基于InDel標(biāo)記的谷子株高QTL定位

杜曉芬 錢(qián)枰勵(lì) 唐楚楚 杜德杰 韓康妮 李禹欣 王智蘭 王 軍，*

（1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)谷子研究所/山西省后稷實(shí)驗(yàn)室，山西 長(zhǎng)治 046011；2山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801；3中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，北京 100193）

谷子（Setariaitalica）具有耗水少、抗旱耐瘠、營(yíng)養(yǎng)豐富均衡、糧飼兼用等特點(diǎn)，是旱作生態(tài)農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展的主栽作物［1］。隨著谷子參考基因組的公布［2-3］，谷子基礎(chǔ)研究在近十年飛速發(fā)展，并逐漸發(fā)展為禾本科作物功能基因組研究的模式作物［4］。

分子標(biāo)記是作物遺傳研究的基礎(chǔ)，其中，插入/缺失（insertion/deletion，InDel）多態(tài)性標(biāo)記是指等位基因的核苷酸序列在個(gè)體間因插入或缺失引起的長(zhǎng)度變異，具有分布廣、密度高、變異穩(wěn)定、重復(fù)性好、性價(jià)比高等優(yōu)點(diǎn)［5］，廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源分析、遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系鑒定、種質(zhì)鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、重要性狀QTL 定位與圖位克隆等方面。趙慶英等［6］對(duì)名優(yōu)谷子品種晉谷21 號(hào)進(jìn)行重測(cè)序，與參考基因組相比發(fā)現(xiàn)了169 037 個(gè)InDel 位點(diǎn)，進(jìn)一步驗(yàn)證了68 個(gè)InDel 位點(diǎn)，并開(kāi)發(fā)了一個(gè)晉谷21 號(hào)的特異InDel 標(biāo)記，為分子標(biāo)記輔助育種提供了分子標(biāo)記資源。Zhang 等［7］基于谷子品種SSR41 的重測(cè)序結(jié)果，開(kāi)發(fā)了156 個(gè)適合瓊脂糖凝膠電泳的InDel 標(biāo)記，并利用多態(tài)性InDel 標(biāo)記對(duì)谷子白葉鞘基因進(jìn)行了圖位克隆。王智蘭等［8］根據(jù)SiGRAS23開(kāi)發(fā)了一個(gè)與株高性狀緊密連鎖的InDel 標(biāo)記D8-1，可用于谷子種質(zhì)資源株高變異的篩選。張碩等［9］利用7 個(gè)InDel 標(biāo)記將谷子白條紋葉基因定位于20.13 Mb 內(nèi)，為該基因的精細(xì)定位和克隆奠定了基礎(chǔ)。由此可見(jiàn)，InDel標(biāo)記在谷子基礎(chǔ)研究方面發(fā)揮了重要的作用。

株高是谷子的重要農(nóng)藝性狀之一，主要通過(guò)調(diào)節(jié)株型和抗倒伏性影響谷子產(chǎn)量。前人遺傳分析結(jié)果表明，谷子株高是典型的數(shù)量性狀，由多基因控制［10］。近十年來(lái)，研究人員定位了許多株高相關(guān)的數(shù)量性狀位點(diǎn)（quantitative trait loci，QTL）［11-16］，這些QTL 在谷子的9條染色體上均有分布。同時(shí)，前人精細(xì)定位和克隆了一些候選基因，例如編碼DELLA蛋白的SiD1和編碼細(xì)胞色素P450 蛋白的SiD2［17-18］。盡管如此，相比水稻、小麥等主要農(nóng)作物，谷子株高QTL 或基因的鑒定仍相對(duì)較少，這嚴(yán)重制約了谷子株高遺傳機(jī)理研究的進(jìn)展。

鑒于此，本研究對(duì)2 個(gè)株高存在極顯著差異的谷子品種（衡谷12號(hào)和長(zhǎng)農(nóng)35號(hào)）進(jìn)行深度重測(cè)序，比較兩者之間的InDel差異，開(kāi)發(fā)InDel標(biāo)記，并利用多態(tài)性InDel標(biāo)記掃描“衡谷12號(hào)×長(zhǎng)農(nóng)35號(hào)” F2分離群體，構(gòu)建遺傳連鎖圖譜、定位株高QTL，進(jìn)一步在重組自交系群體中驗(yàn)證株高QTL，并對(duì)候選基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。本研究旨在為谷子基礎(chǔ)研究提供一套好用的InDel標(biāo)記，同時(shí)為株高基因的克隆奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及性狀調(diào)查

