優(yōu)質同源四倍體菜心新材料的創(chuàng)制及特性分析

荊禹銘 嵇樂樂 李孟杰 張彥文 侯喜林 李 英 劉照坤 劉同坤，*

（1南京農業(yè)大學作物遺傳與種質創(chuàng)新全國重點實驗室/農業(yè)農村部華東地區(qū)園藝作物生物學與種質創(chuàng)制重點實驗室/園藝作物種質創(chuàng)新與利用教育部工程研究中心，江蘇 南京 210095；2蘇州市農業(yè)科學院，江蘇 蘇州 215000）

不結球白菜［Brassicacampestris（syn.Brassicarapa）ssp.chinensis］，原產中國，古名“菘”，又稱小白菜、青菜、青梗菜［1］，在長江中下游地區(qū)占蔬菜總復種面積的30%～40%［2］。不結球白菜主要分為普通白菜、烏塌菜、菜心、菜薹等6個變種，其中菜心又稱廣東菜、菜花、薹心菜等［3］，以嫩葉和嫩薹為主要食用部分。近年來，菜心的產業(yè)化布局快速發(fā)展，菜心逐漸成為一種全國性的大宗蔬菜［4］。

蔬菜多倍體種質創(chuàng)制是培育優(yōu)質高產蔬菜新品種的重要途徑，為蔬菜性狀的遺傳改良與種質創(chuàng)新提供了新思路［5］。多倍體植物由于染色體組加倍，往往具有器官巨大、可孕性低、生活能力強、內含物多、抗逆性強、耐貯運等特點［6］。而多倍體育種則是指利用人工處理使植物染色體組加倍從而獲得多倍體材料，由于其誘導方法較簡單，育出的品種經濟價值高，還可有效克服遠緣雜交不親和等特點，因此應用較為廣泛［7］。目前，多倍體誘導方式主要分為物理誘導、化學誘導、生物誘導三類，物理誘導主要有電離輻射、改變溫度等方式，但由于其操作較為復雜，誘導率較低，且嵌合體多，會對植株有較大的生理損傷等缺點［8］，目前應用較少；而化學誘導應用最為廣泛，主要采用安磺靈、二甲戊靈、甲基胺草磷以及秋水仙素等化學誘變劑處理，通過與分裂細胞的微管蛋白結合，使細胞有絲分裂中斷，從而實現細胞的染色體加倍［9-10］。其中，使用秋水仙素誘導多倍體具有誘導率高、對植株傷害小、處理方式較為簡便等優(yōu)點，被廣泛應用于大蒜［11］、月季［12］、黃瓜［13］、西瓜［14］等育種。

菜心因其品質脆嫩、營養(yǎng)豐富、適應性強、生長期短、可周年供應等特點，深受廣大消費者和生產者的喜愛［15］。但目前菜心的生產種植仍面臨著多種問題，如推廣品種在蔬菜品質性狀與營養(yǎng)性狀方面無法滿足生產和市場的需求，長期種植單一品種導致出現品種退化、品質下降的現象，開展育種工作時優(yōu)質遺傳資源不夠豐富等［16］。因此，創(chuàng)制具有優(yōu)良性狀的菜心材料，豐富菜心種質資源，對菜心產業(yè)的發(fā)展具有重要意義。目前，利用秋水仙素處理誘導已經在不結球白菜蘇州青［17］、矮腳黃［18］等品種上取得成功，但鮮見應用于菜心。本研究采用秋水仙素誘導創(chuàng)制四倍體菜心新種質，以期獲得營養(yǎng)豐富、優(yōu)質豐產的同源四倍體菜心新材料，旨在為培育優(yōu)質、高產的菜心提供新材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用材料為菜心LCX017（2n=2x=20），由南京農業(yè)大學園藝學院白菜系統生物學實驗室提供。試驗于2021年9月—2023年5月在南京農業(yè)大學白馬教學科研基地進行。

1.2 四倍體菜心LCX017誘導方法

參考趙建華等［19］的方法，待二倍體幼苗子葉完全伸展后，用0.2%（W/V）的秋水仙素溶液點滴幼苗子葉生長點，于每天9∶00 和17∶00 各處理1 次，共處理5次，每次20 μL，對照組用蒸餾水處理。

