蘋果B型細(xì)胞分裂素響應(yīng)因子MdARR11對(duì)干旱脅迫的抗性分析

徐蘇蕊 趙文哲 鞏星遙 李 玲，* 肖 偉，*

（1山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018；2山東果蔬優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，山東 泰安 271018）

細(xì)胞分裂素（cytokinin，CTK）作為植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中不可或缺的經(jīng)典激素之一，在植物中的信號(hào)傳導(dǎo)由雙組分系統(tǒng)（two-component system，TCS）介導(dǎo)［1］。在擬南芥中，該系統(tǒng)包括細(xì)胞分裂素受體組氨酸激酶（Arabidopsis histidine kinase，AHK）、組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移蛋白（Arabidopsis histidine phosphotransfer protein，AHP）以及A 型和B 型反應(yīng)調(diào)節(jié)因子（Arabidopsis response regulator，ARR）［2-3］。目前研究表明，細(xì)胞分裂素的合成、運(yùn)輸及信號(hào)傳導(dǎo)均受干旱脅迫的影響［4］。

B 型ARRs 作為細(xì)胞分裂素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的正響應(yīng)因子，在調(diào)控植物生長(zhǎng)過程中發(fā)揮作用。模式植物擬南芥（Arabidopsisthaliana）突變體arr1、arr2、arr10和arr12中均表現(xiàn)為分生障礙和芽再生能力降低［4-6］。研究表明，三重突變體arr1、10、12對(duì)細(xì)胞分裂素不敏感，且生長(zhǎng)受到明顯抑制［7-8］。同時(shí)arr1、10、12能夠激活WUS的表達(dá)并抑制生長(zhǎng)素生物合成基因YUCCAs（YUCs）的表達(dá)，從而控制芽再生［9］。隨后在其他植物中也證實(shí)了ARRs能夠參與調(diào)控植物生長(zhǎng)，如RR13能在楊樹（PopulusL.）韌皮部特異性表達(dá)，刺激形成層活性的非細(xì)胞自主調(diào)節(jié)［10］。相關(guān)研究表明，ARRs能夠在調(diào)控根系發(fā)育過程中發(fā)揮作用。ARR12能夠與PLT（PLETHORA）發(fā)生拮抗作用，影響擬南芥根系分生組織的發(fā)育［11］。ARR16和ARR17能夠在CTK介導(dǎo)的擬南芥根系促水反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［12］。CcRR5通過與克萊門氏小柑橘（C.clementina）中的CcRR14和蔗糖非發(fā)酵-1-相關(guān)蛋白激酶2（sucrose nonfermenting-1-related protein kinases 2）相關(guān)基因CcSnRK2s相互作用，調(diào)控根的形態(tài)發(fā)生［13］。同時(shí)，ARRs 也能夠在調(diào)控花發(fā)育及配子體中發(fā)揮作用。ARR10、12、18作用于CKI1 的下游以維持雌配子體的極性［14］。MdRRB11能夠正向參與CTK對(duì)蘋果花的誘導(dǎo)［15］。此外，B型ARRs還參與了植物對(duì)非生物脅迫響應(yīng)的應(yīng)答。TaARR1能夠增強(qiáng)小麥（TriticumaestivumL.）對(duì)氮的吸收和同化［16］。B 型細(xì)胞分裂素的響應(yīng)因子ARR1、10、12與有絲分裂原蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase）相關(guān)蛋白MPK3/6 互作，促進(jìn)自身磷酸化從而負(fù)調(diào)控植物耐鹽性［17］。擬南芥arr1、10、12突變體具有明顯的抗旱表型［18］。arr1、11、12三重突變體通過拮抗ABA信號(hào)通路，調(diào)節(jié)植物對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)［19］。但在蘋果中，ARR11如何參與非生物脅迫響應(yīng)仍鮮有報(bào)道。