本研究中，用于株高QTL 定位的雜交組合的母本為衡谷12 號(hào)，由河北農(nóng)林科學(xué)院旱作農(nóng)業(yè)研究所選育，具有矮稈、極早熟、分蘗性強(qiáng)等特點(diǎn)［19］，父本長(zhǎng)農(nóng)35 號(hào)由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)谷子研究所選育，屬于高稈、晚熟、無(wú)分蘗品種［20］。2016年，將衡谷12號(hào)和長(zhǎng)農(nóng)35號(hào)進(jìn)行雜交；2017年，鑒定F1植株；2018年，將F1自交獲得F2分離群體，在谷子成熟期調(diào)查株高，其中，雙親調(diào)查5株，取平均值作為性狀值，F(xiàn)2子代逐株掛牌調(diào)查株高。

采用單粒傳法，將F2分離群體繁殖到F6代。2022年，將雙親和重組自交系群體（recombinant inbred line，RIL，F(xiàn)6代共283個(gè)株系）種植2行，行長(zhǎng)2 m，株距0.33 m。在谷子成熟期調(diào)查株高，每個(gè)株系調(diào)查5株，以平均值作為性狀值。所有材料均種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)谷子研究所試驗(yàn)田，田間管理、水肥等條件一致。

1.2 DNA提取

在谷子拔節(jié)期，分別采集新出葉片，液氮速凍后置于-80 ℃?zhèn)溆?。采用改良的十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）法提取總DNA。SDS提取液配制：1 mol·L-1Tris-HCl（pH 值8.5）100 mL，0.5 mol·L-1乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）（pH 值8.0）100 mL，5 mol·L-1NaCl 20 mL，20% SDS 100 mL，加去離子水定容至1 L。提取步驟為：將葉片放入研缽中加入液氮研磨成粉狀，轉(zhuǎn)移至2.0 mL 離心管中；加入SDS 提取液750 μL，混勻后置于65 ℃水浴鍋中1 h；加入750 μL苯酚/氯仿（1∶1），混勻15 min后，4 ℃，12 000 r·min-1離心15 min；吸取上清液600 μL，加等體積氯仿，混勻15 min 后，4 ℃，12 000 r·min-1離心15 min；吸取上清液450 μL，加0.6 倍體積的異丙醇混勻，靜置30 min；4 ℃，12 000 r·min-1離心10 min 后棄上清，用70%乙醇清洗2 次；室溫干燥后加入100 μL 的Tris-EDTA（TE）緩沖液備用。

1.3 RNA提取和cDNA合成

分別在谷子孕穗期和開(kāi)花期，對(duì)衡谷12 號(hào)和長(zhǎng)農(nóng)35 號(hào)的倒二莖進(jìn)行取樣，液氮速凍研磨，參照RNAiso Plus 試劑（9108，北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）說(shuō)明書(shū)提取總RNA，參照PrimeScript Ⅱ 1st strand cDNA synthesis kit 試劑盒（6210A，北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）說(shuō)明書(shū)合成cDNA。

1.4 重測(cè)序

在苗期，分別隨機(jī)采集衡谷12號(hào)和長(zhǎng)農(nóng)35號(hào)的葉片，采用高效植物基因組DNA 提取試劑盒（DP350，北京天根生化科技有限公司）提取DNA，送至北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行重測(cè)序，重測(cè)序按照Illumina公司（美國(guó)）提供的標(biāo)準(zhǔn)步驟執(zhí)行，簡(jiǎn)要流程為：對(duì)提取的基因組DNA 進(jìn)行質(zhì)檢，DNA 檢測(cè)合格后用超聲波將DNA片段化；對(duì)片段化的DNA進(jìn)行末端修復(fù)、3'端加A和連接測(cè)序接頭；用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)片段大小進(jìn)行選擇，并進(jìn)行PCR 擴(kuò)增形成測(cè)序文庫(kù)；對(duì)測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫(kù)用Hiseq 2500 測(cè)序儀（Illumina公司，美國(guó)）進(jìn)行測(cè)序。

1.5 基因組變異檢測(cè)