1.3 多倍體的鑒定方法

1.3.1 形態(tài)學鑒定 以同期生長的二倍體菜心LCX017植株作為對照，對誘變植株的形態(tài)進行初步的肉眼鑒定，觀察誘變植株的株型、生長勢、開展度、葉片形狀、葉色、花器官形態(tài)等形態(tài)學變化，若有明顯差異，則鑒定為疑似多倍體植株。

1.3.2 解剖學鑒定 選取同時期的二倍體植株以及疑似四倍體植株的完全開展葉片，避開葉脈部分用膠帶撕取葉片部分下表皮，用刀片去除或用流水沖掉多余的葉肉細胞，置于光學顯微鏡下觀察二者氣孔大小及密度是否有差異；花粉鑒定時，在晴天上午選取同花期下二倍體和疑似四倍體植株花粉，將其均勻涂抹在載玻片上，置于光學顯微鏡下觀察二者有無形態(tài)及大小差異。

1.3.3 細胞學鑒定 參考王煒等［20］的方法，將疑似四倍體植株的種子置于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中催芽，待根長1～1.5 cm時切取根部置于4 ℃、0.002 mol·L-1的8-羥基喹啉溶液中浸泡3～3.5 h，蒸餾水洗凈后，加入卡諾固定液于4 ℃冰箱固定9 h 左右，洗凈，加入1 mol·L-1鹽酸于60 ℃下水浴鍋中解離4 min，洗凈，切取根尖1～2 mm，用改良石碳酸復紅染液染色7 min，制片，在DM6B正置熒光顯微鏡（Leica，德國）下觀察拍照。

1.3.4 流式細胞儀倍性分析 參考羅慶等［21］的方法，選取二倍體以及疑似四倍體植株的新鮮幼嫩葉片，避開葉脈，稱取約0.1 g 葉片，每組設置3 個重復，平鋪在-20 ℃預冷過的培養(yǎng)皿上，加入4 ℃環(huán)境下事先配置好的解離液1～2 mL［5 mmol·L-14-羥乙基哌嗪乙磺酸（hepesfreeacid，HEPES）、50 mmol·L-1KCl、10 mmol·L-1MgSO4·7H2O、0.25%（V/V）Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚，ethylancp）、1% 聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）配制而成，調節(jié)解離液pH 值至8.0，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫?，然后用預冷過的刀片迅速切碎，隨后用500目紗布過濾至1.5 mL離心管中，向離心管中加入35 μL 的碘化丙啶染色液（propidium iodide，PI），再加入10 mg·mL-1RNase 10 μL。充分混勻，靜置于冰上避光染色15 min后，使用CytoFLEX 流式細胞儀（Beckman Coulter，美國）檢測其DNA含量。

1.4 二、四倍體菜心LCX017農藝性狀統計

將被鑒定為同源四倍體的M0代菜心植株蕾期及花期套袋自交，單株收種，將M1代種子與對照二倍體種子同期播種定植。隨機選取長勢良好、無病蟲害的二、四倍體植株各10株，對其株高、開展度、葉片數、葉長、葉寬、十葉厚、葉柄長、葉柄寬、葉柄厚等農藝性狀進行測量與統計。

1.5 二、四倍體菜心LCX017營養(yǎng)品質測定

隨機選取生長時期相同、長勢良好的二、四倍體植株各3 株，避開葉脈，取每株植物較為靠近生長點的葉片，測量可溶性糖、可溶性蛋白、纖維素、葉綠素、有機酸以及硝態(tài)氮含量等營養(yǎng)指標?？扇苄蕴呛繙y定采用蒽酮比色法，使用植物可溶性糖含量檢測試劑盒（BC-0030，北京索萊寶科技有限公司）；可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍G-250 染色法，使用Bradford法蛋白濃度測定試劑盒（PC0010，北京索萊寶科技有限公司）；纖維素含量測定使用纖維素（cellulose，CLL）含量檢測試劑盒（BC4208，北京索萊寶科技有限公司）；葉綠素含量采用丙酮乙醇提取法測定；有機酸含量測定采用維生素C（vitamin C，Vc）/抗壞血酸含量測試盒（A009-1-1，南京建成生物工程研究所）；硝態(tài)氮含量測定使用植物硝態(tài)氮含量檢測試劑盒（BC1505，北京索萊寶科技有限公司）。