干旱脅迫是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上面臨的主要逆境脅迫［20］。蘋果作為我國(guó)農(nóng)業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)之一，干旱脅迫通過影響果樹的生長(zhǎng)發(fā)育，降低果實(shí)的產(chǎn)量和品質(zhì)，嚴(yán)重制約我國(guó)蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，增強(qiáng)蘋果對(duì)干旱脅迫的耐受性對(duì)蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。因此，本研究通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增技術(shù)獲得MdARR11基因，對(duì)比MdARR11與擬南芥等8種不同物種ARR11蛋白序列，分析MdARR11基因在嘎拉蘋果不同組織相對(duì)表達(dá)量，進(jìn)一步研究干旱處理（20%PEG6000）下MdARR11基因在嘎拉3 蘋果中的表達(dá)水平。通過遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了過表達(dá)MdARR11蘋果愈傷組織，并對(duì)MdARR11進(jìn)行抗旱性鑒定，旨在進(jìn)一步探索B 型細(xì)胞分裂素響應(yīng)因子MdARR11 參與干旱脅迫響應(yīng)的機(jī)理，從而為篩選抗旱品種提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

組織特異性表達(dá)分析的材料為十年生嘎拉蘋果（MalusdomesticaBorkh.cv.Gala）樹，取自山東農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家蘋果工程技術(shù)中心果樹試驗(yàn)站。干旱處理的蘋果材料為嘎拉3 蘋果組培苗；愈傷材料為王林（Malus domesticaBorkh.Orin）蘋果愈傷組織，均為山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院設(shè)施果樹實(shí)驗(yàn)室保存。遺傳轉(zhuǎn)化過程中使用的大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞、農(nóng)桿菌GV4404菌株均購于上海唯地生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1MdARR11的克隆與進(jìn)化樹的構(gòu)建 從GDR（https：//www.rosaceae.org/）比對(duì)獲得序列號(hào)為MD13G1108300 的基因序列，將其命名為MdARR11。根據(jù)互補(bǔ)脫氧核糖核酸（complementary DNA，cDS）序列，以嘎拉3 蘋果cDNA 為模板，設(shè)計(jì)特異引物（表1），PCR 擴(kuò)增獲得MdARR11基因全長(zhǎng)序列。PCR反應(yīng)體系為25 μL：2×Phanta?Master Mix 12.5 μL，cDNA 2.5 μL，10 μmol·L-1上下游引物各1 μL，蒸餾水補(bǔ)至25 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s；60～65 ℃退火20 s；72 ℃延伸2 min，34 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。對(duì)PCR 結(jié)果進(jìn)行電泳檢測(cè)，然后用DNA 回收試劑盒（北京天根）對(duì)電泳產(chǎn)物進(jìn)行回收。從NCBI數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）中比對(duì)并下載MdARR11的同源基因。使用MEGA 7.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2.2 MdARR11的理化性質(zhì)及蛋白結(jié)構(gòu)分析 使用ExPASy 網(wǎng)站（https：//web.expasy.org/compute_pi/）分析MdARR11的理化性質(zhì)。使用NCBI CD-Search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析MdARR11 的蛋白結(jié)構(gòu)域。使用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html）檢測(cè)MdARR11的順式作用元件。

1.2.3 過表達(dá)載體構(gòu)建和蘋果愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化 將1.2.1 中得到的目的基因連接過表達(dá)載體pBI121：：GFP，轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，PCR 鑒定陽性克隆單菌落，送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV4404，將繼代10 d左右長(zhǎng)勢(shì)良好的蘋果愈傷組織與轉(zhuǎn)化好的農(nóng)桿菌在室溫孵育20 min，用無菌紗布過濾、無菌濾紙吸干愈傷組織表面的菌液，后平鋪在無抗繼代板上，25 ℃黑暗培養(yǎng)3 d。然后將愈傷組織轉(zhuǎn)移至抗性繼代板（繼代培養(yǎng)基+100 mg·L-1卡那霉素+250 mg·L-1頭孢霉素），PCR驗(yàn)證陽性轉(zhuǎn)基因愈傷組織，后將得到的轉(zhuǎn)基因愈傷組織在抗性繼代板繼代2代以上，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4 組織特異性及干旱脅迫試驗(yàn)設(shè)計(jì) 取十年生嘎拉蘋果的根、莖、葉、花、果皮和果肉，所取樣品置于液氮速凍，后儲(chǔ)存在-80 ℃超低溫冰箱備用。取繼代培養(yǎng)1 個(gè)月左右生長(zhǎng)狀態(tài)良好且長(zhǎng)勢(shì)一致的嘎拉3 蘋果組培苗用于生根處理［MS培養(yǎng)基+1 mg·L-1吲哚-3-乙酸（indole-3-acetic acid，IAA），pH 值為5.8～6.0］，使用含有20%聚乙二醇6000（PEG6000）的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液水培處理組培苗，于0、1、3、6、9、12、24 h后取幼嫩葉片置于液氮速凍，提取RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）對(duì)MdARR11進(jìn)行干旱處理的表達(dá)水平分析。將繼代培養(yǎng)15 d左右生長(zhǎng)狀態(tài)良好、長(zhǎng)勢(shì)一致的野生型及過表達(dá)愈傷組織團(tuán)成大小一致的小球。以繼代培養(yǎng)基（MS 培養(yǎng)基+1.5 mg·L-12，4-D+0.4 mg·L-16-BA）作為對(duì)照，處理組在繼代培養(yǎng)基中加入6% PEG6000。25 ℃條件下黑暗培養(yǎng)15 d，取樣拍照。所有材料至少取3個(gè)重復(fù)。