測(cè)序得到的原始序列（raw reads）進(jìn)行過(guò)濾，獲得高質(zhì)量的序列（clean reads），過(guò)濾的標(biāo)準(zhǔn)為：去除帶接頭的reads；過(guò)濾N 含量超過(guò)10%的reads；去除質(zhì)量值低于10、堿基超過(guò)50%的reads。利用Burrows-Wheeler Transform 軟件［21］將獲得的clean reads 比對(duì)到谷子參考基因組豫谷1號(hào)上（Setariaitalicav2.2，https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#%21info？alias=Org_Sitalica_er）。使用Picard（https：//sourceforge.net/projects/picard/）去掉重復(fù)，Genome Analysis ToolKit 軟件［22］用于檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP）和InDel，并用SnpEff 軟件［23］對(duì)檢測(cè)到的SNP 和InDel 進(jìn)行注釋，Breakdancer（http：//breakdancer.sourceforge.net/）用于檢測(cè)結(jié)構(gòu)變異（structral variation，SV），對(duì)于檢測(cè)到的SV，通過(guò)比對(duì)變異位點(diǎn)在參考基因組上的位置對(duì)其進(jìn)行注釋。

1.6 InDel標(biāo)記開(kāi)發(fā)和多態(tài)性鑒定

比較衡谷12號(hào)和長(zhǎng)農(nóng)35號(hào)差異InDel位點(diǎn)，選擇衡谷12號(hào)和長(zhǎng)農(nóng)35號(hào)插入或缺失堿基數(shù)量差異大于等于3 bp且間隔大于5 kb的位點(diǎn)作為引物設(shè)計(jì)的目標(biāo)位點(diǎn)。分別提取目標(biāo)位點(diǎn)上下游側(cè)翼序列150 bp，整理成Fasta格式，利用BatchPrimer3 v2.0（https：//probes.pw.usda.gov/batchprimer3/）批量設(shè)計(jì)引物，產(chǎn)物大小設(shè)置為100～300 bp，引物由南京金斯瑞生物科技股份有限公司合成。

PCR 反應(yīng)體系為10 μL：10×PCR buffer 1.0 μL，2 μmol·L-1上下游引物各1 μL，rTap DNA聚合酶0.1 μL，2.5 mmol·L-1dNTP 0.8 μL，模板DNA 1.0 μL，滅菌水5.1 μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物利用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，經(jīng)硝酸銀染色后，拍照記錄。

1.7 遺傳圖譜構(gòu)建和QTL定位

選擇能夠良好分型的多態(tài)性InDel標(biāo)記，分別掃描F2群體（120 個(gè)單株）和RIL 群體（283 個(gè)株系），對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，其中與衡谷12號(hào)帶型一致的記為“A”，與長(zhǎng)農(nóng)35 號(hào)帶型一致的記為“B”，雜合帶型記為“H”，條帶缺失時(shí)記為“-”。采用JoinMap 4［24］構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，選擇回歸算法（regression mapping）和Kosamb，s函數(shù)，其他參數(shù)為默認(rèn)參數(shù)。采用WinQTLCart 2.5［25］對(duì)株高進(jìn)行QTL 定位，使用復(fù)合區(qū)間作圖（composite interval mapping，CIM）法，在P＜0.05 條件下，進(jìn)行1 000 次排列測(cè)驗(yàn)（permutation test）確定QTL 的似然比的自然對(duì)數(shù)（likelihood of odd，LOD）閾值。QTL命名規(guī)則按照q+性狀簡(jiǎn)稱+染色體進(jìn)行命名，當(dāng)同一條染色體出現(xiàn)多個(gè)QTL，按照-1、-2、-3的順序命名。

1.8 候選基因預(yù)測(cè)和分析

利用Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/），以豫谷1 號(hào)為參考基因組，對(duì)定位區(qū)間的基因及其功能注釋進(jìn)行分析。同時(shí)根據(jù)衡谷12 號(hào)和長(zhǎng)農(nóng)35 號(hào)重測(cè)序數(shù)據(jù)，分析定位區(qū)間內(nèi)編碼區(qū)發(fā)生突變的基因，預(yù)測(cè)候選基因。對(duì)預(yù)測(cè)的候選基因進(jìn)行克隆測(cè)序，采用DNAMAN 7 軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析。參考王智蘭等［8］的方法進(jìn)行候選基因的熒光實(shí)時(shí)定量表達(dá)分析。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 17 分析群體性狀的最大值、最小值、平均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差、峰度、偏度以及進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。利用GraphPad Prism 5進(jìn)行頻率分布分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 衡谷12號(hào)和長(zhǎng)農(nóng)35號(hào)重測(cè)序及變異分析