1.6 二、四倍體菜心LCX017光合特性分析

參考楊航等［22］的方法，在晴朗的白天，采用LI-6800 便攜式光合作用測量系統（LI-COR，美國）進行測定，使用CO2鋼瓶為反應提供CO2，設置CO2濃度為400 μmol·mol-1，測定其在0、10、30、50、70、100、150、200、400、600、800、1 200、1 600、1 800、2 000 μmol·m-2·s-1光照強度下單位面積葉片的凈光合速率（net photosynthetic rate，Pn）、蒸騰速率（transpiration rate，Tr）、氣孔導度（stomatal conductance，Gs）、胞間CO2濃度（intercellular CO2concentration，Ci），隨機在二、四倍體中各選取3 株植株，取位置、大小近似的葉片進行測定。參考王雪等［23］使用的非直角雙曲線模型公式進行光合曲線擬合，根據擬合結果求得光飽和點（light saturation point，LSP）、光補償點（light compensation point，LCP）、最大凈光合速率（maximun net photosynthetic rate，Pmax）、暗呼吸速率（dark respiration rate，Rday）、表觀量子效率（apparent quantum yield of photosynthesis，AQY）等光合指標。

1.7 數據分析

利用Excel 2021 軟件對所得數據進行整理，采用SPSS Statistics 25 軟件對試驗數據分析并進行獨立樣本t檢驗，分析樣本數據的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 二、四倍體菜心LCX017倍性鑒定

2.1.1 形態(tài)學鑒定 由圖1可見，與二倍體相比，同源四倍體植株株型以及開展度變大（圖1-A）；幼苗較小，葉片數較少，根系相對短?。▓D1-B）；葉片葉長縮小，葉寬增大，葉片長寬比變小，葉片形狀近圓形（圖1-C）；四倍體花器官整體變大，萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊均明顯變大（圖1-D、E）；種子直徑略微增大，種莢由細長變至粗短（圖1-F、G）；菜薹變得更加粗壯，直徑明顯變大（圖1-H、I）。

圖1 二、四倍體菜心LCX017形態(tài)學比較Fig.1 Morphological comparison of diploid and tetraploid plants of Chinese flowering cabbage LCX017

2.1.2 解剖學鑒定 在解剖學方面，通過對二、四倍體植株葉片氣孔進行上鏡觀察發(fā)現，四倍體植株葉片氣孔孔徑更大，保衛(wèi)細胞長度、寬度明顯增大，而單位面積上的氣孔密度相比二倍體植株有所下降（圖2-A、B）；對二、四倍體盛花期的花粉進行上鏡觀察，發(fā)現二倍體植株花粉粒呈現出較為規(guī)則的長橢圓形（圖2-C），四倍體植株花粉粒相較于二倍體略大（圖2-D），且呈現出棒狀、橄欖形等多種不規(guī)則的形狀。

2.1.3 細胞學鑒定 將經過形態(tài)學鑒定的疑似四倍體植株蕾期單株套袋自交授粉，選取部分收到的種子進行催芽處理，并制成根尖染色體切片，在顯微鏡下觀察根尖染色體數目。由圖3 可知，對照組的二倍體根尖染色體數目為2n=2x=20，而同源四倍體的染色體數目為2n=2x=40。

2.1.4 流式細胞儀鑒定 為了進一步確定同源四倍體植株，利用流式細胞儀測定二、四倍體植株的DNA含量，得到DNA含量的分布曲線圖。由圖4可見，縱坐標為細胞數目，橫坐標為DNA 含量熒光強度，圖中第一個峰值代表G1期的DNA 相對含量，而第二個峰值則代表G2期的DNA 含量。由圖4 可知，二倍體G1期的相對熒光強度約為25，而同源四倍體的G1期的相對熒光強度則為50左右，大約為二倍體植株的2倍，進一步證實了該植株為四倍體植株。

圖4 二倍體（左）、四倍體（右）菜心LCX017流式細胞儀分析結果Fig.4 Identification results of diploid（left）and tetraploid（right）Chinese flowering cabbage LCX017 by flow cytometry