1.2.5 RNA 的提取及qRT-PCR 分析 使用RNAprep Pure 總RNA 提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］提取嘎拉蘋果不同組織、嘎拉3蘋果葉片以及愈傷組織總RNA。

以提取的RNA 為模板，用HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以MdActin（GenBank：CN938024）作為內(nèi)參（表1），使用Ultra SYBR One Step RT-qPCR Kit 試劑盒（江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR 分析，最后采用Ct（2-ΔΔCT）法分析數(shù)據(jù)。

1.2.6 生理指標(biāo)的測(cè)定 用電導(dǎo)率儀測(cè)定蘋果愈傷組織的相對(duì)電導(dǎo)率；采用硫代巴比妥酸法測(cè)量丙二醛（malonaldehyde，MDA）的含量［21］；使用考馬斯亮蘭G-250 法檢測(cè)可溶性蛋白的含量［22］；使用酸性茚三酮法檢測(cè)游離脯氨酸的含量［22］；采用相應(yīng)試劑盒（蘇州科銘生物科技有限公司）分別測(cè)定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase，POD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）的活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)至少進(jìn)行3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)進(jìn)行3 次重復(fù)。采用Excel 2016 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用GraphPad Prism 6.01進(jìn)行作圖，采用SPSS 25對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性和差異性分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 MdARR11的克隆及同源性分析

以蘋果嘎拉3 的cDNA 為模板，設(shè)計(jì)引物（表1）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得一條長(zhǎng)度為2 248 bp 的MdARR11基因片段。

圖1 MdARR11基因PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR production of MdARR11

為研究MdARR11 的親緣關(guān)系，將蘋果MdARR11的蛋白序列與白梨（Pyrusbretschneideri）、擬南芥（Arabidopsisthaliana）、月季（Rosachinensis）、野草莓亞種（Fragariavescasubsp.Vesca）、桃（Prunuspersica）、甜杏（Prunusdulcis）、甜櫻桃（Prunusavium）、野大豆（Glycinesoja）8 種不同物種的ARR11 的蛋白序列以及擬南芥AtARR11同源基因AtARR1、ARR10、ARR12的蛋白序列進(jìn)行比對(duì)分析并構(gòu)建進(jìn)化樹。由圖2 可知，蘋果MdARR11與白梨PbARR11的親緣關(guān)系最近。

圖2 蘋果MdARR11與其同源基因的進(jìn)化樹分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of MdARR11 in apple and its homologous genes

2.2 MdARR11蛋白結(jié)構(gòu)以及啟動(dòng)子順式作用元件分析

用ExPASy 對(duì)MdARR11進(jìn)行理化性質(zhì)分析，結(jié)果顯示MdARR11 編碼613 個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量為68 726.21 kDa，等電點(diǎn)為5.85。對(duì)MdARR11蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)在第19～133 位含有1 個(gè)typeBARR-like 磷酸接收結(jié)構(gòu)域（receiver domain，REC），第198～251 位含有一個(gè)MYB-like DNA 結(jié)合域（圖3），表明MdARR11屬于B 型細(xì)胞分裂素響應(yīng)因子。將MdARR11 與白梨、擬南芥等不同物種的ARR11 氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)進(jìn)一步確定，結(jié)果如圖4所示。

圖3 MdARR11蛋白的保守結(jié)構(gòu)域Fig.3 Conserved domains of MdARR11 protein

圖4 MdARR11與不同物種的ARR11氨基酸序列比對(duì)Fig.4 Comparison of amino acid sequences between MdARR11 and different species of ARR11