衡谷12 號(hào)和長(zhǎng)農(nóng)35 號(hào)的clean data 為31.82 Gbp，Q30 達(dá)到88.38%，兩個(gè)樣品與參考基因組平均比對(duì)率為98.63%，平均覆蓋深度為34×，其中衡谷12 號(hào)的覆蓋深度為30×，長(zhǎng)農(nóng)35 號(hào)的覆蓋深度為38×。變異檢測(cè)結(jié)果表明，衡谷12 號(hào)中單核苷酸多態(tài)性（SNP）、插入/缺失（InDel）和結(jié)構(gòu)變異（SV）數(shù)量分別為524 486、103 442 和22 295 個(gè)，長(zhǎng)農(nóng)35 號(hào)中SNP、InDel 和SV 數(shù)量分別為1 131 571、196 477 和24 509 個(gè)（圖1-A），比較而言，檢測(cè)到的SNP 數(shù)量最多，SV 數(shù)量最少，且長(zhǎng)農(nóng)35 號(hào)中這三種變異類(lèi)型都高于衡谷12 號(hào)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)農(nóng)35 號(hào)和衡谷12 號(hào)在相同位點(diǎn)共同檢測(cè)到SNP 變異位點(diǎn)和InDel 變異位點(diǎn)分別有259 259 和55 224 個(gè)（圖1-E、F）。

SNP 變異類(lèi)型分為堿基轉(zhuǎn)換（T/A 和C/G）和堿基顛換（A/C、G/T、C/T 和G/A），衡谷12 號(hào)中堿基顛換的數(shù)量占總變異類(lèi)型的87.7%，長(zhǎng)農(nóng)35 號(hào)中堿基顛換的數(shù)量占總變異類(lèi)型的88%，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)農(nóng)35號(hào)中的堿基轉(zhuǎn)換和堿基顛換的數(shù)量均高于衡谷12號(hào)（圖1-B）。

SV 變異類(lèi)型分為大片段插入（insertion，INS）、大片段缺失（deletion，DEL）、反轉(zhuǎn)（inversion，INV）、染色體內(nèi)易位（intra-chromosomal translocation，ITX）和染色體間易位（inter-chromosomal translocation，CTX）等，衡谷12 號(hào)和長(zhǎng)農(nóng)35 號(hào)的變異類(lèi)型主要是INS 和DEL，分別占總變異類(lèi)型的84.76%和79.17%（圖1-C）。

InDel變異類(lèi)型分為小片段插入（INS）和小片段缺失（DEL），分析表明，在衡谷12號(hào)和長(zhǎng)農(nóng)35號(hào)中，主要發(fā)生均為1 bp的INS或DEL，同時(shí)發(fā)現(xiàn)大于等于39 bp且小于等于50 bp的INS數(shù)量高于DEL數(shù)量（圖1-D）。

2.2 InDel標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和多態(tài)性分析

比對(duì)衡谷12 號(hào)和長(zhǎng)農(nóng)35 號(hào)中InDel 變異位點(diǎn)，選擇兩者差異大于等于3 bp 且間隔大于5 kb 的位點(diǎn)，最后篩選了3 961 個(gè)位點(diǎn)，并設(shè)計(jì)引物。首先，篩選在雙親間具有多態(tài)性的標(biāo)記，初步獲得1 392 對(duì)多態(tài)性標(biāo)記，多態(tài)性率為35.14%，其中第3 染色體的多態(tài)性標(biāo)記最多，第4 染色體的多態(tài)性標(biāo)記最少（圖2-A）。然后，用F2群體的部分單株進(jìn)一步篩選，獲得591 個(gè)穩(wěn)定性好，且在后代群體中能夠良好分型的多態(tài)性標(biāo)記（圖2-B），為下一步遺傳圖譜構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。

圖2 InDel標(biāo)記的多態(tài)性分析Fig.2 Development and polymorphism analysis of InDel markers

2.3 遺傳圖譜構(gòu)建及F2群體株高QTL定位

利用591個(gè)InDel標(biāo)記對(duì)包含120個(gè)單株的F2群體進(jìn)行基因分型，采用JoinMap 4 進(jìn)行連鎖分析，最后獲得一張包括467 個(gè)InDel 標(biāo)記的谷子遺傳連鎖圖譜（電子附圖1），該圖譜總圖距448.45 cM，平均圖距0.96 cM，其中第4 和第8 染色體標(biāo)記數(shù)量最少（16 個(gè)），第3 染色體標(biāo)記數(shù)量最多（160 個(gè)），第1 染色體圖距最短（9.67 cM），第9染色體圖距最長(zhǎng)（105.22 cM）（表1）。

