載體［19］。具體方法為：Hind Ⅲ酶切PE3-DS 載體并回收，用In-fusion 無縫克隆方法將表達(dá)盒與PE3-DS 線性化載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，菌落PCR 篩選陽性克隆。重組質(zhì)粒經(jīng)測序和序列比對，若正確則用于后期轉(zhuǎn)化。

表1 用于PGMS基因PMS1和PMS3引導(dǎo)編輯的pegRNA和nicking sgRNA序列Table 1 pegRNA and nicking sgRNA sequences for prime editing of PGMS genes PMS1 and PMS3

從成熟胚誘導(dǎo)水稻愈傷組織，并用活化的攜帶堿基編輯重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染生長狀態(tài)良好的亮黃色致密胚性愈傷組織［29］。農(nóng)桿菌浸染的愈傷組織在培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)3 d后，用無菌水和含頭孢的無菌水依次進(jìn)行浸泡沖洗，瀝干后將轉(zhuǎn)到含500 mg·L-1頭孢和50 mg·L-1潮霉素的第一輪選擇培養(yǎng)基上，26 ℃、16 h 光照/8 h 黑暗條件下培養(yǎng)2 周。因?yàn)镻E3-DS 載體是一個基于潮霉素Y46*和基于OsALSS627I組合的雙代理系統(tǒng)，因此在抗性愈傷組織第二輪篩選培養(yǎng)基將潮霉素濃度提高至80 mg·L-1的同時加入0.65 μmol·L-1的雙草醚（bispyribacsodium，BS），置于26 ℃、16 h光照/8 h黑暗條件下培養(yǎng)。之后，2 周換一次培養(yǎng)基，直至長出抗性愈傷組織。將抗性愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo)分化和生根，獲得堿基編輯的T0植株，取1～2 cm葉片用于后期檢測。

1.3 擴(kuò)增阻滯PCR引物設(shè)計與程序優(yōu)化

采用十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）法提取水稻基因組DNA［30］。根據(jù)ARMS-PCR原理，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計一條與模板DNA 序列完全一致的引物，即用于擴(kuò)增PMS1/pms1的pms1/R 和用于擴(kuò)增PMS3/pms3的pms3/F，一條用于區(qū)別目標(biāo)SNV與非目標(biāo)SNV等位基因的帶錯配堿基的引物（圖1）。設(shè)計攜帶錯配的引物時，3'末端的最后一個核苷酸與目標(biāo)SNV 一致，在3'末端倒數(shù)第二位或第三位引入一個錯配堿基，錯配堿基為除本身堿基外另三種堿基類型（圖1）。

圖1 兩個水稻PGMS基因（PMS1和PMS3）攜帶SNV的片段及其ARMS-PCR引物設(shè)計示意圖Fig.1 Diagram of the fragments of two rice PGMS genes PMS1 and PMS3 and their respective SNVs and the primers designed for ARMS-PCR

為確定最佳引物和擴(kuò)增條件，采用梯度PCR進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 體系為20 μL，體系為：引物各0.8 μL，Green Taq Mix（P131，南京諾唯贊生物科技股份有限公司）10 μL，無菌水7.4 μL，模板1 μL（200 ng·μL-1）。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，退火15 s（溫度梯度為56～66 ℃，PMS1為62 ℃，PMS3為63 ℃），72 ℃延伸，共30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物1 %瓊脂糖凝膠電泳，拍照保存。

經(jīng)檢測擴(kuò)增成功的PCR 產(chǎn)物送浙江有康生物科技有限公司進(jìn)行Sanger 測序，使用DNAMAN 6.0 軟件分析每個目標(biāo)位點(diǎn)的Sanger測序圖譜。

1.4 混池樣本篩選SNV檢測

為建立混合樣本SNV檢測體系，以浙粳7BY（PMS1和PMS3）和江79S（pms1和pms3）為材料，按三種方式進(jìn)行DNA 混樣：1）DNA 混樣：先提取浙粳7BY 和江79S葉片的DNA，按1∶9、1∶19、1∶49、1∶99的比例混合成樣；2）葉片混樣：用1.5 mm 打孔器取單株葉片樣本，再按不同比例混合制成葉片樣本，提取DNA；3）芽鞘混樣：將種子浸種2 d、催芽2 d以獲得萌動的種子，取其胚芽鞘4 mm，再按不同比例混合制成芽鞘樣本，提取DNA。葉片混樣和芽鞘混樣兩種混合樣本中江79S∶浙粳7BY的比例設(shè)為1∶1、1∶9、1∶19、1∶24、1∶49。以1.3確定的最佳ARMS-PCR條件檢測目標(biāo)SNV。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同水稻材料的PMS1和PMS3基因型