使用PlantCARE 分析MdARR11轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1 500 bp 序列中的順式作用元件，發(fā)現(xiàn)該基因啟動(dòng)子包含脫落酸響應(yīng)元件、光響應(yīng)元件，還包括厭氧誘導(dǎo)、低溫響應(yīng)和干旱誘導(dǎo)等脅迫應(yīng)答元件（表2）。推測(cè)MdARR11可能參與植物生長(zhǎng)發(fā)育、干旱脅迫等反應(yīng)。

表2 MdARR11啟動(dòng)子的區(qū)域順式作用元件Table 2 The cis-acting elements in promoters of MdARR11

2.3 MdARR11對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)

為了驗(yàn)證MdARR11是否響應(yīng)干旱脅迫，使用20%PEG6000模擬干旱處理嘎拉3蘋果幼苗。qRT-PCR 分析結(jié)果表明，干旱處理后，MdARR11基因表達(dá)水平受到抑制，呈現(xiàn)先降低后升高趨勢(shì)（圖5）。在處理6 h 后MdARR11基因表達(dá)水平達(dá)到最低值，與0 h 相比差異顯著，隨著PEG 處理時(shí)間的延長(zhǎng)，MdARR11基因表達(dá)水平逐漸恢復(fù)，但仍顯著低于0 h。以上結(jié)果表明MdARR11響應(yīng)干旱脅迫。

圖5 MdARR11對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)模式Fig.5 The expression patterns of MdARR11 under drought stress

2.4 MdARR11表達(dá)模式分析

利用qRT-PCR 分析MdARR11在嘎拉蘋果不同組織中的表達(dá)水平，結(jié)果表明，MdARR11基因在嘎拉蘋果不同組織中均能檢測(cè)到表達(dá)，其中在莖中表達(dá)量最高，在果皮和果肉中的表達(dá)量次之，在根中表達(dá)量最低（圖6）。以上結(jié)果表明，MdARR11可能通過多種器官的協(xié)同作用參與干旱脅迫。

圖6 MdARR11在蘋果不同組織中的表達(dá)分析Fig.6 Expression analysis of MdARR11 in different tissues of apple

2.5 MdARR11轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷組織的鑒定

為了進(jìn)一步探究MdARR11在干旱脅迫中的作用，構(gòu)建過表達(dá)載體MdARR11-pBI121-GFP，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染蘋果愈傷組織，獲得了過表達(dá)MdARR11蘋果愈傷組織。PCR 結(jié)果表明，在過表達(dá)愈傷組織中檢測(cè)到目的條帶（圖7-A），而在野生型愈傷組織中未見目的基因條帶。qRT-PCR 結(jié)果表明，過表達(dá)愈傷組織中MdARR11基因的相對(duì)表達(dá)量與野生型相比差異極顯著，其MdARR11基因的表達(dá)量是野生型愈傷的7.62倍（圖7-B）。以上結(jié)果表明，MdARR11-pBI121-GFP 成功轉(zhuǎn)入愈傷組織中。

圖7 MdARR11轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷DNA鑒定和定量檢驗(yàn)Fig.7 Identification and quantitative testing of MdARR11 in transgenic apple calli

2.6 干旱脅迫下MdARR11 轉(zhuǎn)基因愈傷中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和膜脂過氧化產(chǎn)物含量的變化

選擇繼代培養(yǎng)后10 d生長(zhǎng)狀態(tài)良好且大小一致的轉(zhuǎn)基因和野生型愈傷組織轉(zhuǎn)到新的繼代培養(yǎng)基上作為對(duì)照組，轉(zhuǎn)移到含有6% PEG6000 的繼代培養(yǎng)基上作為處理組，25 ℃下黑暗培養(yǎng)12 d。PEG 模擬干旱脅迫下，轉(zhuǎn)基因和野生型愈傷組織的生長(zhǎng)均受到抑制，其中轉(zhuǎn)基因愈傷組織的生長(zhǎng)勢(shì)明顯弱于野生型（圖8-A），鮮重顯著低于WT（圖8-B）；脯氨酸和可溶性蛋白的積累量極顯著低于WT（圖8-E、F），而相對(duì)電導(dǎo)率和MDA 的含量顯著或極顯著高于WT（圖8-C、D）。上述結(jié)果表明，過表達(dá)MdARR11會(huì)加重干旱脅迫造成的脂膜過氧化損傷，同時(shí)減少滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累。