表1 “衡谷12號(hào)×長(zhǎng)農(nóng)35號(hào)” F2群體遺傳連鎖圖譜信息Table 1 Characteristics of the genetic map in F2 population of ‘Henggu12 × Changnong35’

對(duì)雙親及120 個(gè)F2子代株高進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)雙親之間差異極顯著（P＜0.01，圖3-A），株高在F2群體中呈雙向超親分離（表2），頻率分布結(jié)果顯示，株高呈雙峰分布（圖3-A）。

表2 雙親及群體株高統(tǒng)計(jì)分析Table 2 Phenotypic analysis of plant height in the parents，F(xiàn)2 population and RIL population /cm

圖3 “衡谷12號(hào)×長(zhǎng)農(nóng)35號(hào)” F2群體和RIL群體株高頻率分布直方圖Fig.3 Histogram of frequency distribution of plant height in F2 population and RIL population of ‘Henggu 12×Changnong 35’

利用WinQTLCart 2.5 對(duì)F2群體的株高進(jìn)行QTL定位，共檢測(cè)到4個(gè)QTL 位點(diǎn)，除qPH5-1外，加性效應(yīng)均為負(fù)值，說(shuō)明來(lái)自父本長(zhǎng)農(nóng)35 號(hào)的等位位點(diǎn)對(duì)株高貢獻(xiàn)率大。在4 個(gè)QTL 中，第5 染色體檢測(cè)到2 個(gè)QTL，分別為qPH5-1和qPH5-2，其中qPH5-1可解釋表型變異率最大，為8.41%；第9 染色體檢測(cè)到2 個(gè)QTL，分別為qPH9-1和qPH9-2，其中qPH9-2可解釋表型變異率為16.47%，為主效QTL（表3）。

表3 “衡谷12號(hào)×長(zhǎng)農(nóng)35號(hào)” F2群體株高QTL定位Table 3 Putative QTL detected for plant height in F2 population of ‘Henggu12×Changnong35’

2.4 RIL群體株高QTL的驗(yàn)證

首先，對(duì)雙親和283 個(gè)株系的株高進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)株高在RIL 群體中呈單向超親分離，變異范圍比F2群體小，但是變異系數(shù)比F2群體大（表2）。頻率分布結(jié)果顯示，與F2群體的結(jié)果相似，株高呈雙峰分布（圖3-B）。然后在RIL 群體中對(duì)F2群體中鑒定的效應(yīng)較大的QTL（qPH5-1和qPH9-2）進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明，在RIL 群體中，僅檢測(cè)到qPH9-2，LOD 值為93.6，加性效應(yīng)為-46.15，解釋表型貢獻(xiàn)率達(dá)91.06%（表4）。

表4 “衡谷12號(hào)×長(zhǎng)農(nóng)35號(hào)”重組自交系群體株高QTL定位Table 4 Putative QTL detected for plant height in RIL population of ‘Henggu12 × Changnong35’

2.5 qPH9-2候選基因分析

利用Phytozome 數(shù)據(jù)庫(kù)分析qPH9-2定位區(qū)間（2 776 961～7 257 031 bp），該區(qū)間包含706 個(gè)基因，分析衡谷12號(hào)和長(zhǎng)農(nóng)35號(hào)在該區(qū)間的重測(cè)序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)70個(gè)基因在編碼區(qū)、5'UTR和3'UTR發(fā)生突變。其中，27 個(gè)基因由于SNP 變異發(fā)生非同義突變，4 個(gè)基因由于InDel 變異發(fā)生移碼突變（電子附表1）。分析發(fā)生非同義突變的基因功能注釋，發(fā)現(xiàn)編碼bHLH 轉(zhuǎn)錄因子的基因Seita.9G080400，在其5'UTR 處和編碼區(qū)分別存在2 處SNP。由于轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用，因此對(duì)其進(jìn)行了重點(diǎn)分析。