為保證試驗(yàn)材料的準(zhǔn)確性，先對包含PMS1和PMS3基因SNV 位點(diǎn)的片段測序。結(jié)果證實(shí)，江79S的SNV-pms1和SNV-pms3分別為T和G，與已報道的PGMS材料一致；其余四份材料的SNV-pms1和SNV-pms3分別為G和C，均為野生型PMS1和PMS3（圖2）。

圖2 不同水稻材料PGMS基因PMS1和PMS3片段序列分析Fig.2 Sequence analysis of PGMS genes PMS1 and PMS3 in different rice accessions

2.2 PGMS等位基因特異性擴(kuò)增

為建立PGMS 等位基因特異性擴(kuò)增體系，以浙粳7BY 和江79S 兩種材料，分析了12 對PCR 引物特異性擴(kuò)增光敏SNV 的效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在56～64 ℃溫度范圍內(nèi)，用倒數(shù)第三位堿基錯配的引物擴(kuò)增可以明顯區(qū)分PMS1和pms1；在61～63 ℃溫度范圍內(nèi)，用倒數(shù)第三位堿基錯配的引物擴(kuò)增可以明顯區(qū)分PMS3和pms3。在這兩個PGMS基因位點(diǎn)上，用3'末端倒數(shù)第二位堿基的錯配的引物區(qū)分效果均差于倒數(shù)第三位堿基錯配的引物。

為確定最佳退火溫度以及錯配堿基的類型，對用倒數(shù)第三位堿基錯配的引物區(qū)分SNV 的效果做了進(jìn)一步研究。發(fā)現(xiàn)倒數(shù)第三位堿基錯配為G的引物區(qū)分PMS1/pms1和PMS3/pms3的效果最好，最佳退火溫度分別為62 和63 ℃。因此，建立了特異性擴(kuò)增PGMS 等位基因pms1和pms3的引物和PCR參數(shù)（表2）。

表2 PCR擴(kuò)增條件的參數(shù)Table 2 Optimized PCR amplification conditions

采用以上引物和擴(kuò)增條件，多次對4份非PGMS材料進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果均無擴(kuò)增條帶（圖3），說明可以特異且高效檢測PGMS基因。

圖3 水稻PGMS基因pms1和pms3等位基因型檢測Fig.3 Genotyping of two PGMS genes pms1 and pms3 in rice

2.3 混合樣本SNV檢測

2.3.1 葉片組織DNA樣本 葉片是提取DNA最常用的材料。比較先提取DNA 再混合成DNA 池和取等量葉片組織混合后直接提取DNA 兩種方法的檢測效果。采用先提取再根據(jù)DNA 濃度調(diào)整后按不同比例混合形成混樣DNA模板，發(fā)現(xiàn)以1∶99混合時仍可擴(kuò)增出特異性條帶（圖4）。在采用打孔器從葉片中均勻取樣、混合，提取的DNA 用于PCR 模板時，無論是pms1還是pms3，檢出水平降為1∶49（圖5）。上述方法均經(jīng)過多輪、多次試驗(yàn)，結(jié)果均能很好重現(xiàn)。

圖4 葉片提取DNA按不同比例混合成樣本的突變檢測電泳圖Fig.4 Mutation detection of mixed DNA from leaves samples in different proportions using agarose electrophoresis

圖5 不同比例葉片混合樣本的突變靈敏度檢測電泳圖Fig.5 Mutation detection of mixed leaf samples in different proportions using agarose electrophoresis

2.3.2 萌動種子芽鞘組織混合DNA 樣本 由于芽鞘組織量很少，保證取完胚芽鞘后的種子仍能正常生長，本研究采用先混合芽鞘組織的樣本、再提DNA 的方法。多次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果表明，pms1和pms3位點(diǎn)的檢出效率為1∶24的比例（圖6）。

圖6 不同比例胚芽鞘混合樣本的突變檢測電泳圖Fig.6 Mutation detection of mixed coleoptile samples in different proportions using agarose electrophoresis

2.4 堿基編輯材料的pms1和pms3 SNV檢測

本試驗(yàn)共獲得pms1和pms3雙靶點(diǎn)基因編輯載體轉(zhuǎn)基因T0植株63株，其中CYB轉(zhuǎn)化苗15株，浙粳7BY轉(zhuǎn)化苗48株。采用打孔器葉片取樣后提取單株的DNA，利用本研究建立的特異性PCR體系，擴(kuò)增并檢測目標(biāo)條帶。結(jié)果顯示，試驗(yàn)組均沒有擴(kuò)增出特異性條帶（圖7）。為驗(yàn)證Pool-ARMS 結(jié)果的準(zhǔn)確性，對63株植株單獨(dú)提取DNA 并采用常規(guī)方法擴(kuò)增目標(biāo)片段，進(jìn)行Sanger 測序分析。結(jié)果顯示（圖8），這些植株的PGMS基因與親本一致，均為正?？捎蛐?，與Pool-ARMS 法確定的結(jié)果一致。

