基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探討雞血藤治療糖尿病腎病的作用機(jī)制研究

王蓉,林栩▲,吳昱升,黃慕源,徐璐瑤,張潔

(1.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科,廣西百色 533000;2.廣西免疫相關(guān)性疾病醫(yī)學(xué)科研基礎(chǔ)保障重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西百色 533000)

糖尿病腎病(diabetic kidney disease,DKD)是一種慢性腎臟疾病,發(fā)生在糖尿病(diabetic mellitus,DM)患者身上,持續(xù)性蛋白尿和腎功能不全是DKD的主要臨床特征[1-2]。DKD已被公認(rèn)為糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥和終末期腎病的主要致病因素,給人類帶來(lái)了嚴(yán)重的健康問(wèn)題和巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。在DKD的治療中,傳統(tǒng)的治療方法,如減肥和控制血糖,在許多臨床環(huán)境中可能無(wú)法提供令人滿意的結(jié)果。然而,應(yīng)該注意的是,中藥具有多種功能,在臨床上有可能作為治療DKD的主要或替代療法。 對(duì)中藥中生物活性物質(zhì)的鑒定及其腎臟保護(hù)作用的分子機(jī)制的研究正變得越來(lái)越活躍。因此,從中藥資源中尋找有效藥物具有重要意義。

糖尿病腎病是一種慢性疾病,需要活血通絡(luò)、抗氧化來(lái)減輕臨床癥狀,預(yù)防并發(fā)癥,延緩疾病的進(jìn)展。雞血藤為豆科植物,性溫,味苦,是活血化瘀藥物,具有改善造血系統(tǒng)、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抵抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫等生物活性,而且含有多種多酚類,具有較強(qiáng)的自由基清除活性和抗氧化作用,是一種很有前途的活性氧相關(guān)病理治療藥物[4-5]。近年來(lái),雞血藤的多種藥理作用已被廣泛用于臨床治療。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種在系統(tǒng)水平上預(yù)測(cè)化合物有效成分和疾病靶點(diǎn)的組成,建立藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病等多層次網(wǎng)絡(luò)的方法。此外,分子對(duì)接是一種研究蛋白質(zhì)受體與小分子配體之間相互作用和識(shí)別的理論方法,能夠預(yù)測(cè)結(jié)合模式和親和力強(qiáng)度[6]。總之,網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接可以互補(bǔ)地用于中醫(yī)藥研究,為活性化合物篩選和機(jī)理探索提供新的見(jiàn)解,已成為揭示中藥與疾病之間復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系的有效工具。本研究通過(guò)數(shù)據(jù)挖掘和分析,應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接,篩選和預(yù)測(cè)DKD治療中雞血藤活性成分的潛在靶分子和信號(hào)通路。研究結(jié)果從分子層面闡釋治療DKD的機(jī)制,為雞血藤進(jìn)一步研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)及網(wǎng)址數(shù)據(jù)庫(kù)名稱及網(wǎng)址見(jiàn)表1。

表1 數(shù)據(jù)庫(kù)及網(wǎng)址

1.2 收集和篩選雞血藤活性成分及作用靶點(diǎn)運(yùn)用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索雞血藤的所有化合物成分,篩選出口服生物利用度(oralbioavailability,OB)≥30%,類藥物(drug like,DL)≥0.18的雞血藤中的活性化合物[6]。通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)獲取雞血藤活性成分對(duì)應(yīng)的潛在作用靶點(diǎn)信息。

1.3 DKD相關(guān)靶點(diǎn)的篩選以 “diabetic nephropathy ”“diabetic kidney disease” 為關(guān)鍵詞,搜索GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD和DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)以獲得DKD全部的靶點(diǎn)信息。

1.4 活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建為明確DKD相關(guān)靶點(diǎn)與雞血藤活性成分之間的相互作用,使用Venny 2.1.0將疾病靶點(diǎn)和藥物靶點(diǎn)交叉,以確定共同的靶點(diǎn),并創(chuàng)建一個(gè)韋恩圖。該圖被導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0以構(gòu)建“雞血藤-共有靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。