圖8 干旱脅迫處理WT和MdARR11轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷Fig.8 WT and transgenic MdARR11 apple calli under drought stress

2.7 干旱脅迫下MdARR11 轉(zhuǎn)基因愈傷中抗氧化酶活性的變化

當(dāng)植物受到干旱脅迫時(shí)，體內(nèi)活性氧含量增加，細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷?？寡趸赶到y(tǒng)可以有效清除活性氧并維持其動(dòng)態(tài)平衡，減少活性氧對(duì)細(xì)胞的損傷。本研究為了檢測(cè)干旱脅迫下活性氧的積累情況，測(cè)定了轉(zhuǎn)基因愈傷組織在干旱條件下抗氧化酶活性的變化。結(jié)果表明，干旱處理后抗氧化酶的活性顯著提升，其中過表達(dá)MdARR11愈傷組織中SOD、POD、CAT 的活性極顯著低于野生型（圖9）。以上結(jié)果表明，MdARR11降低了抗氧化酶的活性，減少了對(duì)ROS 的清除，增強(qiáng)了愈傷組織對(duì)干旱脅迫的敏感性。由此可知，MdARR11在蘋果愈傷組織干旱脅迫響應(yīng)中可能起到負(fù)調(diào)節(jié)作用。

圖9 干旱脅迫下WT和MdARR11轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷抗氧化酶活性Fig.9 Activity of antioxidant enzymes in WT and MdARR11 transgenic apple callus under drought

3 討論

細(xì)胞分裂素響應(yīng)因子是細(xì)胞分裂素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要組成部分。研究發(fā)現(xiàn)，ARRs在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育和響應(yīng)非生物脅迫［16-19］中發(fā)揮重要作用。本試驗(yàn)通過克隆MdARR11基因并對(duì)干旱脅迫下MdARR11基因的生物學(xué)功能進(jìn)行了相關(guān)研究。結(jié)果表明，當(dāng)遭受干旱脅迫時(shí)，MdARR11基因的過表達(dá)降低了蘋果愈傷組織的耐旱性。

擬南芥中AtARR11主要通過與同源基因ARR1、ARR12之間形成功能冗余，調(diào)控細(xì)胞分裂素信號(hào)與ABA 信號(hào)產(chǎn)生拮抗，負(fù)向調(diào)控植物的抗旱性［18］。本研究中，進(jìn)化樹分析表明蘋果MdARR11與白梨PbARR11的親緣關(guān)系最近，而與擬南芥AtARR11 親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。這表明，MdARR11 的功能可能與PbARR11 相似。推測(cè)MdARR11可能通過與互作蛋白的相互作用增強(qiáng)其在干旱脅迫中的功能，從而負(fù)調(diào)控植物抗旱性。但關(guān)于MdARR11基因的調(diào)控通路及作用機(jī)制還需進(jìn)一步的研究。

細(xì)胞分裂素響應(yīng)調(diào)節(jié)因子由于C端結(jié)構(gòu)不同可分為A、B、C三類。其中，B型ARRs除了含有信號(hào)接受域外還在C末端含有一個(gè)DNA 結(jié)合域。在嘎啦3蘋果中克隆得到一個(gè)長(zhǎng)度為2 248 bp、編碼613個(gè)氨基酸的基因MdARR11。氨基酸序列對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，MdARR11與PbARR11、AtARR11都含有type-B-REC 結(jié)構(gòu)域，C 端都含有一個(gè)MYB-like的DNA結(jié)合域，表明它們屬于B型細(xì)胞分裂素響應(yīng)因子，這暗示著MdARR11可能在干旱脅迫中同樣發(fā)揮重要作用。

TaRR1在小麥的根和葉中表達(dá)量最高［16］，有助于調(diào)節(jié)氮的吸收和同化作用。VlRR5在葡萄（VitisviniferaL.）的莖中高表達(dá)，有助于提高葡萄坐果率［23］。在本研究中，MdARR11在蘋果不同組織器官中都有表達(dá)，但在莖中表達(dá)量最高，說明MdARR11可能有助于調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)器官發(fā)育。不同物種間組織特異性表達(dá)差異可能是由于小麥為草本植物，莖部不發(fā)達(dá)，根和葉作為重要營(yíng)養(yǎng)器官發(fā)揮作用，而蘋果、葡萄分別為木本、木質(zhì)藤本植物，莖部較發(fā)達(dá)，根莖葉等器官均發(fā)揮重要作用。