圖7 兩個PGMS基因堿基編輯材料的Pool-ARMS檢測電泳圖Fig.7 Pool-ARMS detection for the mutation of two PGMS genes in base editing plants

圖8 兩個PGMS基因PMS1（A）和PMS3（B）堿基編輯水稻T0植株的PCR片段和序列比對圖Fig.8 PCR amplification and sequence alignment of two PGMS genes PMS1（A）and PMS3（B）in T0 rice plants transformed with base-editing vectors

3 討論

ARMS-PCR 作為一種操作簡便、準(zhǔn)確性較高且低成本的SNV 分型技術(shù)，可以準(zhǔn)確地將單堿基突變的樣本進(jìn)行區(qū)分，實(shí)現(xiàn)快速、簡單、低成本和高通量的基因分型［31］，具有廣闊的應(yīng)用前景和發(fā)展?jié)摿ΑＴ谔禺愋許NV 篩查中，只需確定群體中是否含有特定SNV 的個體，無需對特異和非特異SNV基因型進(jìn)行分型，因此目標(biāo)是建立特異性擴(kuò)增目標(biāo)SNV的體系?；谶@一需求，本研究通過針對目標(biāo)SNV 設(shè)計一條特異擴(kuò)增引物，即在該引物的3'末端的倒數(shù)第三位堿基處增加一個錯配，結(jié)合適宜的退火溫度，實(shí)現(xiàn)了對群體中特異SNV的靈敏檢測。

目前，多數(shù)基因檢測技術(shù)都是用于個體等位基因分型，尚缺少可以用于群體中特異SNV 篩查的廉價技術(shù)體系。在醫(yī)藥和環(huán)境科學(xué)中，數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）可以對群體中稀有突變等位基因進(jìn)行定量分析。但是，dPCR儀器昂貴，所需試劑耗材成本高，需要事先優(yōu)化流程并研制出相應(yīng)的探針，該方法在植物育種中的應(yīng)用前景尚有待進(jìn)一步研究。深度測序技術(shù)理論上也可以用于混池樣本稀有突變的檢測，但在實(shí)際應(yīng)用中依賴具有生物信息分析技能的專業(yè)人員，而且該方法檢出的假陽性比例較高，對篩查出的混樣需要通過單個樣本的進(jìn)一步分析后確定［32］。因此，建立基于普通PCR 程序、操作簡便快速、對樣品的純度要求較低的混樣SNV 檢測技術(shù)體系，具有廣泛的應(yīng)用前景。本研究將ARMS-PCR 的原理應(yīng)用于群體SNV 的檢測，建立了Pool-ARMS 體系，該方法可以大幅提高檢測效率并縮小成本，為篩選特定SNV 建立了一種高效、低成本的方法，在突變?nèi)后w和堿基編輯植株特定SNV篩查中具有良好的應(yīng)用前景。

本研究針對實(shí)際應(yīng)用場景確定了利用葉片和芽鞘組織篩選特定SNV 個體的技術(shù)體系。對水稻堿基編輯植株這樣的群體，可以通過等量混合葉片樣本提取DNA，開展Pool-AMRS分析，在50株T0植株的混樣中檢出目標(biāo)SNV。對水稻誘變?nèi)后w，特定SNV的比例極低，需要對高達(dá)10萬個M2個體開展檢測［10］。本研究建立的利用芽鞘組織的技術(shù)體系，可以實(shí)現(xiàn)當(dāng)天取樣，當(dāng)天或次日出結(jié)果，從而減少田間種植、取樣這一費(fèi)時費(fèi)力、易錯的環(huán)節(jié)，大幅簡化突變體篩選流程。按照1∶24 的檢出能力，10 萬粒種子僅需建立約4 000 個混樣，進(jìn)行約400 次PCR 和相應(yīng)的瓊脂糖電泳檢測，將工作成本變得可控。

本研究建立的pms1和pms3特異SNV 檢測體系主要用于混池群體的檢測，同時也可以在其他育種方式中應(yīng)用。例如，在水稻的花培育種中，加倍單倍體植株為純合野生型或純合突變型。因此，利用本研究的篩選方法，如果一個植株同時檢測到pms1-SNV 和pms3-SNV，可以推定該材料即為PGMS水稻。

4 結(jié)論

本研究以堿基編輯和誘發(fā)突變的群體為目標(biāo)應(yīng)用場景，以控制光周期敏感性雄性不育（PGMS）水稻SNV為例，優(yōu)化PCR引物和反應(yīng)程序，建立了一種通過混池篩查高效檢出目標(biāo)SNV 的方法Pool-ARMS。利用葉片和芽鞘組織混樣提取DNA 檢測突變的體系，將突變檢出水平分別確定為1∶49和1∶24，實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)、高效、簡便的目標(biāo)，可以運(yùn)用到水稻等農(nóng)作物育種特別是利用誘發(fā)突變和堿基編輯創(chuàng)制種質(zhì)資源中，實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)變異的定向篩選。