1.5 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將獲取的雞血藤治療DKD的潛在作用靶點(diǎn)輸入到STRING 數(shù)據(jù)平臺(tái),選項(xiàng)設(shè)為“Multiple proteins”,選擇置信度≥0.4,設(shè)置隱藏游離點(diǎn),構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)。使用CytoNCA工具來(lái)分析網(wǎng)絡(luò)中心性(NC)、度中心性(DC)、接近中心性(CC)、局部邊連通性(LAC)、介度中心性(BC)及特征向量中心性(EC)等參數(shù),將所有上述參數(shù)高于各自中位數(shù)的節(jié)點(diǎn)從關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)中過(guò)濾出來(lái)。剩下的節(jié)點(diǎn)被確定為DKD治療的關(guān)鍵靶標(biāo)。

1.6 GO功能分析和KEGG信號(hào)通路富集分析按P值及校正后的P值(q值)均<0.001為基準(zhǔn)進(jìn)行GO功能與KEGG通路富集分析,從而得出雞血藤治療DKD參與的生物學(xué)過(guò)程和作用。

1.7 分子對(duì)接①?gòu)腜ubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)下載活性成分的化合物作為配體分子。②從RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得蛋白質(zhì)受體3D結(jié)構(gòu)作為受體分子。③使用AutoDockvina軟件進(jìn)行小分子配體和蛋白質(zhì)受體的分子對(duì)接[6]。使用Pymol軟件對(duì)化合物和蛋白質(zhì)的對(duì)接結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 篩選關(guān)鍵活性化合物通過(guò)對(duì)幾個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的搜索和篩選,收集了雞血藤的24個(gè)關(guān)鍵活性化合物,結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 雞血藤活性成分的基本信息

2.2 DKD靶點(diǎn)對(duì)GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD和DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)的搜索分別發(fā)現(xiàn)了15 640、485、220、26和102個(gè)DKD相關(guān)靶點(diǎn),剔除重復(fù)后得到12 818個(gè)DKD相關(guān)靶點(diǎn),結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 數(shù)據(jù)庫(kù)收集DKD相關(guān)靶點(diǎn)

2.3 成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將雞血藤活性成分靶點(diǎn)與DKD靶點(diǎn)輸入到Venny 2.1.0軟件繪制韋恩圖,兩者取交集后獲得疾病-藥物成分共有靶點(diǎn)48個(gè),見(jiàn)圖2A。Cytoscape 3.8.0也被用來(lái)將活性成分與靶點(diǎn)結(jié)合,構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)(圖2B),表明雞血藤通過(guò)多成分-多靶點(diǎn)整體發(fā)揮治療DKD作用。

注:A為靶點(diǎn)-疾病靶點(diǎn)韋恩圖;B為“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

2.4 關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析將Venny 2.1.0 軟件篩選出的48個(gè)共同靶點(diǎn)輸入在線STRING 網(wǎng)站,物種設(shè)置為“人”,構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)(圖3),PPI網(wǎng)絡(luò)被導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0,使用CyoNCA插件進(jìn)行重建和2次篩查后,共獲得4個(gè)核心靶點(diǎn)基因,分別為熱休克蛋白90 Alpha 家族A級(jí)成員1(HSP90AA1)、MYC 原癌基因(MYC)、腫瘤蛋白p53(TP53)、信號(hào)傳感器和轉(zhuǎn)錄激活劑3(STAT3),拓?fù)鋮?shù)BC、CC、DC、EC、LAC、NC皆大于各自中位數(shù)0.894,0.933,13,0.264,10.5,12.211。表明這4個(gè)關(guān)鍵基因以已知、預(yù)測(cè)或其他相互作用而相互影響,同時(shí)也是雞血藤治療DKD的核心靶點(diǎn)。結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖3 蛋白之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵靶點(diǎn)基因的篩選流程