根據(jù)參考基因組Seita.9G080400的基因組序列，設(shè)計(jì)特異引物（電子附表2），分別對(duì)衡谷12 號(hào)和長(zhǎng)農(nóng)35 號(hào)進(jìn)行克隆測(cè)序，測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證了其5'UTR 的2 處SNP（SNP1和SNP2）和第一外顯子的2處SNP（SNP3和SNP4），同時(shí)還發(fā)現(xiàn)在其第一內(nèi)含子、第二內(nèi)含子和第三內(nèi)含子分別存在1 處SNP（SNP5、SNP6 和SNP7）（電子附圖2）。外顯子中的SNP3在衡谷12中編碼纈氨酸（V），在長(zhǎng)農(nóng)35號(hào)中編碼丙氨酸（A）；外顯子中的SNP4在衡谷12 中編碼組氨酸（H），在長(zhǎng)農(nóng)35 號(hào)中編碼天冬氨酸（D）（圖4-A）。表達(dá)分析結(jié)果表明，孕穗期莖中，Seita.9G080400相對(duì)表達(dá)量在衡谷12號(hào)中是長(zhǎng)農(nóng)35號(hào)的10倍；開(kāi)花期莖中，Seita.9G080400相對(duì)表達(dá)量在衡谷12號(hào)中是長(zhǎng)農(nóng)35號(hào)的42倍（圖4-B）。

圖4 Seita.9G080400序列分析和表達(dá)分析Fig.4 Sequences and expression level analysis of Seita.9G080400 between Henggu12 and Changnong35

3 討論

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，基于重測(cè)序技術(shù)，在全基因組水平發(fā)掘的分子標(biāo)記在作物中得到廣泛應(yīng)用。大量研究表明，InDel標(biāo)記是植物中的第二大類(lèi)多態(tài)性高的標(biāo)記，具有準(zhǔn)確性高、共顯性、易于基因分型等諸多優(yōu)點(diǎn)［5］，已在遺傳圖譜構(gòu)建、重要性狀QTL定位、種質(zhì)資源分析與鑒定等方面廣泛應(yīng)用。谷子中相關(guān)文獻(xiàn)證實(shí)，InDel標(biāo)記數(shù)量?jī)H次于SNP標(biāo)記［6-7，26-28］。例如，Li等［27］對(duì)312份谷子種質(zhì)進(jìn)行重測(cè)序，共鑒定了3 027 706 個(gè)SNP 和256 826 個(gè)InDel，Bai 等［28］在農(nóng)家種十里香中檢測(cè)到915 434 個(gè)SNP 和28 546 個(gè)InDel。本研究中，衡谷12 號(hào)中的SNP 和InDel 分別為524 486和103 442個(gè)，長(zhǎng)農(nóng)35號(hào)中的SNP和InDel分別為1 131 571和196 477 個(gè)。由于測(cè)序深度和材料的不同，導(dǎo)致檢測(cè)到的SNP 和InDel 數(shù)量有所不同。本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了InDel 標(biāo)記是一類(lèi)具有豐富多態(tài)性的標(biāo)記，此外，本研究鑒定的大量InDel位點(diǎn)為開(kāi)發(fā)標(biāo)記提供了分子基礎(chǔ)。

目前已有研究中，主要利用簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）標(biāo)記［29-31］進(jìn)行種質(zhì)資源群體結(jié)構(gòu)分析［32］、圖位克?。?3］、優(yōu)異等位變異檢測(cè)［34］，而InDel標(biāo)記應(yīng)用的相關(guān)報(bào)道較少。盡管谷子中InDel變異豐富，但對(duì)其進(jìn)行開(kāi)發(fā)并驗(yàn)證的標(biāo)記數(shù)量同樣相對(duì)較少，谷子中可用的InDel 標(biāo)記資源有限，因此在全基因組水平開(kāi)發(fā)InDel 標(biāo)記非常必要。趙慶英等［6］在晉谷21 中開(kāi)發(fā)驗(yàn)證了68 個(gè)InDel 標(biāo)記，Zhang 等［7］在SSR41中開(kāi)發(fā)驗(yàn)證了156個(gè)InDel標(biāo)記。本研究選擇了3 961 個(gè)在衡谷12 號(hào)和長(zhǎng)農(nóng)35 號(hào)之間有差異的InDel位點(diǎn)，經(jīng)過(guò)初步篩選，獲得了1 392 個(gè)多態(tài)性InDel 標(biāo)記，多態(tài)性率為35.14%。與前人研究結(jié)果相比，本研究驗(yàn)證的InDel標(biāo)記數(shù)量較多，并能夠有效應(yīng)用于株高QTL定位。