2.2 二、四倍體菜心LCX017農藝性狀比較

由表1 可知，四倍體植株在株高、十葉厚、葉寬、葉柄寬、葉柄厚、薹粗、薹重方面相比二倍體分別增加了68.00%、17.27%、37.15%、50.77%、25.47%、29.13%、30.75%，差異極顯著；葉片數相較于二倍體則增加了8.94%，差異顯著；葉片開展度與葉柄長比二倍體分別增加了9.15%與5.91%，差異不顯著；葉長則降低了3.14%，差異不顯著。

2.3 二、四倍體菜心LCX017營養(yǎng)品質比較

由表2 可見，與二倍體相比，同源四倍體的纖維素含量、有機酸含量以及葉綠素含量分別提高了120.00%、169.37%、24.85%，差異極顯著；四倍體的可溶性糖含量提高了19.40%，差異顯著；而可溶性蛋白含量下降了8.82%，差異不顯著；硝態(tài)氮含量相比二倍體則下降了22.92%，且差異顯著。

表2 二、四倍體植株主要營養(yǎng)品質比較Table 2 Comparison of content of nutritional substance of diploid and tetraploid plants

2.4 二、四倍體菜心LCX017光合特性分析

由圖5可知，隨著光照強度的增加，二、四倍體的凈光合速率均呈現上升趨勢，光照強度低于150 μmol·m-2·s-1時，二、四倍體的凈光合速率相差并不大；當光強大于150 μmol·m-2·s-1時，四倍體凈光合速率增加趨勢明顯高于二倍體，二者差距逐漸增大；當光照強度達到1 600 μmol·m-2·s-1時，二者基本達到飽和光強，其凈光合速率不再隨光照強度的增加而增加，達到最大凈光合速率，但四倍體的最大凈光合速率遠高于二倍體。隨著光照強度的增加，四倍體的氣孔導度明顯增大，而二倍體氣孔導度的增加則較為平緩，且四倍體的氣孔導度明顯大于二倍體。二、四倍體的胞間CO2濃度均隨著光照強度的增加呈現下降趨勢，整體表現為，四倍體的胞間CO2濃度高于二倍體；在光照強度大于1 600 μmol·m-2·s-1時，二者的胞間CO2濃度值不再降低，趨于平緩。蒸騰速率則隨著光照強度的增加而逐漸增加，四倍體蒸騰速率明顯高于二倍體，這與氣孔導度的變化趨勢相似。

圖5 二、四倍體光合特性比較分析Fig.5 Comparison of the photosynthetic characteristics of diploid and tetraploid plants

由表3 可知，相較于二倍體，四倍體的最大凈光合速率（Pmax）、光飽和點（LSP）增加了3.91%、42.58%，差異均不顯著；表觀量子效率（AQY）、暗呼吸速率（Rday）、光補償點（LCP）則分別降低了27.27%、41.73%、13.97%，差異均不顯著。

表3 二、四倍體植株的光響應曲線參數比較Table 3 Comparison of the parameters of response curves of diploid and tetraploid plants

3 討論

多倍體是推動植物進化的重要因素之一，也是物種形成的途徑之一［24］。植物多倍體通常具有營養(yǎng)生長優(yōu)勢和更強的環(huán)境適應性，因而多倍體育種是植物遺傳改良的重要途徑［25］。同時相較于傳統雜交育種，多倍體育種目標較為明確，可以較快地創(chuàng)新種質資源，豐富育種材料［26］，因此多倍體育種技術受到廣泛關注與深入研究。趙建棟等［27］對不同生長階段的甜蕎采用不同濃度的秋水仙素處理，得出采用0.2%濃度的秋水仙素處理幼苗時誘導效果最佳，并得到了同源四倍體甜蕎；張振超等［28］利用二倍體不結球白菜誘導得到同源四倍體不結球白菜，并對秋水仙素誘導濃度及處理次數進行探究，發(fā)現以0.2%濃度的秋水仙素處理四次誘導效果最好。本研究以二倍體菜心LCX017為材料，采用0.2%濃度的秋水仙素處理，經過形態(tài)學鑒定、解剖學鑒定、細胞學鑒定以及應用流式細胞儀鑒定，成功誘導得到同源四倍體的菜心LCX017。四倍體菜心LCX017 的創(chuàng)制，豐富了不結球白菜的種質資源，為不結球白菜遺傳特性研究以及育種工作提供了重要材料。