2.5 GO功能富集和KEGG信號(hào)通路富集分析GO功能富集分析共檢測(cè)出498個(gè)條目:440個(gè)生物過(guò)程(BP),25個(gè)細(xì)胞組成(CC)和33個(gè)分子功能(MF)。見(jiàn)圖5。KEGG通路富集分析共得到61個(gè)條目,包括PI3K-Akt信號(hào)通路和p53信號(hào)通路等。見(jiàn)圖6。

圖5 GO功能富集分析 圖6 KEGG 通路富集分析

2.6 分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證活性成分與核心基因的相互作用分子對(duì)接分析了4個(gè)核心靶點(diǎn)基因和從活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中獲得的3種化合物,結(jié)果見(jiàn)圖7。蘆薈大黃素與TP53結(jié)合能為-7.5,木犀草素與TP53的結(jié)合能為-7.9,甘草查爾酮a與HSP90AA1的結(jié)合能為-7.9,木犀草素與HSP90AA1的結(jié)合能為-8.5,蘆薈大黃素與MYC的結(jié)合能為-5.5,甘草查爾酮a與STAT3的結(jié)合能為-7.3,蘆薈大黃素與HSP90AA1的結(jié)合能為-8.8,蘆薈大黃素與STAT3的結(jié)合能為-6.9,木犀草素與MYC的結(jié)合能為-6.0,木犀草素與STAT3的結(jié)合能為-7.3,甘草查爾酮a與TP53的結(jié)合能為-9.2,甘草查爾酮a與MYC的結(jié)合能為-5.7。見(jiàn)表3。結(jié)果顯示,所有的組合都表現(xiàn)出良好的結(jié)合活性,其結(jié)合能低于-5 kcal/mol。一些組合還顯示出很強(qiáng)的結(jié)合活性,結(jié)合能低于-7 kcal/mol。這些結(jié)果表明,雞血藤的主要活性成分與DKD的主要靶基因之間有很強(qiáng)的相關(guān)性,表明這些有效活性成分和主要靶點(diǎn)基因可能是雞血藤治療DKD的主要活性靶點(diǎn)。