干旱是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要環(huán)境因素［20］。在擬南芥中干旱脅迫能夠誘導(dǎo)A 型ARR 基因ARR5、ARR15、ARR22基因的表達(dá)［24］，而B 型ARR 基因ARR1、ARR10、ARR12的表達(dá)量受到干旱脅迫抑制［18］。在本研究中，通過分析MdARR11轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1 500 bp序列中的順式作用元件，發(fā)現(xiàn)該基因啟動(dòng)子包含多個(gè)如ARE、MBS等參與厭氧誘導(dǎo)和干旱脅迫的順式元件，推測(cè)該基因的表達(dá)可能受上述環(huán)境因素的影響。使用20% PEG6000 模擬干旱處理蘋果苗，qRT-PCR 分析結(jié)果表明MdARR11基因的表達(dá)受干旱脅迫抑制，驗(yàn)證了MdARR11響應(yīng)干旱脅迫。干旱脅迫下CKs 的含量下降［25］，參與CKs合成的基因IPT下調(diào)而參與降解的CKX基因上調(diào)［26］，表明CKs 是干旱脅迫的負(fù)調(diào)節(jié)因子。在本研究中，蘋果愈傷組織在6% PEG6000 處理后長(zhǎng)勢(shì)明顯變?nèi)酰渲羞^表達(dá)MdARR11愈傷組織的長(zhǎng)勢(shì)弱于野生型。這些結(jié)果表明，MdARR11可能負(fù)調(diào)控蘋果愈傷組織對(duì)干旱脅迫的抗性。

干旱脅迫能夠引起滲透脅迫、脂膜過氧化，使細(xì)胞膜被破壞，植物不能從外界吸收水分最終導(dǎo)致死亡。植物在干旱脅迫下會(huì)積累一些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)［27］，從而增加胞內(nèi)溶質(zhì)增強(qiáng)細(xì)胞吸水或保水能力［28］。MDA 作為膜脂過氧化產(chǎn)物，能夠直接導(dǎo)致細(xì)胞膜和酶的損傷，其含量高低能夠直接反映細(xì)胞質(zhì)膜過氧化水平。本研究發(fā)現(xiàn)，干旱處理后過表達(dá)MdARR11蘋果愈傷相對(duì)電導(dǎo)率和MDA 的含量均高于野生型；而脯氨酸和可溶性蛋白的積累量均低于野生型。結(jié)果表明，MdARR11可以通過減少滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累和加重細(xì)胞膜的脂膜過氧化程度，從而降低愈傷組織對(duì)干旱脅迫的抗性。

干旱脅迫會(huì)促進(jìn)植物體內(nèi)產(chǎn)生大量ROS，導(dǎo)致植株氧化損傷［20］。當(dāng)植物受到干旱脅迫時(shí)，POD、SOD、CAT 的活性增加，三者協(xié)同作用抑制ROS 產(chǎn)生，從而抑制干旱引起的脂膜過氧化損傷，最終達(dá)到提高植物的抗逆性的目的［29-30］。本研究發(fā)現(xiàn)，干旱處理后SOD、POD、CAT 抗氧化酶的活性顯著高于對(duì)照，在處理組中過表達(dá)MdARR11愈傷組織抗氧化酶的活性明顯低于野生型。結(jié)果表明MdARR11能夠通過降低抗氧化酶的活性，減少對(duì)ROS 的清除從而降低愈傷組織對(duì)干旱脅迫的抗性。

4 結(jié)論

本研究通過克隆MdARR11基因，構(gòu)建過表達(dá)載體并遺傳轉(zhuǎn)化蘋果愈傷組織，在PEG6000 模擬干旱脅迫下研究MdARR11基因功能。結(jié)果表明，MdARR11能夠通過降低脯氨酸和可溶性蛋白的積累量，提高M(jìn)DA 的積累量以及SOD、POD、CAT 抗氧化酶的活性，降低蘋果愈傷組織對(duì)干旱脅迫的耐受性。