本研究發(fā)現，農藝性狀方面，四倍體相較于二倍體，在十葉厚、葉寬、葉柄寬、葉柄厚、菜薹直徑等方面都具有增加趨勢，這與李孟杰等［29］的研究結果一致；幼苗期時四倍體相比二倍體幼苗較小，根系較短，可能是四倍體種子發(fā)芽較晚，幼苗期生長發(fā)育較慢的緣故；在營養(yǎng)品質方面，四倍體在可溶性糖含量、纖維素含量、有機酸含量、葉綠素含量方面分別增加19.40%、120.00%、169.37%、24.85%，與張咪等［30］得到的部分營養(yǎng)物質含量上升的結果基本一致；而可溶性蛋白含量、硝態(tài)氮含量則分別下降了8.82%、22.92%，這與王新雅等［31］的研究中部分營養(yǎng)物質含量下降的結果一致，這些結果可能是由于四倍體植株在誘變過程中，隨著染色體組的加倍，部分生理活動也隨之發(fā)生了變化，加之秋水仙素的毒性影響，最終導致植株的營養(yǎng)物質含量出現不同的變化趨勢，同時說明四倍體的營養(yǎng)物質含量并非一定高于二倍體。

植物的光合作用直接關系到作物的最終產量，是植物生命活動的基礎，光合作用的效率，對植物的生長發(fā)育具有重要影響［32-33］。不同倍性作物的光合特性通常會出現差異，如鐘程等［34］通過比較不同倍性白菜光合特性，發(fā)現白菜四倍體的光合作用強于二倍體；王峰等［35］發(fā)現四倍體青檀在光能轉化效率和弱光下生長等能力優(yōu)于二倍體青檀。本研究通過對二、四倍體植株的光響應曲線進行分析，根據非直角雙曲線模型公式進行光合曲線擬合，并根據擬合曲線計算出相應參數。通過對二、四倍體光合特性的分析，四倍體植株的Pn、Tr、Gs、Ci均高于二倍體，這與在白榆［36］、草莓［37］多倍體中的研究結果基本一致。LSP、LCP、AQY及Rday是體現植物光合作用能力的重要指標，能夠反映植物葉片對弱光和強光的適應能力［38-39］。通過對二、四倍體植株的光合特性進行對比發(fā)現，四倍體的Pmax、LSP 高于二倍體植株，說明四倍體在強光下相比二倍體能夠更加高效地利用光能，有利于更加高效地積累有機物；而四倍體的AQY、LCP 和Rday低于二倍體植株，說明四倍體在弱光條件下的適應能力強于二倍體，能夠更充分地利用較少的光能完成最基本的生理活動需求，這也符合四倍體在形態(tài)學上觀察到的“巨大化”特征。綜上，同源四倍體菜心LCX017 相比二倍體，在強光和弱光下都具有較強的光合能力，王婷婷等［40］在四倍體馬鈴薯中也得到了相似的結論。

在誘導過程中，由于秋水仙素的誘導效應與毒性作用，會引起四倍體植株遺傳機理的紊亂，導致其第一代植株育性較低，因此仍然需要2～3代的自交培育，以獲得能夠穩(wěn)定遺傳的同源四倍體植株，從而為后續(xù)育種工作奠定基礎。

4 結論

本研究利用秋水仙素誘導二倍體菜心LCX017，對得到的同源四倍體植株在形態(tài)外觀、營養(yǎng)物質、光合特性等方面進行分析，發(fā)現同源四倍體在形態(tài)外觀上總體呈變大趨勢，其菜薹重量與直徑等顯著大于二倍體植株；在可溶性糖、硝態(tài)氮、有機酸等營養(yǎng)物質含量上相較于二倍體植株具有明顯的優(yōu)勢；同種條件下，菜心LCX017 的四倍體植株對光環(huán)境和光照的適應力均強于二倍體植株，在強光和弱光環(huán)境下的光合能力均高于二倍體植株，但是其內在作用機理等仍有待進一步研究。