表3 雞血藤活性化合物與核心靶點(diǎn)的對(duì)接結(jié)果

3 討 論

DKD是終末期腎病(ESKD)的最重要病因,其開(kāi)始是微量白蛋白尿,隨后是大量白蛋白尿,然后腎功能逐漸下降,并通過(guò)特征性病理表現(xiàn)進(jìn)行病理學(xué)診斷,例如系膜底物增加、結(jié)節(jié)性病變和腎小管間質(zhì)纖維化[7]。DKD的發(fā)病機(jī)制包括腎小球高血壓、腎血流動(dòng)力學(xué)改變、缺血和缺氧、氧化應(yīng)激和腎素-醛固酮系統(tǒng)的上調(diào)[8]。然而,該疾病的全部發(fā)病機(jī)制仍有待了解,治療靶點(diǎn)尚未確定。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步探索了雞血藤治療DKD的分子機(jī)制。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龊Y選出雞血藤作用于心血管疾病的前4個(gè)基因?yàn)殛P(guān)鍵基因,即 HSP90AA1、 TP53、STAT3、MYC。這些基因可能在DKD的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。HSP90AA1是一種普遍表達(dá)的分子伴侶,參與促進(jìn)癌細(xì)胞存活的突變和過(guò)表達(dá)信號(hào)蛋白的穩(wěn)定性[9],它在多種癌癥中上調(diào),HSP90AA1 水平升高提示預(yù)后不良,被認(rèn)為是惡性轉(zhuǎn)化和進(jìn)展的必要條件。另有研究表明HSP90AA1是自噬的重要調(diào)節(jié)劑,可通過(guò)PI3K/Akt/mTOR途徑和JNK/P38途徑促進(jìn)自噬并抑制細(xì)胞凋亡[10]。TP53是一種關(guān)鍵的腫瘤抑制因子,在癌癥的發(fā)生發(fā)展和治療中起著多方面作用。TP53蛋白的活化可導(dǎo)致多種細(xì)胞反應(yīng),包括細(xì)胞凋亡、細(xì)胞衰老、細(xì)胞周期停滯、DNA修復(fù)、代謝適應(yīng)。TP53介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)根據(jù)應(yīng)激刺激的類型和細(xì)胞的類型而變化,例如,輕微的DNA損傷可能導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯并激活DNA修復(fù)機(jī)制,而較強(qiáng)的TP53激活信號(hào)會(huì)誘導(dǎo)衰老或凋亡[11]。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑STAT3是STAT(信號(hào)傳感器和轉(zhuǎn)錄激活劑)家族的成員,參與許多生物學(xué)過(guò)程,包括細(xì)胞增殖、存活、分化和血管生成[12],在正常細(xì)胞中,STAT3的瞬時(shí)激活(主要通過(guò)磷酸化)將轉(zhuǎn)錄信號(hào)從質(zhì)膜上的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子受體傳遞到細(xì)胞核[13]。核STAT3通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控幾種自噬相關(guān)基因(如BCL2家族成員和具有自噬調(diào)節(jié)劑靶標(biāo)的微RNA)來(lái)微調(diào)自噬,細(xì)胞質(zhì)STAT3通過(guò)隔離EIF2AK2以及通過(guò)與其他自噬相關(guān)的信號(hào)分子(如FOXO1和FOXO3)相互作用來(lái)抑制自噬[14]。此外,STAT3介導(dǎo)由細(xì)胞內(nèi)蛋白如活化的Ras或酪氨酸激酶癌蛋白引發(fā)的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)[15],在抑制關(guān)鍵免疫激活調(diào)節(jié)因子的表達(dá)和促進(jìn)免疫抑制因子的產(chǎn)生方面起重要作用。MYC是一種多效性轉(zhuǎn)錄因子,可調(diào)節(jié)關(guān)鍵細(xì)胞過(guò)程,包括增殖、分化、細(xì)胞周期、代謝和凋亡[16]。MYC是一個(gè)編碼核磷蛋白的原癌基因,參與細(xì)胞周期的進(jìn)展、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞轉(zhuǎn)化。MYC癌基因家族包括C-MYC、N-MYC 和L-MYC,它們?cè)诎l(fā)育過(guò)程中顯示出不同的表達(dá)時(shí)機(jī)和組織特異性,C-MYC在組織發(fā)育和各種腫瘤中普遍表達(dá),N-MYC在神經(jīng)組織和早期造血發(fā)育中表達(dá),L-MYC在肺部表達(dá),特別是在小細(xì)胞肺癌中過(guò)度表達(dá),目前被認(rèn)為具有較低的轉(zhuǎn)化活性[17-19]。

本研究中,GO功能富集分析共得到498個(gè)條目,分子功能主要涉及泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、G 蛋白偶聯(lián)胺受體活性等;生物學(xué)過(guò)程主要涉及對(duì)膜電位調(diào)節(jié)、細(xì)胞對(duì)肽的反應(yīng)、腎上腺素受體信號(hào)通路等;細(xì)胞組成主要涉及膜筏、膜微區(qū)、蛋白激酶復(fù)合物等。KEGG通路富集分析共得到61個(gè)條目,包括PI3K-Akt和p53等信號(hào)通路。分子對(duì)接方法的驗(yàn)證表明,雞血藤的主要活性成分與DKD的主要靶基因之間有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性。然而,目前沒(méi)有關(guān)于核心靶點(diǎn)與DKD之間相關(guān)性的報(bào)道,本研究中探討的雞血藤在DKD治療中的潛在靶點(diǎn)基因和信號(hào)通路還需要通過(guò)適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述,雞血藤中的活性成分可以作用于HSP90AA1、TP53、STAT3和MYC等靶基因,并調(diào)節(jié)PI3K-Akt和p53等信號(hào)通路,發(fā)揮對(duì)DKD的治療作用。本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的角度預(yù)測(cè)了雞血藤治療DKD的作用機(jī)制,表明雞血藤在治療DKD中表現(xiàn)出多成分、多靶點(diǎn)和多途徑的特性,為進(jìn)一步研究其分子機(jī)制提供了基礎(chǔ)。