數(shù)量性狀QTL 定位結(jié)果易受定位群體和環(huán)境條件影響，盡管初級(jí)定位群體（F2、F2：3和DH）表型數(shù)據(jù)不能重復(fù)，但是一些大效應(yīng)的QTL 還是會(huì)被準(zhǔn)確定位。例如，水稻“綠色”基因DEP1的克隆，最初利用DH 群體檢測(cè)到控制水稻直立穗型的主效QTL（qPE9-1，貢獻(xiàn)率為41.72%）［35］，隨后利用2 個(gè)F2群體及1 521 個(gè)F2子代將其精細(xì)定位并確定候選基因DEP1［36］。本研究利用開(kāi)發(fā)的多態(tài)性InDel 標(biāo)記，構(gòu)建了“衡谷12 號(hào)×長(zhǎng)農(nóng)35 號(hào)” F2群體的遺傳連鎖圖譜，初步定位了4 個(gè)株高QTL，并對(duì)其中2 個(gè)效應(yīng)值較大的QTL 在RIL 群體中進(jìn)行了驗(yàn)證，相比F2群體的定位結(jié)果，qPH9-2在RIL 群體中能重復(fù)檢測(cè)到，貢獻(xiàn)率達(dá)91.06%，且物理區(qū)間（2 776 961～7 257 031 bp）更小。前人在谷子第9染色體上相同區(qū)間也檢測(cè)到株高QTL（H9a：3 452 395～9 964 754 bp），貢獻(xiàn)率為7.6%～15.5%［12］，暗示該區(qū)間存在控制株高的主效QTL。

bHLH 是植物中重要的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育與形態(tài)建成。研究表明，小麥TabHLH123調(diào)控小麥根系發(fā)育，TabHLH123-6B與根重、千粒重和株高相關(guān)［37］，TabHLH123-6A與根系構(gòu)型相關(guān)［38］。本研究中，Seita.9G080400編碼bHLH 轉(zhuǎn)錄因子，測(cè)序結(jié)果表明，在衡谷12 號(hào)和長(zhǎng)農(nóng)35 號(hào)中，其第一外顯子有2處SNP，導(dǎo)致氨基酸發(fā)生非同義突變。其中，SNP3在衡谷12 號(hào)中編碼纈氨酸，長(zhǎng)農(nóng)35 號(hào)中編碼丙氨酸，這兩種氨基酸都為疏水性氨基酸；SNP4 在衡谷12 號(hào)中編碼組氨酸，長(zhǎng)農(nóng)35 號(hào)中編碼天冬氨酸，由堿性氨基酸變?yōu)樗嵝园被?，這些氨基酸的改變是否影響蛋白的功能，需要進(jìn)一步驗(yàn)證。另外，在不同發(fā)育時(shí)期的莖中，Seita.9G080400相對(duì)表達(dá)量在衡谷12 號(hào)和長(zhǎng)農(nóng)35號(hào)之間存在極顯著差異。綜合以上結(jié)果，推測(cè)Seita.9G080400可能是控制株高的關(guān)鍵候選基因，但是仍然需要通過(guò)進(jìn)一步精細(xì)定位和功能鑒定進(jìn)行驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究利用2 個(gè)谷子品種的重測(cè)序數(shù)據(jù)，在全基因組水平開(kāi)發(fā)了1 392 個(gè)分布于谷子9 條染色體的InDel 標(biāo)記。利用多態(tài)性InDel 標(biāo)記，構(gòu)建了一張包含467 個(gè)InDel 標(biāo)記的谷子遺傳連鎖圖譜，定位了1 個(gè)控制株高的主效QTL，預(yù)測(cè)了1 個(gè)關(guān)鍵候選基因，驗(yàn)證了InDel標(biāo)記的有效性和應(yīng)用性，為今后谷子種質(zhì)資源鑒定、群體結(jié)構(gòu)分析和親緣關(guān)系分析等提供了良好的分子標(biāo)記資源。

電子附表1 突變基因的信息Electronic Table S1 Information of mutant genes

電子附圖1 “衡谷12號(hào)×長(zhǎng)農(nóng)35號(hào)”F2群體InDel標(biāo)記連鎖遺傳圖Electronic Fig.S1 The genetic linkage map constructed using 467 InDel markers in F2 population derived from ‘Henggu12 ×Changnong35’